Методи фарбування бактеріальних спор і капсул

Методи фарбування бактеріальних спор і капсул

Міністерство освіти і науки України

Одеський національний політехнічний університет

Хіміко-технологічний факультет

Кафедра органічних і фармацевтичних технологій

РГР з курсу «Хімічна мікробіологія»

за темою: «Методи фарбування бактеріальних спор і капсул»

Виконав студент гр. ХФ-122

Дідик Д.О.

Керівник: Декіна С.С.

Одеса 2014

Зміст

Вступ

.        Капсула і її характеристика

. Фарбування бактеріальних капсул

а) фарбування по методу Романовського - Гімза

б)фарбування по методу Мухіна

в) фарбування по методу Буррі-Гінса

г) фарбування розчином сафроніна ( метод Ольта

в) фарбування методом Ребігера

. Спори і їх характеристика

а) фарбування по методу Пєшкова

б) фарбування по методу Ожешко

в) фарбування по методу Міллера

г) Забарвлення малахітовим зеленим Шеффера-Фултона

д) фарбування по методу Бітгера

Висновки

Використана література

1.      Капсула і її характеристика

У багатьох бактерій із зовнішнього боку клітинної стінки розташований дифузний гомогенний слизовий шар різної товщини. Цей шар можливо виявити при певних способах фарбування або відповідному освітленні.

Капсулою називають шар, який зберігає тісний зв'язок з клітинною стінкою і служить зовнішнім покривом клітини. Товщина капсул у бактерій різна: від 0,1 мікрометрів до 10 мкм. Капсулу величиною менше 0,2 мкм часто називають мікрокапсули. Поверхневі структури типу капсул описані у пневмококів, збудників сибірки, гонореї, групи капсульних бактерій.

У багатьох видів бактерій капсула з'являється лише при визначених умовах, часто несприятливих. Збудники сибірської виразки, кашлюку, гонореї, пневмококи утворюють капсулу, потрапляючи в організм людини або тварини. У цьому випадку капсула виконує захисну роль, оберігаючи мікроб від дії антитіл, фагоцитів та інших захисних факторів організму.

Група капсульних бактерій зберігає капсулу постійно: і в організмі людини, і при її культивуванні на живильних середовищах. Хімічний склад капсул залежить від виду бактерій. Основними компонентами капсули є вода (до 98 %) і полісахариди. Захисні функції капсули різноманітні. Крім запобігання мікроба від дії захисних факторів макроорганізму, капсула захищає мікроб від припливу в клітку великої кількості рідини (осмотичний бар'єр), а також від висихання при несприятливих умовах середовища[1].

2.      Фарбування бактеріальних капсул

Капсули при звичайних методах фарбування залишаються безбарвними. Це дозволяє застосовувати прості методи фарбування для виявлення капсул мікроорганізмів в мазках з органів і тканинної рідини. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім тканини і клітини бактерій фарбуються у блакитний колір, а навколо бактерій зберігається безбарвна зона - капсула

а) Фарбування по методу Романовського-Гімза

F. tularensis

Фіксований в етиловому спирті мазок, кладуть у чашку Петрі мазком донизу на підставки з склянки і соломки або сірників і наливають робочий розчин фарби Романовського-Гімза (15-20 крапель на 10 мл води). Через 15-20 хв препарат промивають водою і висушують на повітрі. Бактерії забарвлюються в темно-синій колір, капсули - в рожевий. Використовується світловий мікроскоп[2].

б) Фарбування по методу Мухіна

Фіксований препарат фарбують протягом 6-7 хв. 1%-м розчином метиленової синьки з легким підігрівом над полум'ям горілки (до появи пару). Легко промивають водою, швидко просушують фільтрувальним папером і мікроскопують. Капсула - рожева, бактеріальна клітина - синя.

Мікропрепарат з культури клебсиєлл для виявлення у них капсули можна забарвити за методом Буррі - Гінса:

. На чисте предметне скло наноситься невелика крапля чорної туші і крапля суспензії добової агарової культури капсульних бактерій. Суміш обережно перемішується петлею, після чого іншим предметним склом робиться мазок, подібно мазку крові.

. Після підсушування на повітрі і фіксації в полум'ї спиртівки препарат дофарбовували протягом 2 - 3 хвилин карболовым фуксином Ціля, розведеним дистильованою водою 1:1.

3. По закінченні препарат обережно промивається струменем холодної води, висушується і мікроскопують. На темному тушевому тлі будуть видимі пофарбовані мікробні клітини оточені безбарвною капсулою. При відсутності капсули, до клітки пофарбованої фуксином, чорний фон примикає впритул.

г) Фарбування розчином сафраніну (метод Ольта)

Фарбування розчином сафраніну (метод Ольта). Фіксований мазок фарбують 2%-м розчином сафраніну з підігрівом до утворення пари, фарбують 3-4 хв. Промивають водою, швидко просушують фільтрувальним папером, мікроскопують. Капсула - жовта, мікробна клітина - темно-червона. Розчин сафраніну готують перед використанням.

д) Фарбування по методу Ребігера

Мазки фарбують і фіксують одночасно. Готують розчин: 15-20 г генціанвіолету розчиняють у 100 см³ 40%-го розчину формаліну. Розчин витримують 8-10 годин при температурі 20 ˚С і фільтрують. Фарбують нефіксовані мазки протягом 15-20 сек., швидко промивають водою і висушують фільтрувальним папером. Капсули фіолетово-рожеві, бактерії темнофіолетові[3].

3.Спори та їх характеристика

Багато видів бактерій володіють здатністю спорооутворення, яка полягає в тому, що при настанні умов, несприятливих для життя, клітина змінює свою структуру, об'єм і форму, часто також втрачає воду.

Найвідомішим та найбільш пристосованим до екстремальних умов типом бактеріальних спор є ендоспори, що формуются всередині клітини деякими представниками типу Firmicutes, наприклад, грам-позитивними Bacillus, Anaerobacter, Heliobacterium та Clostridium. Майже в усіх випадках формується одна ендоспора, тобто це не є процесом розмноження, хоча Anaerobacter може формувати до семи ендоспор на клітину. Ендоспори мають центральне ядро, складене з цитоплазми <#"868948.files/image004.gif">

термінальне - спору розташовується на кінці палички.

. На висушений нефіксований мазок наливають 0,5% розчин хлористоводневої кислоти і підігрівають 1-2 хв над полум'ям спиртівки до закипання.

. Остиглий препарат промивають водою, висушують і фіксують над полум'ям спиртівки.

. Потім мазок наносять розчин фуксину Циля і нагрівають над полум'ям спиртівки до відходження парів.

. Після того як препарат охолоне, знебарвлюють його 5% розчином сірчаної кислоти, промивають водою і дофарбовують метиленовим синім протягом 3-5 хв, потім промивають водою і підсушують. Спори, пофарбовані фуксином мають червоний колір, тіло мікробної клітини - синій колір.

в) Фарбування по методу Міллера

. Фіксовані мазки поміщають на 2 хв. в хлороформ.

. Переносять в 5% водний розчин хромової кислоти на 2 - 10 хв.

.Диференціюють в 5% сірчаної кислоті 5 с.

. Добре промивають в проточній воді і підфарбовують водним розчином метиленового синього 3 хв.

. Промивають в проточній воді, сушать і вивчають при імерсії.

Результат: спори забарвлюються в червоний колір, бактерії - в синій.

г) Забарвлення малахітовим зеленим Шеффера-Фултона

. Мазки, фіксовані над вогнем, забарвлюють 5% водним розчином малахітового зеленого 5-10 хв.

2. Промивають в проточній воді.

. Дофарбовуючи 1% водним розчином сафраніну 30 с.

. Промивають водою, сушать і вивчають при масляній імерсії.

Результат: спори забарвлюються в зелений колір, бактерії - в червоний.

д) Фарбування по методу Бітгера

Нефіксований мазок обробляють 10% формаліном 10 хв, промивають проточною водою і висушують. Забарвлюють 3 хв аміачним метиленовим синім (20 мл насиченого спиртового розчину метиленового синього + 3 мл 98% розчину аміаку + 80 мл дистильованої води), нагріваючи скло над вогнем до закіпання барвника. Промивають проточною водою, дофарбовують 0,5% розчином сафраніну 3-5 хв, промивають водою, висушують і вивчають при масляній імерсії.

Результат: бактерії червоні, суперечки сині.[5]

Використана література

1.<https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%BA%D1%80%D0%B0%D1%88%D0%B8%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%B5_%D0%BF%D0%BE_%D0%A0%D0%BE%D0%BC%D0%B0%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BC%D1%83_%E2%80%94_%D0%93%D0%B8%D0%BC%D0%B7%D0%B5> -Безруков А. В. Окраска по Романовскому: к вопросу о приоритете / К 120-й годовщине открытия эффекта Романовского.  12 с. <http://www.romanowsky.ru/ftpgetfile.php?id=41%7C> [2]

2. Балаклiець Н.I., Циганенко А.Я., Мiнухiн В.В. - Загальна мiкробiологiя. Харкiв, 2002. [4]

3. Барыкина Р. П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с. - 2000 экз. - ISBN 5-211-06103-9 <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%BB%D1%83%D0%B6%D0%B5%D0%B1%D0%BD%D0%B0%D1%8F:%D0%98%D1%81%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D0%B8%D0%BA%D0%B8_%D0%BA%D0%BD%D0%B8%D0%B3/5211061039>. - УДК <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A3%D0%94%D0%9A>58:57.08 [3]

. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг. [5]

5.Мікробіологія. Бактерії. http://microbiology.ucoz.org/index/bakterii/0-11 [1]