Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра биохимии и физиологии

ДОПУСТИТЬ К ЗАЩИТЕ В ГАК

Заведующий кафедрой - канд. биол.

наук, доцент ________ В. В. Хаблюк

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА

Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Работу выполнил Г. А. Набережных

Факультет биологический

Направление 06.03.01 Биология

Научный руководитель,

д-р биол. наук,

проф Н. В. Ковалюк

Нормоконтролёр,

доцент, канд. биол.

наук Н. Н. Улитина

Краснодар 2015

РЕФЕРАТ

Данная работа выполнена на 47 листах машинописного текста. Содержит 13 таблиц и шесть рисунков. Для выполнения данного исследования было использовано 35 литературных источников.

молочная продуктивность, ГОЛШТИНСКИЙ СКОТ, генечские маркеры, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ГЕН BoLA DRB3, ГЕН КАППА-КАЗЕИН, аЛЛели, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ, УСТОЙЧИВЫЕ, НЕЙТРАЛЬНЫЕ

Цель работы - выявить генотип по локусам BoLA DRB3 и каппа - казеина оптимальный в отношении продуктивных показателей и резистентности к лейкозу у коров черно-пестрой голштино-фризской породы.

Работа проводилась на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 17.06.14 г. по 27.07.14 г. и с 02.07.14г. по 12.10.14 г.

Объектом исследования были коровы голштинской породы. Материалом для исследований служила кровь коров.

В институте выполнен ПЦР-анализ образцов на наличие полиморфизма в генах BoLA DRB 3 и каппа-казеин. По результатам анализа определена частота встречаемости генотипов и установлена связь с ними продуктивных качеств.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

. Аналитический обзор

.1 Современное состояние молочной продуктивности крупного рогатого скота

.2 Краткая характеристика голштинских коров

.3 Аналитический обзор генетических маркеров молочной продуктивности

.3.1 Структура и полиморфизм гена BoLA DRB3

.3.2 Структура и полиморфизм гена каппа-казеина

. Материал и методы исследования

.1 Материал исследования

.2 Выделение ДНК

.3 Проведение полимеразной цепной реакции

.4 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции

.5 Электрофорез

. Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

.1 Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA-DRB3 в исследуемом стаде

.2 Качественные и количественные показатели молочной продуктивности чёрно-пёстрых голштинских коров и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3

.3 Частота встречаемости генотипов по гену каппа-казеина и взаимосвязь генотипа с показателями молочной продуктивности у чёрно-пёстрых голштинских коров

.4 Повышение частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа

Заключение

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

В результате экономических преобразований в сельском хозяйстве России, за последние 20 лет, произошли радикальные перемены, носящие в основном негативный характер. Во всех отраслях животноводства, в том числе и молочном скотоводстве, резко снизилось количество животных, что привело к снижению их продуктивности, ухудшению показателей воспроизводства, увеличению подверженности к заболеваниям, рождению молодняка с пониженной жизнеспособностью, как в ранние, так и в более поздние периоды роста и развития, что, в свою очередь, привело к значительному экономическому спаду отрасли.

Традиционные зоотехнические методы оценки сельскохозяйственных животных, основанные на анализе фенотипических признаков, не всегда обеспечивают объективность суждения о селекционной перспективности животных и не могут в полной мере удовлетворить требования, предъявляемые к селекции.

Большинство хозяйственно-полезных признаков имеют непрерывную фенотипическую изменчивость и находятся под контролем многих генетико-физиологических систем, а также различных факторов внешней среды. В связи с этим методы биохимической и молекулярной генетики, основанные на использовании генетических маркеров, находят все большее применение в практической селекции.

Беспрецедентные возможности открыло использование ДНК-маркеров для генетического маркирования локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками.

Генетические маркеры - это нуклеотидные последовательности, чье положение (локализация) определено в хромосоме или участке хромосомы.

Использование генетических маркеров молочной продуктивности в практической селекции крупного рогатого скота, позволит более достоверно оценивать генетический потенциал пород, популяций и отдельно взятых особей, контролировать селекционные процессы и корректировать их направленность.

Так зарубежными исследователями был выявлен ген BoLA DRB3, который является одним из ключевых генов, определяющих первичный иммун-ный ответ организма на вирусную инфекцию. Разные аллели этого гена играют не одинаковую роль в формировании устойчивости КРС к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза КРС [Xu, Van Eijk., Park, 1993].

В нашей стране Г. Е. Сулимова и др. (1995) провели исследования, профинансированные Фондом фундаментальных исследований Российской академии, и установили на большой выборке животных различных пород (черно - пестрой, айрширской и горбатовской) достоверную взаимосвязь между генотипом и устойчивостью к лейкозу.

А в работе «Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA DRB3) wish production traits in Canadian dairy cattle» [Sharif <#"863982.files/image001.jpg">

Рисунок 1 − Общая геномная организация казеинов КРС

Хотя по результатам проведенных Н. Юхмановой и Л. Калашниковой [2004] исследований на животных красно-пестрой породы можно сделать вывод, что в исследуемой популяции не установлено прямолинейной зависимости между генотипом по локусу каппа-казеина и удоем.

В настоящее время в литературе описано10 вариантов к-казеина, из которых наиболее часто встречающимися являются А и В, а среди редких аллелей - С, Е, F и G.

2. Материал и методы исследования

.1 Материал исследования

Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 17.06.14 по 27.07.14 и с 02.09.14 по 12.10.14.

Объектом исследования были коровы голштинской породы. Материалом для исследований служила кровь коров. Забор крови у коров проводился в хозяйстве ЗАО «Племзавод «Колос» Каневского района, в количестве n=115. Выделение ДНК, постановка ПЦР, ПДРФ - анализа, электрофореза проводились по описанным в литературе методикам (Van Eijk, Stewart-Haynes, Lewin, 1992]. Для статистической обработки результатов применялись стандартные методики Т.Ф. Лакина [1980] с использованием программных возможностей Microsoft Exel.

Обработка данных проводилась в программе на основе шаблона Microsoft Exel (BoLA-статистика), разработанной лабораторией биотехнологии СКНИИЖ (Н.В. Ковалюк). После внесения данных по генотипам коров программа автоматически определяет частоты встречаемости генотипов (в абсолютных и относительных значениях), аллелей (по группам и разновидностям), позволяет сортировать животных по генотипам и определять достоверность различий с использованием критерия Стьюдента.

2.2 Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты

При выделении ДНК из образцов крови использовали наборы реагентов Diatom DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» город Москва.

. Первичная обработка образцов.

К 100 мкл крови добавляем 400 мкл лизирующего раствора (Lysis Reagent). Далее идёт выделение без термостатирования.

. В пробирку с лизатом добавляем 20 мкл суспензии сорбента (диатомовые водоросли). Перед этим сорбент встряхиваем на вортексе. Ротируем 10 мин.

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Осторожно, не задевая, осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора.

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Удаляем супернатант. К осадку добавляем 1 мл рабочего однократного раствора солевого буфера (десятикратный солевой буфер (1М NaCl и 1M KCl) разводим водой до 100 мл, а затем 96% этиловым спиртом до 300 мл и перемешиваем).

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об.

. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе.

. Осадок сушим в термостате при 65 градусах Цельсия пять минут.

. К осадку добавляем 100 мкл ЭкстраГена (10% смесь ионообменников (типа Chelex), и 0,01% тритон X-100). Пробирку с ЭкстраГеном хорошо перемешать. Ресуспендируем на вортексе и термостатируем пять минут при 65 градусах Цельсия.

. Центрифугируем при 12000 об/мин

. Перенести содержащую ДНК надосадочную жидкость (80 мкл) в чистую пробирку.

.3 Проведение полимеразной цепной реакции

Полиморфизмы гена BoLA DRB3 определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. [1992], Сулимова, Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. [1995], используя соответствующие праймеры.

Для амплификации участков гена использовались следующие последовательности праймеров:

HLO-30: 5' - ATС СTC TCT CTG CAG CAC ATT TCC - 3': 5' - TСG CCG CTG CAC AGT GAA ACT СTC - 3'

Полиморфизмы гена каппа-казеина (CSN3) определяли с помощью полимеразной цепной реакции по методике [Сулимова, 1991], используя соответствующие праймеры.

Для амплификации участков гена использовались следующие последовательности праймеров:

SGE: 5^' - TAT-CAT-TTA-TGG-CCA-TTG-GAC-CA -3^'О : 5^' - CTT-CTT-TGA-TGT-CTC-CTT-AGA-GTT -3^'

ПЦР поводили с 200 нг ДНК в конечном объеме 30 мкл.

Состав реакционной смеси:

мМ трис-НСl рН 8,8 (Sigma)

,6 мМ сульфата аммония (Sigma)

,0 l% Tween 20 (Sigma)

,5-2,5 мМ (в зависимости от анализа) хлористого магния (Sigma)

,2 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (по 0,05 мМ каждого) (Sigma)

пМ каждого праймера

ед. Taq - полимеразы (ООО «СибЭнзим» Москва)

В пробирки с реакционной смесью добавляли минеральное масло (ООО «Хеликон») для предотвращения испарения жидкости и помещали в термоциклер МС-2, разработанный АО «ДНК-Технология» (Москва) для проведения ПЦР. С учетом особенностей работы амплификатора МС-2 и особенностей амплифицируемых участков нами были установлены следующие режимы амплификации:

При амплификации экзона 2 гена BoLA DRB 3

º С - 3 мин.

º С - 1 мин.

º С - 1 мин. 5 циклов

º С - 1 мин.

º С - 30 с.

65º С - 30 с. 27 циклов

72º С - 30 с.

72º С - 3 мин. 1 цикл

При амплификации участка гена каппа-казеина

95º С - 3 мин.

95º С - 30 с.

62º С - 30 с. 34 цикла

72º С - 30 с.

95º С - 1 мин.

62º С - 1 мин. 1 цикл

72º С - 3 мин.

В результате полимеразной цепной реакции получаются ПЦР-продукты с размерами: 284 пары нуклеотид для BoLA DRB3 и 228 пар нуклеотид для каппа-казеина.

Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации проводили электрофорез в 1.5% агарозном геле с использованием пятикратного трис-боратного буфера (TBE имеет состав: 54 г Трис-НСl; 27,5 г борная кислота; 2 мл 0,5 M ЭДТА, рН 8,0 доводят дистиллированной водой до одного литра) [Уильямс, Уилсон, 1978].

Приготовление 1,5% и 2% агарозного геля:

Агароза - 1,5 г

Доводим до 100 мл 1% TBE-буфером

Бромистый этидий - 5 мкл

После смешивания компонентов гель нагревают до кипения и оставляют в термостате на два часа при температуре 50 градусов Цельсия, чтобы молекулы полисахарида сформировали однородную решетку геля.

Образцы ДНК смешивали с буфером для нанесения проб, содержащим 50% глицерина, 50% TBE-буфера и 0,025% бромфенолового синего. Смешанные пробы вносили в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез обычно вели при постоянном напряжении 100 V.

Гель после электрофореза высушивали и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу ДНК, испускал волны в красно-оранжевой области видимого спектра 590 нм. После визуального осмотра гель фотографировали в ультрафиолетовых лучах.

Рисунок 2 − Электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР экзона 2 гена BoLA DRB3; pUC19/Msp I- маркер молекулярных масс, К - отрицательный контроль, 1-9 - исследуемые образцы

На рисунке 2 видно, что в ПЦР с геномной ДНК из образцов крови прошла хорошо, в геле видна полоса ДНК с ожидаемым размером 284 п.о., яркость полосы свидетельствует о достаточном количестве в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразы, правильном составе буфера для полимеразной реакции.

2.4 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции

В зависимости от целей исследований ПЦР-продукты обрабатывались рестриктизами.

В работе были использованы следующие ферменты: Rsa I, Bst Y I (Psu I, Xho II, Bst X2I), Bsu R I (Hae III), Hinf I.

Rsa I в буфере, содержащем 10 мМ трис - ацетата (рН = 7, 9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, 0, 1мг/мл BSA;

Bst Y I в буфере, содержащем 10 мМ трисНСl (рН 7,9), 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреитола;

Bsu R I в буфере, содержащем 10 мМ трис - НС1(рН = 8, 5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0, 1мг/мл BSA;

Hinf I в буфере, содержащем 50 мМ трис - НС1(рН = 7,6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT.

Последовательности, узнаваемые этими эндонуклеазами:

Rsa I - 5’GT ^ AC

Bst Y I - 5’ (A/G) ^ GATC (C/T) 3’R I - 5’GG^CC 3’I - 5’G ^ A(A,G,C,T)T C 3’

2.5 Электрофорез

Молекулярный вес продуктов ПЦР и их фрагментов, полученных после рестрикции, определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (6-12 %) [Херрингтон, 1999].

Состав ПААГ:

Вода, ТБЕ-буфер, 30 % ПАА, ТЕМЕД, 10 % персульфат аммония.

Бромистый этидий не добавляли, так как он плохо связывается с гелем и при электрофорезе первым покидает гель.

Электрофорез длился 1,5 часа.

Гели окрашивали в растворе этидиум бромида (1 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу, испускал излучение в красно-оранжевой области видимого спектра (590 нм). После просмотра гели фотографировали в ультрафиолетовых лучах с использованием цифрового фотоаппарата SONY DSC W15. Снимки анализировали в программах Adobe Photoshop 6.

После рестрикции амплификата гена каппа-казеина эндонуклеазой Hinf I гомозиготные животные по аллелю A (генотип AA) образуют два фрагмента величиной 135 и 93 пары нуклеотид, гетерозиготные AB - три фрагмента: 228, 135 и 93 пары нуклеотид, а несущие генотип BB - один фрагмент 228 пар нуклеотид.

На рисунке 3 показан результат электрофореза фрагментов ДНК - продуктов рестрикции гена каппа-казеина в 6% полиакриламидном геле.

Рисунок 3 − Анализ аллельного полиморфизма гена каппа-казеина

На рисунках с 4 по 6 представлены электрофореграммы продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 размером 284 пары нуклеотидов (пн), эндонуклеазами HaeIII, BstX2I, Bst2UI, Rsa I, позволяющие определить BoLА DRB 3 генотип животного.

Рисунок 4 − Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Hae III.

Рисунок 5 − Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой BstX

Рисунок 6 − Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Rsa I

Для разных аллельных вариантов гена BoLA DRB 3 характерно образование после рестрикции продуктов амплификации наборов рестриктных фрагментов (ДНК - паттернов) (таблица 1).

Сопоставление ДНК - паттернов, полученных с использованием указанных выше рестриктаз, позволяет идентифицировать более 50 аллелей гена BoLA DRB 3 (таблица 2). Допустим, при рестрикции ПЦР - продукта эндонуклеазой Rsa I образуются фрагменты 141, 104 и 39 пн (по таблице 1 находим, что это Rsa I - паттерн g); эндонуклеазой Bst Y I - 112, 87, 85 пн (Bst Y I - паттерн е); эндонуклеазой Hae III - 167, 65, 52 (Hae III - паттерн а). Затем по таблице 2 определяем, какой аллели соответствует комбинация установленных ДНК - паттернов.

Комбинация Rsa I - паттерна g, BstY I - паттерна e и Hae III - паттерна а соответствует 11 аллели гена BoLA DRB 3. Как видно из таблицы 2 эта аллель определяет устойчивость к лейкозу.

Таблица 1 - ДНК-паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикции

Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О, Захаров И.А. [1995] отмечают, что подобный метод ДНК - типирования может быть использован в сельскохозяйственной практике для генотипирования быков - производителей с тем, что бы снизить широкое распространение аллелей, обусловливающих чувствительность к лейкозу.

Таблица 2 - Таблица определения аллелей гена BoLA DRB 3 на основе данных рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз Rsa I, Hae III, Bst Y I и их связь с устойчивостью к лейкозу

Статистическая обработка результатов производилась как по стандартным методикам Н.А. Плохинский (1969), Н.А. Плохинский (1970); Е.К. Меркурьева (1979); Т.Ф. Лакин (1980), так и с использованием программных возможностей.

3. Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

.1 Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA-DRB3.2 в исследуемом стаде

По гену BoLA-DRB3.2 было прогенотипировано 115 коров черно - пестрой голштинской породы.

Распределение генотипов представлено в таблице 3.

Таблица 3 − Частота встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3

Из таблицы 3 видно, что наиболее многочисленными оказались группы животных, относящиеся к (Ч/Ч), (Ч/У) и (Ч/Н) генотипам, т.е. генотипам, в состав которых обязательно входят чувствительные аллели.

Соответственно в распределении аллелей гена BoLA DRB 3.2 наблюдается смещение в сторону чувствительных (Ч) аллелей - 52,2% (таблица 4).

Подсчет частот встречаемости аллелей проводился по формуле:

P(A) = (2+)/2n, (1)

где P - частота встречаемости аллели; А - аллель; N₁ - число гомозигот по исследуемому аллелю; N₂ - число гетерозигот; n - объем выборки.

Таблица 4 − Частота встречаемости аллелей по локусу BoLA DRB 3

На сегодняшний день известно 54 аллели гена BoLA DRB3.2, из них три аллели (*11, *23, *28) имеют статус устойчивых (У), четыре (*8, *16, *22, *24) - чувствительных (Ч), а остальные сорок семь аллелей относятся к нейтральным по отношению к лейкозу КРС. Таким образом, теоретически аллели должны иметь следующие частоты встречаемости: (У) - 5,6 %, (Ч) - 7,4 %, (Н) - 87,0 %. Но мы наблюдаем совершенно иное распределение в исследуемом стаде - смещение в сторону Ч - аллелей и элиминацию 60 % Н - аллелей. При сопоставлении эмпирических частот с ожидаемыми мы можем установить достоверность или случайность наблюдаемого между ними расхождения с помощью критерия c², предложенного К. Пирсоном в 1900 г.

         (p - p΄)²

c² = ∑ ────                   (2)

              p΄

Этот критерий представляет сумму квадратов отклонений эмпирических частот (p) от частот ожидаемых (p΄), отнесенную к ожидаемым частотам (p΄) (формула 2) [Лакин, 1980] (таблица 5).

Таблица 5 − Расчет критерия c² в исследуемом стаде

Таблица 6 − Частоты встречаемости отдельных аллелей BoLA DRB3 в стаде и исследуемой выборки

В нашем случае фактически полученная величина c² равна 360,13, что во много раз превышает критическое значение c² = 5,99, для 5 % - го (Р = 0,05) уровня значимости. Таким образом, нулевая гипотеза, т.е. предположение о том, что расхождение между эмпирическими и ожидаемыми частотами носит случайный характер, опровергается. Это говорит о том, что в результате искусственного отбора действовали довлеющие факторы, которые и привели к такому резкому смещению генного равновесия в сторону чувствительных аллелей.

Из 54 известных аллелей гена BoLA DRB3 в исследуемом стаде (N=115) было обнаружено девятнадцать аллелей. Причем известные на сегодняшний день чувствительные (BoLA DRB3*8, 16, 22, 24) и устойчивые (BoLA DRB3*11, 23, 28) аллели все встретились в исследуемом стаде, а нейтральные аллели встретились частично. Из таблицы 3 видно, что самыми распространенными из чувствительных аллелей являются BoLA DRB3*22 (15,8 %),*16 (17,1 %) и *24 (13,6 %), из устойчивых - *23 (14,5 %), из нейтральных - *3 (3,0 %), *10 (6,9 %), *25 (5,2 %).

.2 Качественные и количественные показатели молочной продуктивности черно - пестрых голштинских коров и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3

В настоящее время черно-пестрый голштинский скот - самый распространенный в мире. Этому способствует его высокая продуктивность, хорошая пригодность к машинному доению и приспособленность к промышленной технологии содержания. Голштино-фризский скот широко используется для разведения во всех зонах России, что говорит о высокой продуктивности и адаптационной способности этой породы [Сошенко, Сафонова, Кухарская, 2005].

Но внутри породы, или даже одного стада, показатели молочной продуктивности варьируют. Нами была изучена продуктивность в исследуемой выборке (n=115), состоящей из шести групп, сформированных по итогам генотипирования по гену BoLA DRB3.

Часто выборочные характеристики не совпадают по абсолютной величине с соответствующими генеральными параметрами. Величина отклонения выборочного показателя от его генерального параметра называется статистической ошибкой этого показателя, или ошибкой репрезентативности. Эти ошибки возникают в процессе отбора вариант из генеральной совокупности и к ошибкам измерений отношения не имеют. Величина ошибки репрезентативности измеряется средним квадратическим отклонением (), и чем сильнее варьирует признак, тем больше величина этого показателя.

О близости выборочной средней к генеральному параметру можно судить по отношению ошибки репрезентативности к сопровождаемой ею средней величине (Cs). Точность средних показателей, которыми оцениваются результаты наблюдений, считается вполне удовлетворительной, если коэффициент Cs не превышает 3-5%.

Таблица 7 − Количественные показатели молочной продуктивности

Примечание: здесь и далее: * - p<0.05; ** - p<0.01; ***- p<0.001. Достоверность различий определялась относительно группы Ч/У.

Данные, приведенные в таблице 7 , по I и II лактациям исследуемых животных показывают превосходство по количественным показателям молочной продуктивности в группах Ч/У, У/У и Н/Н, но так как две последние группы довольно малочисленны по своему составу и, к тому же, имеют одни из самых высоких показателей репрезентативных ошибок (по I лактации: У/У - 1,39; Н/Н - 1,09; по II лактации: 1,06 и 0,98 соответственно), целесообразным будет определение достоверности различий выборочных средних, используя критерий Стьюдента, относительно группы Ч/У.

Таким образом, группа Ч/У (26,0-26,2 кг/сут) превосходит по молочной продуктивности группы Ч/Ч (24,8-24,1 кг/сут), Ч/Н (23,9 кг/сут) и У/Н (24,5-24,4 кг/сут), достоверно от них отличаясь и имея при этом наименьшее значение ошибки репрезентативности  (0,63-0,69). В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Животные с генотипом Ч/Ч имеют не самые низкие показатели молочной продуктивности, но во II лактации они немного снижаются (24,8 Þ 24,1 кг/сут), видимо, вследствие более частого поражения инфекционными заболеваниями. Наименьшая молочная продуктивность отмечена в группе животных с генотипом Ч/Н (23,9 кг/сут), причем эти животные изначально имеют низкий продуктивный потенциал и, к тому же, чаще остальных подвергаются выбраковке по причине инфекционных заболеваний.

Качественные показатели молока показаны в таблице 14.

При исследовании качественных показателей молочной продуктивности достоверных отличий установлено не было, за исключением двух моментов: во II лактации достоверно отличались показатели содержания в молоке белка в группах Ч/У (2,99 г/л) и Н/Н (2,91 г/л) и лактозы Ч/У (4,52 г/л) и У/У (4,42 г/л).

Была исследована связь молочной продуктивности и отдельных генотипов.

Таблица 8 − Качественные показатели молочной продуктивности

  Жир, % ±Белок, г/л

±Лактоза, г/л

±Сухое в-во, г/л

Определены среднесуточные удои по каждому Ч/Ч генотипу, за исключением генотипов 16*22, 8*8 и 8*22, как редко встречаемых. Признак варьировал в пределах 22,6 - 28,2 кг/сут. Но так как коэффициент Cs (точность средних показателей) для групп животных с генотипами 16*8, 22*22, 24*24 и 24*8 превышал допустимый предел 5%, то при установлении достоверности отличий эти группы во внимание не брались. А между группами с генотипами 16*16, 16*24 и 22*24 достоверных отличий выявлено не было.

Таблица 9 − Показатели продуктивности животных генотипов Ч/Ч по локусу BoLA DRB 3

Подобные расчеты были проведены и для групп Ч/У и Ч/Н.

Таблица 10 − Показатели продуктивности животных генотипов Ч/У по локусу BoLA DRB 3

В группе Ч/У среднесуточная продуктивность варьирует в пределах 24,8 - 28,7 кг, но достоверность отличий между подгруппами различных генотипов Ч/У определить не представляется возможным по причине высоких значений коэффициента Cs.

Таблица 11 − Показатели продуктивности животных генотипов Ч/Н по локусу BoLA DRB 3

Среди генотипов группы Ч/Н признак продуктивности сильно варьирует в пределах 22,0 - 28,4 кг/сут. Но высокие значения коэффициента Cs не позволяют определить достоверность отличий по молочной продуктивности между группами животных, относящихся к различным генотипам Ч/Н.

Таким образом, можно предположить, что отдельные генотипы достоверно на молочную продуктивность не влияют.

3.3 Частота встречаемости генотипов по гену каппа-казеина и взаимосвязь генотипа с показателями молочной продуктивности у чёрно-пёстрых голштинских коров

Изучаемая выборка коров (n=115) была также исследована по гену каппа - казеина и по итогам генотипирования разделена на три группы - АА, АВ и ВВ. Были определены частоты встречаемости каждого генотипа. В свою очередь, каждая из групп была разбита на подгруппы в зависимости от принадлежности к тому или иному генотипу по BoLA DRB3.2, в каждой из которых были посчитаны среднесуточные показатели молочной продуктивности, данные представлены в таблице 12.

Таблица 12 − Количественные показатели молочной продуктивности коров различных генотипов по гену каппа - казеина

Из таблицы 14 видно, что наиболее встречаемыми являются генотипы группы АА (68,1%), менее встречаемыми - ВВ (1,7%), гетерозиготный генотип АВ по частоте встречаемости занимает среднее положение (30,2%). В свою очередь, в группе АА чаще остальных встречаются генотипы Ч/Ч, Ч/У и Ч/Н (20,2%, 15,7% и 14,9%, соответственно). В группе АВ часто встречаемыми являются генотипы Ч/У (10,4%) и Ч/Н(11,2%). Генотипы У/У и У/Н в группе АВ вообще не встречаются. А в группе ВВ встречаются лишь животные генотипа Ч/Ч.

В группе АА наибольшую продуктивность имеют животные генотипа Н/Н, но так как группа АА-Н/Н имеет довольно невысокую частоту встречаемости и по продуктивности достоверно не отличаются от группы АА-Ч/У, то достоверность отличий по молочной продуктивности оценивалась относительно группы АА-Ч/У.

Таким образом, продуктивность группы АА-Ч/Н (22,9 кг/сут.) имеет более низкую молочную продуктивность, которая с высокой степенью достоверности отличается от группы АА-Ч/У (25,8 кг/сут). Животные остальных генотипов в группе АА достоверных отличий по показателям молочной продуктивности относительно группы АА-Ч/У не имеют. В группе АВ наиболее продуктивными являются животные генотипов Ч/У и Ч/Н, причем они достоверно превосходят по молочной продуктивности животных с генотипами Ч/Ч и У/Н. Но так как в группах АВ-Ч/Ч и АВ-Ч/У коэффициент Cs превышает допустимые пределы, то со стопроцентной долей уверенности мы не можем утверждать о достоверности отличий по молочной продуктивности между различными генотипами по гену BoLA DRB 3 в пределах группы каппа - казеинового генотипа АВ.

А в самой малочисленной группе ВВ встречаются только животные Ч/Ч генотипа, среднесуточная продуктивность которых составляет 25,9 кг/сут, но значения  (ошибки средней) и Cs (коэффициента точности определения средней) высоки, что говорит о довольно большом разбросе данных в пределах этой группы. А это, в свою очередь, не позволяет сравнивать показатели молочной продуктивности животных группы ВВ с животными групп АА и АВ, которые между собой также достоверно не отличаются. Таким образом, по количественным показателям молочной продуктивности, все генотипы (АА, АВ и ВВ) гена каппа-казеина равнозначны.

Изучение качественных показателей молочной продуктивности представлено в таблице 13.

Из таблице 15 видно, что группа ВВ-Ч/Ч по содержанию жира в молоке достоверно уступает группе АВ-Ч/Ч. Группа АА-Ч/У достоверно уступает группе АВ-Ч/У. По содержанию белка в молоке группа АА-Ч/Ч достоверно уступает группе АВ-Ч/Ч. По содержанию сухого вещества группа АВ-Ч/Ч достоверно превосходит группу ВВ-Ч/Ч, а группа АВ-Ч/У - группу АА-Ч/У. В остальных группах достоверных отличий выявлено не было.

Таблица 13 − Качественные показатели молочной продуктивности коров различных генотипов по гену каппа - казеина

Таким образом, наилучшими качественными показателями молока обладают животные, имеющие генотип АВ по гену каппа-казеина.

3.4 Повышение частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа

Представленные выше исследования и расчеты показывают преобладание в изучаемой выборке и стаде в целом чувствительных (Ч) аллелей, которые, по всей вероятности, являются маркером повышенной молочной продуктивности. Ведь именно в этом направлении ведется селекция в молочном скотоводстве. Но в случае с западными странами, где преобладающее большинство ферм и хозяйств являются свободными от вирусоносительства лейкоза крупного рогатого скота и других опасных инфекционных заболеваний, такой отбор, а как следствие этого - накопление чувствительных аллелей, приводит к повышению показателей молочной продуктивности и увеличению экономического эффекта. В наших хозяйствах, где процент инфицированности тем же вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) достигает в отдельных регионах 70-90%, животные с таким генетическим потенциалом чаще других поражаются инфекционными заболеваниями, теряют продуктивность с каждой лактацией, попадают в группу больных и вовсе выбраковываются из стада. В связи с этим, для того чтобы добиться повышения молочной продуктивности, необходимо повысить резистентность животных к инфекционным заболеваниям, путем увеличения частоты встречаемости устойчивых (У) аллелей в популяции, а именно - Ч/У генотипа. Так как этот генотип, как нами было установлено, является наиболее выгодным в хозяйственном отношении, потому что сочетает в себе Ч - аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У-аллель как маркер хорошего иммунитета. Для селекционной практики установленная закономерность важна как возможность моделирования очередных поколений животных с высокой частотой встречаемости выгодного генотипа. Располагая данными по частотам встречаемости генотипа BoLA DRB3 у быков-производителей и у маточного поголовья, можно предсказать генетическую структуру по этому локусу в следующем поколении животных.

Так, например, для коров с генотипами Ч/Ч, Н/Н, Ч/Н можно подобрать быков У/У; с генотипами У/У, У/Н, Ч/У - быков Ч/Ч.

Но периодически всё же необходимо отклоняться от предложенной схемы закрепления с целью повышения гетерогенности популяции, чтобы избежать обеднения генетического разнообразия, ведь именно генетическое разнообразие между индивидами - основной фактор выживания популяции при постоянно меняющихся условиях окружающей среды [Терлецкий, 2007]. В то время как гомозиготность животных по локусу BoLA DRB3, предполагает наличие в генотипе идентичных генетических блоков, отвечающих за продуктивные качества, и может привести к резкому снижению эффективности селекционного процесса за счёт гомогенности исходного материала. Как показывают исследования ряда авторов, в стадах животных голштинской и айрширской пород обозначенные тенденции уже имеют место, негативно сказываясь на сохранности и продуктивности поголовья [Ковалюк, Шостак, Сацук, 2005].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам работы сделаны следующие выводы.

1. По гену BoLA DRB3 в ЗАО «Племзавод Колос» было прогенотипировано 115 коров голштинской породы. Определено, что генное равновесие смещено в сторону аллелей, имеющих статус Ч - чувствительных по отношению к персистентному лимфоцитозу (Ч - аллелей - 52,2 %, Н - 26,1 %, У - 21,7 %).

. Определено, что наиболее ценным в хозяйственном отношении генотипом является Ч/У, сочетающий в себе Ч - аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель - показатель хорошего иммунитета. В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Было так же определено, что не отдельные аллели, а именно их конкретные сочетания влияют на показатели молочной продуктивности коров.

. Определены генотипы по гену каппа - казеина и установлено, что генное равновесие смещено в сторону гомозиготного АА генотипа. Достоверных отличий по количественным показателям молочной продуктивности между животными различных генотипов (АА, АВ и ВВ) по гену каппа - казеина выявлено не было. По качественным показателям молока гетерозиготный генотип АВ достоверно превосходит гомозиготные генотипы АА и ВВ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Богданов Г.А. Кормление сельскохозяйственных животных. М., Агропромиздат. 1990. 265 с.

Борисовец К.Ф., Краско В.Е., Рыткина З.П.. Качество молока и эффективность его производства. Минск: Ураджай, 1978. 142 с.

Глазко В.И. Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у домашней лошади и лошади Пржевальского // Тез. докл. II международной научн. конф.: Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. М., 2000. С. 151-152.

ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB 3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу / Г. Е. Сулимова [и др.] // Генетика. 1995. №. 9. С.1294-1299.

Жебровский Л.С. Селекционно-генетические основы белкового состава молока коров. М. Колос. 1973. 248 с.

Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. // ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. Московская область, Лесные Поляны: Изд-во ВНИИплем, 1999. С 89-94.

Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. 2007. № 8. С.2-4

Кравченко Н.А. Разведение сельскохозяйственных животных. М., 1973. 234 с.

Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980. 293 с.

Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных. М., 1979. 423 с.

Молекулярно - генетическая оценка гетерозиготности в популяциях сельскохозяйственных животных / В. П. Терлецкий [и др.] // Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». СПб., 2007. С. 273-277.

Петров Р.В. Иммунология. М., 1982. 368 с.

Плохинский, Н.А. Биометрия. М., 1970. 367 с.

Плохинский, Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. М., 1969. 256 с.

Полиморфизм белков и анонимных последовательностей ДНК в оценке генетической дифференциации видов Ovis / Глазко В. И. [и др.] // Третья междунар. конфер. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» ВНИИФиБП. Боровск, 2000. С. 389-391.

Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота / Н. В. Ковалюк [и др.] // Вестник РАСХН. 2005. № 6. С.67-69.

Сошенко Л.П., Сафонова А.П., Кухарская А.Г. Резистентность животных и её значение в молочном животноводстве // Вестник Рос. ун-та дружбы народов. Сер. с.-х. н. 2005. №12. С. 51-61.

Сулимова Г.Е., Шайхаев Г.О., Берберов Э.М. Генотипирование локуса каппа - казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции // Генетика. 1991. Т. 27. С. 2053-2062.

Тузов И.Н., Гнатышак С.А. Взаимосвязь хозяйственно полезных признаков у голштинизированных коров // Труды Кубанского аграрного университета. Краснодар, 2005. Вып. 414 (442). С. 15-19.

Тузов И.Н., Одабашян Х.А. Результаты совершенствования красной степной породы голштинскими красно-пёстрыми быками // Труды Кубанского аграрного университета. Краснодар, 2005. Вып. 414 (442). С. 24-27.

Удина И.Г. Гены главного комплекса гистосовместимости человека и животных // Успехи современной генетики. 1994. № 19. С. 133-177.

Херингтон С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М., 1999. 558 с.

Юхманова Н., Калашникова Л. Влияние каппа-казеина на качество молока и его сыропригодность // Молочное и мясное скотоводство. 2004. № 8. С 24-25.

24 Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA DRB3) wish production traits in Canadian dairy cattle / S. Sharif <http://www.elibrary.ru/author_items.asp?authorid=770622> [et al.] // Animal Genetics <http://www.elibrary.ru/issues.asp?id=2464&selid=207933>. 1999. № 30. Р. 157-160

Cloning of cDNAs and the molecular evolution of a bovine MHC class II DRA gene / Y. Aida [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994. V. 204. P. 195-202.

Elsik C. G. The genome sequence of taurine cattle: A window to ruminant biology and evolution // Science. 2009. V. 324. P. 522-528.

Ferretti L., Leone P., Sagarmella V. Long range restriction analysis of the bovine casein genes // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. P. 6829-6833.

Hediger R., Ansari H.A., Stranzinger G.F. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation - of chromosome structure between cattle and sheep // Cytogenet Cell Genet. 1991. V. 57(2-3). P. 127-34.

Lewin H.A., Russel G.C., Glass E.J. Comparative organization and function of the major histicompatibility complex of domesticated cattle // Immunol. Rev. 1999. V. 167. P. 145-158.

Miretti M.M., Ferro J.A. Restriction fragment length polymorphism (RLFP) in exon 2 of the BoLA DRB 3 gene in South American cattle // Biochem Genet. 2001. № 39. Р. 311-324.

Scott P.C., Choi C.L., Brandon M.R. Genetic organization of the ovine MHC class II region // Immunogenetics 1987. V.25. P.116-122.

The impact of genetic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks / P. Martin [et al.] // Reproduction Nutrition Development. 2002. V. 42. P. 433-459.

The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes / M.A.M Groenen [et al.] // Immunogenetics. 1990. №31. P. 37.

Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA DRB3 gene distinguished PCR-RFLP // Anim. Genet. 1992. V . 23. P. 483-496.

Xu A., Van Eijk V.J. T., Park Ch. Polymorphism in BoLA-DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus. // J. of Immunology. 1993.V. 151. № 12. Р. 6977-6985.