Хемилюминесцентный анализ и его клиническое значение

Хемилюминесцентный анализ и его клиническое значение

Введение

Как правило, энергично протекающие химические реакции сопровождаются выделением энергии в форме тепла. Существуют, однако, реакции, например, с участием перекисей, при которых энергия выделяется в виде света: это явление носит название хемилюминисценции. Процессы жизнедеятельности сопровождаются сверхслабым излучением (собственная хемилюминисценция клеток и тканей), обусловленным в основном реакциями с участием свободных радикалов. Некоторые организмы обладают способностью излучать свет, видимый невооруженным глазом, что называется биолюминесценцией. Она характерна для некоторых грибов, микроорганизмов, беспозвоночных. Впервые явление хемилюминесценции было обнаружено в середине XX века итальянскими астрономами Л. Колли и У. Фаччини в виде свечение непигментированных тканей растений.

Весь механизм химической реакции, сопровождающейся хемилюминесценцией, можно отразить в трех последовательных стадиях:

.        Электрон отсоединяется от одного из участников реакции (восстановителя) и присоединяется к другому (окислителю), что приводит к запасанию в системе химической энергии, которая позже выделится в форме лучистой.

.        Перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней, то есть переход продукта реакции в возбужденное состояние.

.        Переход продукта в основное состояние, сопровождающееся выделением энергии в виде кванта света (происходит собственно явление люминесценции).

Свечением также сопровождается образование свободных радикалов при воздействии на вещество некоторых физических факторов: ионизирующего излучения (радиохемилюминесценция), ультрафиолетового и видимого света (фотохемилюминесценция), электрического тока (электролюминесценция), ультразвука (сонолюминесценция), трения (триболюминесценция).

А.Г. Гурвич и его последователи (С. Родионов, Г.М. Франк, Р. Одюбер, А. Стреллер) разработали последовательно биологический, физический газозарядный детекторы и ФЭУ, служившие для изучения собственного слабого свечения клеток животных и растений, названного Гурвичем митогенетическими лучами. Было установлено, что собственное свечение тканей обуславливается реакциями активных форм кислорода, реакциями цепного (перекисного) окисления липидов и реакциями с участием окиси азота. Из них особое значение для лабораторных исследований в медицине имеют реакции с участием активных форм кислорода, так как в 1971г. Р. Элланом была открыта собственная хемилюминисценция активированных фагоцитов, связанная с использованием ими активных форм кислорода в борьбе с антигенами.

1.Принцип метода

Низкая интенсивность собственной хемилюминесценции не позволяет напрямую использовать ее в аналитических целях, потому используется метод активированной хемилюминесценции.

Активаторы хемилюминесценции разделяются на физические и химические. Химические активаторы - это соединения, вступающие в реакцию с активными формами кислорода или свободными радикалами, выделяющимися в ходе основного процесса, с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии, при переходе которого в основное происходит высвечивание фотонов. Широко используются такие активаторы как люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин (бис-N-метилкридиний). Физические активаторы не влияют на ход исследуемой реакции, но усиливают интенсивность хемилюминесценции в 3-4 раза. К физическим активаторам относятся некоторые люминесцирующие соединения, применяемые при цепном окислении липидов - хлорофилл а, родамин Ж, хинолизин-кумарины, бактериофеофитин, Tb+ и пр. [1]

Существует новый метод проведения хемилюминесцентного анализа, предусматривающий последовательную двухстадийную стимуляцию различными химическими активаторами, что дополнительно повышает интенсивность свечения и позволяет использовать меньшее количество исследуемого материала для получения объективно регистрируемых результатов. [7]

Изучение хемилюминесценции биологических объектов показывает ее связь со свободнорадикальным окислением в организме, протекающим без участия ферментов за счет восстановления молекулярного кислорода до его активных форм: супероксидного анион-радикала, гидроксильного радикала, синглентного кислорода. Основным источником этих соединений является аутоокисление липидов, главным образом ненасыщенных жирных кислот, при котором выделяется свободные радикалы, взаимодействующие с кислородом с образованием пероксидов. При рекомбинации этих пероксидов происходит выделение квантов света. Другими источниками хемилюминесценции в свободнорадикальном окислении могут быть возбужденные молекулы димеров кислорода, кетонов, циклических гидроперекисей, оксалатов и альдегидов, биогенных аминов. Также эмиссия фотонов наблюдается при распаде перекисей (промежуточных продуктов реакций с молекулярным кислородом). Ингибируется свободнорадикальное окисление в организме за счет природных антиоксидантов, разделяющихся на антиоксиданты гидрофобный (токоферолы, флавины, каротиноиды, стероиды) и гидрофильной (сульфгидрильные соединения SH- группы белков, аскорбиновая кислота) фаз. Таким образом, хемилюминесцентная активность может говорить об избыточном свободнорадикальном окислении в организме, недостатке или низкой активности антиоксидантов, что свидетельствует, например, о гиповитаминозных состояниях (некоторые витамины, такие как D и C, являются сильными антиоксидантами).

Другим важным направлением клинического применения хемилюминесценции является оценка активности иммунокомпетентных клеток.

Хемилюминесцентный анализ применяется для обнаружения катализаторов, разлагающих пероксид водорода с образованием свободных радикалов (например, обнаружение гемсодержащего соединения - миоглобина в моче после инфаркта, оценка скорости заживления ран по экссудату), определения содержания гемоглобина в крови, исследование защитных механизмов крови (обнаружение фагоцитов и оценка их активности), диагностики небактериальной аллергии (оценка активности эозинофилов, контролирующих воспалительные реакции).

Хемилюминесценсция клеток крови наблюдается при действии кратковременных электрических импульсов, стимулирующих выделение активных форм кислорода и увеличение проницаемости клеточных мембран, при добавлении к лейкоцитам суспензии бактерий, оболочек дрожжевых клеток, кристаллов кварца и сульфата бария и др. корпускулярных антигенов, получивших название стимулов. Стимулированная ХЛ в присутствии активатора - показатель функционального состояния фагоцитов крови. Активность фагоцитов возрастает при наличии в организме очагов воспаления и снижается при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма. Повышение спонтанной и индуцированной хемилюминесцентной активности фагоцитов наблюдается у больных с бактериальной инфекцией, опухолями, снижение - при артритах, диабете, иммунодефицитных состояниях, в т.ч. врожденной недостаточности системы комплемента.

Помимо фагоцитов, неиндуцированной (собственной) хемилюминесцентной активностью обладают клетки тимуса и лимфоциты. Механизмы хемилюминесценции лимфоцитов те же, что у фагоцитов, однако из-за более низкой активности ферментов оксидаз и оксигеназ интенсивность их свечения значительно меньше. Для инициирования свечения используются антииммуноглобулины и митогены, параметры свечения различаются в зависимости от функционального состояния лимфоцитов и потому позволяют оценивать их метаболическую активность и устойчивость к повреждениям.

Индуцированная хемилюминесценция сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов. [4]

Также хемилюминесцентные реакции можно использовать в иммунологических исследованиях для получения сигнала в модифицированном ИФА, при этом повышается чувствительность метода и сокращается время проведения анализа. В качестве метки в ИФА широко применяют пероксидазу хрена, для выявления которой используются такие реакции. В прямом анализе, когда метка ставится на антиген, при ферментативной реакции образуется перекись водорода и окисляет люминол, катализатором этой реакции выступает пероксидаза хрена. Для усиления сигнала используются различные соединения, например, люциферин, фенолы, в этом случае интенсивность люминесценции усиливается в 10-100 раз, в отдельных вариантах в 500 раз (усиленный хемилюминесцентный анализ). Люминесцентный сигнал очень стабилен, его уровень достигает максимума за 30 с (для сравнения: цветная реакция с ОФД в качестве индикатора полностью развивается лишь за 30 мин). При непрямом анализе люминолом или его производными метится антитело. Такая метка в свободном состоянии способна окисляться перекисью водорода с выделением света. Если она образовала комплекс, то теряет способность окисляться.

Хемилюминесцентный анализ используют для измерения содержания АТФ, и АТФ-азы, креатинкиназы, аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, миелопероксидазы, протеолитических ферментов, ферментов монооксигеназной системы печени и др. Материалом могут выступать клеточные элементы крови (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты), плазма и сыворотка крови, моча больного.

Материалом для исследования являются:

)        Разведенная цельная кровь (оптимальное разведение - 1:22);

)        Выделенные фракции клеток.

Другими вариантами разведения крови, по разным авторам, являются 1:9, 1:21, 1:40, 1:100, 1:200, однако рост интенсивности свечения наблюдается до разведения 1:22 в связи со снижением оптической плотности раствора, а при дальнейшем разведении снижается за счет понижения концентрации фагоцитирующих клеток в нем. Недостаток использования цельной крови - антиоксидазная активность плазмы, искажающая результаты исследования.

Получение изолированной фракции клеток может производиться путем осаждения или центрифугирования (на примере нейтрофильных гранулоцитов):

А) к 5 мл крови из локтевой вены с гепарином добавляют 1 мл полиглюкина. Смесь инкубируют в течение 30 мин при 37°С для ускорения осаждения эритроцитов. Полученный лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл раствора Хенкса и получают взвесь. Подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева.

Б) 2 мл крови из локтевой вены в центрифужные пробирки, хорошо перемешивают с 80 ЕД гепарина и 1 мл полиглюкина, инкубируют смесь 25 минут при 37°C и 30 минут при комнатной температуре, после чего переносят лейкоцитарный супернатант в чистые центрифужные пробирки и трижды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 5 минут при 1500 об/мин. По окончании третьего центрифугирования супернатант удаляют, а оставшиеся клетки разводят в 2 мл раствора Хенкса. Подсчет лейкоцитов осуществляют в камере Горяева: к 20 мкл лейкоцитарной взвеси добавляют 200 мкл 10% раствора уксусной кислоты с 0,25% раствором трипанового синего. После подсчета клетки доводят раствором Хенкса до концентрации 2*106 /мл.

Наиболее простым способом проведения исследования является регистрация неиндуцированной, собственной хемилюминесценции клеток крови, т.е. без использования каких-либо активаторов процесса, однако наблюдаемое при этом свечение имеет очень слабую интенсивность, вследствие чего необходимо нахождение большого количества исследуемых клеток в пробе.

хемилюминесцентный клинический клетка

Таблица1 . Индукторы клеточной хемилюминесценции

Широко применяется использование химического активатора хемилюминесценции - люминола.

Рис.1 - Схема выделения кванта света при воздействии люминола

Для регистрации интенсивности хемилюминесценции используется прибор хемилюминометр. Помимо оценки функциональной активности клеток он может применяться в следующих областях:

·        Изучение процессов свободно-радикального окисления.

·        Оценка состояния прооксидантных и антиоксидантных систем человека и животных.

·        Определение антиоксидантной активности фармакологических препаратов, биологических жидкостей, косметологических средств и пищевых добавок.

·        Выявление наличия и определение следовых концентраций различных веществ.

·        Контроль микробиологической чистоты различных объектов (продуктов питания, воды, воздуха, технологических поверхностей, помещений).

·        Контроль токсичности проб воды, воздушной среды, почвы, а также различных соединений и материалов.

В измерительные кюветы вносятся реакционные смеси, включающие в себя суспензию исследуемых клеток, донорскую сыворотку (группа AB, резус-отрицательная), люминол (или другой активатор хемилюминесценции) и раствор Хенкса.

ИБА = Sиндуцир. : Sспонт.

Рис.2 - прибор для ХЛ и регистрация результатов: А - хемилюминометр: 1- корпус, 2 - электромотор, 3- мешалка, 4- кювета, 5- светоизолированная трубка для добавления растворов по ходу измерения. Б - пример записи кривых хемилюминесценции (слева - моноциты здорового донора, справа - моноциты больного ишемической болезнью сердца): Л - момент добавления люминола, С - момент стимула ФМА. [2]

.Учет и интерпритация результатов

Регистрируемые хемилюминометром данные выносятся на экран компьютера в виде кривых хемилюминесценции. При исследовании спонтанной хемилюминесценции (т.е. метаболической активности клеток крови) учитываются данные по одной кривой. Полученные значения будут различаться у здоровых людей и лиц с патологиями.

Повышение хемилюминесценции сыворотки и плазмы крови обуславливается активацией иммунокомпетентных клеток, накоплении в крови кислородных радикалов и гидроперекисей при усиленном окислении липидов, снижением уровня антиоксидантов; отмечается при воспалениях, язвенной болезни, ревматизме, гиповитаминозах, ранних стадиях атеросклероза, в стрессовых ситуациях.

Понижение хемилюминесценции крови объясняется большинством исследователей следствием нарушения проницаемости клеточных мембран и выходом в кровь низкомолекулярных пептидов, угнетающих хемилюминесценцию; отмечается при ишемии, гипоксии, злокачественных новообразованиях, гипервитаминозе Е, хронических бронхитах.

Рис.3 - Типичная хемилюминограмма крови здорового человека при двухстадийной стимуляции: 1 - спонтанная ХЛ; 2 - предстимуляция ФМА (4β-форбол-12-миристат-13-ацетат); 3- стимул фМЛФ (N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин); А - амплитуды ответа

Индекс бактериальной активности повышается при воспалительных процессах: у здоровых лиц, согласно результатам исследований, ИБА не превышает 1,47, у больных в 92% случаев ИБА выше 1,47 и может превышать 6. [9]

Хемилюминесцентный анализ мочи больного позволяет диагностировать ранние стадии почечной недостаточности, воспаления почек и гипоксические состояния: повышение ХЛ отмечается при гипоксии, нефрите, пиелонефрите, гломерулонефрите; снижение - почечной недостаточности, заболеваниях, сопровождающихся нарушением выделительной и концентрационной функций почек.

Заключение

Хемилюминесценция со времен своего открытия превратилась в явление, нашедшее широкое применение в клинической практике: фармакологии (исследование биологически активных соединений, оценка эффективности действия антиоксидантов и подбор препаратов), лабораторной диагностике (выявление скрытых патологий и ранняя диагностика заболеваний, оценка активности патологического процесса, оценка функционального состояния печени и почек, определение воспалительных процессов), токсикологии и медицине катастроф (оценка тяжести состояния при ожогах, травмах и отравлениях, контроль за лечением), реаниматологии и хирургии (оценка тяжести состояния больных, оценка эффективности гемодиализа и плазмофереза, изучение действия и подбор анестетиков), акушерстве и неонатологии (ранняя диагностика токсикозов и внутриутробной инфицированности, наблюдение за беременными, развитием плода и новорожденного), кардиологии (выявление предрасположенности и ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний), трансплантологии (оценка жизнеспособности трансплантатов, раннее определение реакций отторжения трансплантатов), иммунологии и аллергологии (оценка иммунного статуса, диагностика иммунодефицитных состояний и аутоиммунных болезней, выявлений алллергенов), нефрологии (оценка функционального состояния почек, эффективности гемодиализа), гематологии (оценка функциональной активности клеток крови), судебной медицине (определение времени смерти, выявление употребления наркотических и токсических веществ).

Список литературы

.        Владимиров, Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях / Ю.А. Владимиров // Соровский образовательный журнал. - 2001. - Т.7, №1 - с.16-23

.        Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина // Успехи биологической химии. - 2009. - Т.49 - с.341-388

.        Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников - М.: МЕДпресс-информ, 2004.

.        Клинические аспекты применения хемилюминесцентного анализа / Ю.С. Винник, А.А. Савченко, О.В. Теплякова и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т.46, №5. - С.11-16.

.        Образцов, И.В. Хемилюминесцентный анализ клеток крови в медицине: история, теория, практика / И.В. Образцов, М.А. Годков // Молекулярная медицина. - 2013. - №4. - с.3-9

.        Определение активности ферментов монооксигеназной системы печени / Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, А.Г. Горохов, А.А. Рунович // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2006. - №6. - С.147-149.

8.      RU 2366953 C2 Биохемилюминесцентный способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов / Д.Г. Дерябин, И.Ф. Каримов; ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет». - №2007139351/15; Заявл. 23.10.2007; Опубл. 10.09.2009, Бюл. №25. - 16 с.

9.      RU 2431837 С2 Способ определения антибактериальной резистентности организма человека / О.А. Коленчукова, А.А. Савченко; НИИ медицинских проблем Севера Сибирского отд. РАМН. - №2009124934/15; Заявл. 29.06.2009; Опубл. 10.10.2011, Бюл. №29. - 6 с.

10.    RU 2445626 C1 Способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток / О.В. Теплякова, Ю.С. Винник, А.А. Савченко и др.; ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ. - №2011107691/15; Заявл. 28.02.2011; Опубл. 20.03.2012, Бюл. №8. - 8 с.