Заказ дипломной. Заказать реферат. Курсовые на заказ.
Бесплатные рефераты, курсовые и дипломные работы на сайте БИБЛИОФОНД.РУ
Электронная библиотека студента




МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО "ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСТИТЕТ"

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БИОЛОГИИ









Курсовая работа

Специальность 1-31 01 01 Биология (по направлению)

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12





Исполнитель:

Студент 2 курса, группы 13-НПД-1

дневной формы обучения Балюк Наталья Валерьевна

Научный руководитель:

ассистент кафедры Каленчук Татьяна Владимровна





ПИНСК 2015

Оглавление


Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 История открытия витамина В12

1.2 Молекулярная структура

1.3 Функции витамина В 12

Глава 2. Методы исследования

2.1 Продуценты витамина В12

2.2 Биосинтез витамина В12

2.3 Получение витамина В 12

2.4 Применение витамина В12

Заключение

Список использованных источников


Введение


Витамины - группа низкомолекулярных органических веществ, которые в очень низких концентрациях оказывают сильное и разнообразное биологическое действие. В природе источником витаминов являются главным образом растения и микроорганизмы.

В настоящее временя более современным способом получения витаминов является микробиологический синтез.

Витамины принимают активное участие во многих процессах метаболизма человека и высших животных (процессы циклатрикарбоновых кислот, распад и синтез жирных кислот, синтез аминокислот и др.), оказывая влияние на разнообразные физиологические процессы. В промышленности витамины получают в основном химическим синтезом. Однако микробиологическое производство этих соединений также имеет место. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В12 и его коферментную форму.

Витамин В12 - (?-5,6-диметилбензимидазол) - цианкобаламин - полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов. В тканями животных витамин не образуется. Его синтез в природе осуществляется микроорганизмами. Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Известны активные продуценты витамина B12 у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 - мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Интерес представляют термофильные бациллы, а именно Bacillus circulans и Вас. stearothermophilus, которые растут соответственно при 60 и 75°С и за 18 ч. культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие (2,0 - 6,0 мг/л) выходы витамина. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas palustris, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirillumrubrum, Chromatiumuinosum и ряд других видов. Значительные количества витамина B12 образует цианобактерии Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Дрожжи и мицелиальные грибы не образуют корриноиды.

В организме человека и животных синтезируется микрофлорой кишечника, откуда поступает в органы, накапливаясь в наибольших количествах в почках, печени, стенке кишечника. Синтезом в кишечнике потребность организма в витамине B12 полностью не обеспечивается; дополнительные количества поступают с продуктами животного происхождения. Витамин B12 содержится в разных количествах в лечебных препаратах, получаемых из печени животных.

Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью. Является фактором роста, необходим для нормального кроветворения и созревания эритроцитов; участвует в синтезе лабильных метильных групп и в образовании холина, метионина, креатина, нуклеиновых кислот; способствует накоплению в эритроцитах соединений, содержащих сульфгидрильные группы. Оказывает благоприятное влияние на функцию печени и нервной системы.

Витамин В12 является наиболее эффективным современным противоанемическим препаратом. Его с успехом применяют для лечения, злокачественного малокровия, при постгеморрагических и железодефицитных анемиях, апластических анемиях у детей, анемиях алиментарного характера, анемиях, вызванных токсическими и лекарственными веществами, и при других видах анемий

Целью данной работы является рассмотрение основных способов микробиологического синтеза витамина В12 с применением новых штаммов, целью которых является получение штаммов бактерий, способных синтезировать витамин В12 в более высокой концентрации, чем известные микробные продуценты. Рассмотрение основных реакций, протекающих при образовании витамина В12. Целью является более подробное рассмотрение микробиологического метода, изучение его технологического прохождения с учетом всех стадий, также наиболее интересных продуцентов, штаммы которых способны к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Рассмотреть новые аналоги витамина В12 полученных при частичном синтезе.

Задачи данной работы:

) Рассказать об истории открытия витамина В12

) Описать основные способы получения витамина В12

) Раскрыть микробиологический метод получения В12

микробиологический синтез витамин цианкобаламин

Глава 1. Обзор литературы


1.1 История открытия витамина В12


Начало истории витамина B12 положили исследования злокачественного малокровия (пернициозной анемии) - заболевания, поражающего в основном пожилых людей, но наблюдаемое иногда и у детей. До 1926 г. это заболевание было неизлечимым и обычно кончалось смертью. При этом заболевании в организме вырабатываются аномально большие, недоразвитые и нестойкие эритроциты, общее количество которых значительно снижалось (1×106 - 3×106 мм~3 вместо 4,5×106 - 6×106 мм~3). Заболевание поражает также и другие быстрорастущие ткани, например, слизистую оболочку желудка (в результате прекращается секреция НСl) и нервные ткани. При этом часто наблюдается демиелинизация центральной нервной системы с нарушением координации движений (атаксия) и психотическими расстройствами. Внутримышечное введение 3-6 мкг витамина B12 достаточно, чтобы вызвать ремиссию у пациента, больного перницитозной анемией. В 1926 г. Мино и Морфи обнаружили, что с пернициозной анемией можно справиться, если употреблять в пищу сырую или слегка поджаренную печень из расчета 1/4 кг в день. И только 22 годами позднее из печени крупного рогатого скота были выделены первые красные кабальт содержащие кристаллы витамина B12. Позже выяснилось, что более богатым источником витамина могут служить жидкие ферментационные среды бактерий.

Структура витамина B12 была впервые определена в 1956 году Дороти Ходжкин методом дифракции рентгеновских лучей. Это была самая крупная органическая молекула, структуру которой удалось определить методами рентгено-структурного анализа. Циклическая система витамина B12 подобна циклической системе порфиринов; она состоит из четырех пиррольных колец с атомом кобальта в центре. Нормальный уровень витамина B12 в крови составляет ~2-10~-10 M или немного выше, однако у вегетарианцев этот уровень может опускаться ниже половины этой величины. Недостаточность фолиевой кислоты также может вызывать, мегалобластическую анемию, а большой избыток фолиевои кислоты может в некоторой степени уменьшить анемию у пациентов, больных злокачественным малокровием. В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка - 1 мг/кг), чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Активированный ил сточных вод содержит 4-10 мкг/кг витамина, но при этом требуется разделение большого числа различных форм (аналогов).

Химический синтез витамина В12 очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух больших лабораторий - Вудворта и Эшенмозера для осуществления химического синтеза витамина В12, включающего 70 стадий. Поэтому в настоящее время витамин В12 в промышленности получают исключительно биосинтетическим путем. Из 10 тонн ежегодно выпускаемого в мире витамина B12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно витамин B12), 2 т на гидроксокобаламин, 1т - на коэнзим В12 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указанных количествах используют в медицине. Остальное количество витамина используется для животноводства.


1.2 Молекулярная структура


Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура - азотистое основание - 5,6 - диметилбен-зимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью (рисунок 1).


Рисунок 1. Строение молекулы витамина


Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части:

) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом);

) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат;

) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.

Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3-5,6 ДМБ и последняя - верхним лигандом (У), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд - CN-группа (артефакт процесса выделения).vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B12-I), метильная группа (метилкобаламии, СН3-B12-CoB-II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотиданым основанием. Нижний лиганд (х) - 5,6 ДМБ может быть заменен на аденин (псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некоторых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех витамин В12-подобных соединений только Со-В12-I и Со-В12-II (СНз-В12) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B12 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например, в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982). Недавно открыты новые аналоги витамина В12: три из них получены при частичном синтезе (фтор-метилфосфито-Р-кобаламид, диметилфосфито-Р-кобаламин, Fe-кобаламин) и один фактор VA выделенный из активного ила. По сравнению с CN-кобаламином у них были модифицированы либо верхний лиганд, либо центральный атом корринового кольца. Два фосфито-корриноида, содержащие Со-Р-связь, проявляют активность в микроорганизме Qchromonas malhamensis (реакция как у высших животных) для Е. coll 215 и животных. В отличие от них Fe-кобаламин и фактор VA проявляли очень низкую активность. Первые два аналога связывались с внутренним фактором (ВФ) животных (белок, участвующий в транспорте витамина BIS), Другие два - нет. Значит, биологическая активность коррелирует со способностью связываться с ВФ.

1.3 Функции витамина В 12


Описано пятнадцать биохимических реакций (таблица 1), катализируемых коферментными формами витамина - 5-дезоксиаденозил-В12 и СН3-В12. Все реакции, кроме рибонуклеотидредуктазной, катализируемые 5'-дезоксиаденозил-В12, связаны с переносом водорода. При этом имеет место 1,2-гидридный сдвиг с одновременным перемещением группы в противоположном направлении: В случае рибонуклеотидредуктазы роль донора и акцептора водорода выполняют различные молекулы. Реакции, происходящие при участии СН3-В12, включают перенос метильных групп, и СН3-В12 выступает в качестве интермедиата в реакциях трансметилирования. В организме животных и человека витамин В12 участвует в образовании метионина из гомо - цистеина и в изомеризации метилмалонил-КоА в сукцииил-КоА.


Таблица 1. Ферментативные реакции, катализируемые аденозилкобаламином

ФерментыРеакцииПереносимая группаГлутаматмутазаL-трео-р-метиласпарат L-глу - тамат-СН (NHa) СООНМетил малонил-КоА-му-сукцинил КоА + Ь^-метилмало--COS-KoAТазанил-КоА2 - Метилепглутаратму-метилитаконат - 2-Метиленглута--С (=С На) СООНТазаРат-NHaL-P-Лизинмутаза3,5-диаминогексаиоат L-fJ-ли - зинD-a-Лизинмутаза2,5-диаминогексаноат D-a-ли - зин-NHaО-а-Орнитчшмутаза2,4-диаминогексаноат - "-"? D-a ор - нитин-NHaL-a-Лейцинмутаза3-аминоизокапронат L-a лейцин-NHa1,2-Диолдегидратазаэтиленгликоль - *? ацетальдегид ?++ НаО-ОН1,2-пропандиол - *? пропионовый альдегид + Н20-ОНГлицериндегидрогеназаГлицерин 3-оксипропионовый альдегид + НаО-ОНЭтиленгликоль - > ацетальдегид + + н;. о-ОН1,2-Пропандиол - *? пропионовый альдегид - ) - НаО-онЭтаноламиндезамииазаЭтаноламин ацетальдегид + + nh4-NHa2-аминопропанол - ? пропионовый альдегид + NH4-NH2Рибоиуклеотидредук-D-рибонуклеотид - ? D-2-дезокси-НетТазарибонуклеотид 4 - НгО

Глава 2. Методы исследования


2.1 Продуценты витамина В12


В природе витамин В12 и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В12 в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по - видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариота способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В12 представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М - 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина.

В семействе Propionibacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина В12 в клетках. Это прежде всего Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В12 в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. gugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В12. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micro - monospora: М. purpureae, М. echinospora, М. halophitica.М. fused, М. chalceae. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, М. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отме ieno ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. for - micoaceticum и Acetobacter ivoodi, синтезирующие ацетат из С02.

Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья. Achromobacter sp., используя изопропиловый спирт как источник углерода и энергии, накапливает до 1, 1 мг/л провитамина, Pseudomonas sp. синтезирует витамин В12 в среде с метанолом или пропандиолом (до 160 мкг/л), факультативный метилотроф (FM=02T) образует в среде с метанолом до 2,6 мг/л витамина. Выделен штамм Klebsiella 101, образующий большое количество корриноидов в клетках только при росте на среде с метанолом как единственном источнике углерода и энергии.


2.2 Биосинтез витамина В12


Далее образуется порфобилиноген, возникающий при конденсации двух молекул б - АЛК, а при конденсации четырех молекул порфобилиногенауропорфириноген III (УПГ III). Последовательность реакций между УПГ III и кобириновой кислотой получила экспериментальное подтверждение лишь в последние годы. Показано, что при нарушении процесса амидирования клетки Propionibacterium shermanii выделяют в среду соединения, названные коррифиринами - метилированные восстановленные производные уропорфирина III. К настоящему времени выделено и охарактеризовано три соединения: коррифирин-1 (метилкоррифирин), коррифирин-2, или сирогидрохлорин (диме-метилкоррифирин). Меченая 6-АЛК и метионин включаются в коррифирины, а последние - в витамин В12.

Метилирование УПГ III с одновременным декарбоксилированием боковой цепочки уксусной кислоты при С12 кольца С приводит к расхождению путей биогенеза витамина В12 и других тетрапирролов. В результате дальнейшего метилирования и образования С - С связи между кольцами А и Д синтезируется кобириновая кислота.

Донором семи метильных групп, включаемых в УПГ III, является S-аденозилметионин. Характер включения атома Со и образования непосредственной связи между кольцами А и Д неизвестен. На следующем этапе биосинтетического пути кобириновая кислота превращается в кобинамид (фактор В), при этом остатки карбоновых кислот кобириновой кислоты амидируются, а к остатку пропионовой кислоты кольца Д присоединяется аминопропанол (рисунок 2).

На этой же стадии происходит присоединение к корриновому кольцу 5-дезоксиаденозильной группы и кобириновая кислота (рисунок 3) становится 5-дезоксиаденозилкобинамидом (коферментная форма фактора В). Аминопропанол, видимо, образуется при декарбоксилировании L-треонина.

Далее кобинамид фосфорилируется с образованием кобинамидфосфата и, реагируя с гуанозинтрифосфатом (ГТФ), дает кобинамидгуанозиндифосфат. В коферментную форму кобинамидгуанозиндифосфата происходит включение нуклеотида и образование кобаламин-5'-фосфата.


Рисунок 2. Биосинтез витамина В12


Витамин В12, как уже отмечалось выше, содержит специфическое азотистое основание - 5,6-ДМБ, которое в природе встречается только в этом соединении. Непосредственным предшественником 5,6-ДМБ служит рибофлавин. В молекулу витамина В12 5,6-ДМБ включается в виде а-рибазол-5'-фосфата. При ферментативном дефосфорилировании кобаламин-5'-фосфата образуется кобаламин.


Рисунок 3 - Строение кобириновой кислоты


Витамин В12, как уже отмечалось выше, содержит специфическое азотистое основание - 5,6-ДМБ, которое в природе встречается только в этом соединении. Непосредственным предшественником 5,6-ДМБ служит рибофлавин. В молекулу витамина В12 5,6-ДМБ включается в виде а-рибазол-5'-фосфата. При ферментативном дефосфорилировании кобаламин-5'-фосфата образуется кобаламин.

Последовательность реакций при синтезе кобаламина из кобинамида выглядит следующим образом:

) кобинамид + АТФ кобинамид-Ф + АДФ;

) кобинамид-Ф + ГТФ - *ГДФ-кобинамид + ФФИ;

) кобинамид-ГДФ + а-рибазол-5'-фосфат кобаламин-5' - фосфат + ГМФ;

) кобаламин-5'-фосфат кобаламин + Ф".


Рисунок 4 - Строение коферментной формы

Известны две коферментные формы витамина В12: аденозилкобаламин (рисунок 4) и метилкобаламин (коферментная форма II). Более 80% всех синтезированных пропионовокислыми бактериями корриноидов находится в коферментной форме I, которая, как уже указывалось, в качестве лиганда содержит 5-дезоксиаденозил.

Источником аденозила служит АТФ. Коферментная форма содержит Со-С-связь и является первым кобальторганическим соединением, обнаруженным в живых системах. Метилкобаламин обычно содержится в клетках в незначительных количествах, но у М. barkeri метил-фактор III, который содержит в нуклеотидной части 5-оксибензимидазол, составляет до 80% от суммы всех корриноидов.

Регуляция биосинтеза витамина В12 осуществляется по принципу репрессии. Витамин В12 угнетает только свой собственный синтез, не оказывая влияния на образование других тетрапирролов и, как полагают, действует на стадии метилирования УПГ III. В качестве регулятора выступает лишь полная нуклеотидсодержащая молекула витамина. Гем оказывает координированную репрессию синтеза ферментов начальных стадий биогенеза тетра - пирролов.

Функциональной формой витамина является аденозилкобаламин (5,6-диметилбензимидазолил) - Со-5-дезоксиаденозилкобамид) и метилкобаламин (а (5,6-диметилбензимидазолил) - Со - метилкобамид).

Как и большинство витаминов, В12 может существовать в различных формах и принимать различные наименования. Названия для витамина B12 содержат словоформу "кобальт", так как кобальт - минерал, найденный в центре витамина: кобринамид, кобинамид, кобамид, кобаламин, гидрокскобаламин, метилкобаламид, аквакобаламин, нитрокобаламин, и цианокобаламин.

2.3 Получение витамина В 12


Получение витамина В 12 с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В 12 используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1 стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10 - 100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10 - 100 мг/л), источники азота. В среду добавляют кукурузный экстракт (30 - 70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5-7,0 путем введения (NH4) OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;

) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;

) дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°-120° в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. for - micoaceticum и Acetobacter ivoodi. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом. При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0 - 8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii М-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина.

Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 мг/л.

В семействе Propionibacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина В12 в клетках. Это прежде всего Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В12 в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. gиgosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В12. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micro-monospora: М. purpureae, М. echinospora, М. halophitica.М. fused, М. chalceae. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, М. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечeнo ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена.

Получение витамина В12 с помощью бактерии Pseudomonas denitrificans

Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных количествах B12, но чаще всего используют мутант Ps. denitriflcans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В12 удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до 60 мг/л. Бактерии культивируют с аэрацией и перемешиванием в периодических (или проточных) условиях в среде (а) следующего состава: свеклосахарная меласса - 100 г, дрожжевой экстракт - 2 г, (NHtb НРО4 - 5 г, MgS04 - 3 г, MnS04 - 200 мг, CoNO3 - 188 мг, 5,6 ДМБ - 25 мг, ZnSO4 - 20 мг, Na2MoO3 - 5 мг, вода водопроводная - до 1 л, рН 7,4. Меласса богата бетаином и глутаминовой кислотой, оказывающими положительный эффект на выход витамина. Бетаин стимулирует синтез б-АЛК и, возможно, также изменяет проницаемость мембраны. Культуру сохраняют в лиофилизированном состоянии, поддерживают в вышеприведенной среде. Пересев осуществляют в пробирку с плотной средой (б). Состав среды (б): свеклосахарная меласса - 60 г, пивные дрожжи - 1 г, N-Z-амин - 1 г, (МН4ЬНРО4 - 2 г, MgSO4 - 1 г, MnSO4 - 200 мг, ZnS04 - 20 мг, MoSO4 - 5 мг, агар - 25 г, вода водопроводная - до 1 л, рН 7,4. Инкубируют 4 дня при 28°. Далее клетки переносят в 150 мл жидкой среды того же состава (но без агара), налитую в литровую колбу Эрленмейера. Инкубируют 3 дня при 28° на качалке. Содержимое колбы вносят в ферментер на 5 л, содержащий 3,3 л среды (см. выше), стерилизованный 75 мин при 120°. Инкубируют 90 ч при 29° с перемешиванием (420 об/мин) и аэрацией (0,2 м3/ч). Чистый витамин В12 получают в результате проведения следующих последовательных операций:

Культуральная жидкость с клетками Ps. denitrificans (3,3л) нагревание 30 мин при 20°С, охлаждение, доведение Рн до 8,5, добавление KCN, перемешивание 16 ч при 25°, добавление ZnCl2 (200 г), доведение рН до 8,0, перемешивание, фильтрация.

Фильтрат:

·Трехкратная экстракция 350 мл смесей

·крезола и углеродистого тетрахлорида (1: 2 - соотношение)

·Органический экстракт I

·Водный экстракт

·Трёхкратная экстракция 30 мл. смеси крезола и

·углеродистого тетрахлорида (1: 2 соотношения)

·Органический экстракт II

·Добавление 200 мл ацетона и 120 мл эфира

·Неочищенный витамин В12

В результате процесса экстракции получают цианкобаламин 98%-й чистоты и выходом 75%. Конечный выход - 59-60 мг/л, CN-кобаламин - стабильная форма витамина.

Получение витамина В12 с помощью штамма бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д, продуцирующего витамин В12, который применяется как антианемический препарат в медицине и в производстве кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, способных синтезировать витамин В12 в более высокой концентрации, чем известные микробные продуценты.

Условия биосинтеза витамина В12 штаммом Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д.

Биосинтез витамина В12 культурой Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д осуществляется по следующей схеме: посевная культура на агаризованной среде - -> посевная культура на колбах на жидкой среде - -> культура на жидкой среде в посевном аппарате - -> биосинтез на жидкой среде в ферментере.

В качалочную колбу объемом 750 мл с объемом среды 50 мл вносят культуру из пробирки в количестве 0,1%.

Выращивают культуру при температуре 30oС в течение 48 часов.

Условия ферментации: постоянное перемешивание, температура 28-32oС, при подаче воздуха 02-05 л/л среды в минуту в течение 40-60 часов до оптической плотности больше 0,2.

Полученным посевным материалом в дозе засевают стерильную ферментационную среду.

Ферментацию проводят при температуре культуральной жидкости 28-32oС, при постоянном перемешивании, избыточном давлении 0,5 ати, при расходе воздуха 0,2 л/л среды в минуту.

Культура Pseudomonas fluorescens BKM - 2224Д характеризуется тем, что ее рост происходит параллельно с биосинтезом витамина В12 в аэробных условиях на протяжении всего процесса ферментации.

Содержание витамина В12в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 120-150 мкг/мл при определении микробиологическим методом с использованием в качестве тест-культуры Е. соli 113-3 или спектрофотометрическим методом. При культивировании пропионово-кислых бактерий содержание витамина B12 в культуральной жидкости равно 40-50 мкг/мл.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость подкисляют серной кислотой до значения рН 5,8 ед., проводят лизис культуры при температуре 90 - 10oС. Для получения готового продукта культуральная жидкость может быть переработана на распылительной сушилке с наполнителями (мел, соль, отруби и др.) или отправлена на стадии получения и выделения витамина B12 в чистом виде.

Получение витамина B12 с помощью метаногенных бактерий

В клетках метанобразующих бактерий витамин В12 присутствует от 4,1 нмоля/мг сухих клеток у Methanosarcina barkeri до 0,65 наномолей/мг сухих клеток у Metanobacterium formicum. Биосинтез кобаламинов архебактериями (изучали на М. barkei) сходен с биосинтезом корриноидов у анаэробных эубактерий. У метанотрофа Mtb. thermoautotrophicum большая часть клеточного кобамида локализована во фракции мембран и связана с мембранным белком. Предполагают, что содержащий кобамид интегральный мембранный белковый комплекс играет существенную роль в метаболизме этих бактерий при утилизации H2 + CO2, которая, видимо, сводится к переносу электронов. Корриноиды у метанобразующих бактерий участвуют также в катаболизме ацетата и метанола. Превращение метанола в метан у Mis. barkeri происходит через образование СНз-СоМ, в метилировании которого за счет метанола участвуют две метилтрансферазы, зависимые от кобамида. Корриноид, видимо, служит простетической группой фермента. Во Франции из ила сточных вод выделили мезофильные метаногенные бактерии и инкубировали их в ассоциации с другими бактериями в полупроточном режиме в среде, содержащей метанол (3-12 г/л), мелассу, кукурузный экстракт, NH4, Co, ортоксилидин и 5,6 ДМБ. Ферментацию ведут при 35° в ферментере на 1000 м3 с ежесуточной заменой 10% бродящего субстрата свежей средой. Биомассу отделяют на сепараторах и высушивают на распылительной сушилке. Высушенный концентрат усредняют мелом до стандартной активности 1000 мкг/г препарата, который используют в таком виде как добавку к кормам. Сухой концентрат до усреднения содержит - 3000 мкг/г витамина B12 что составляет 45-50% суммы корриноидов, фактор III - 10-15% и другие неполные корриноиды - 40-50%. Термофильные штаммы метанотрофных бактерий родов Methanobacillus и Methanobacterium образуют 2 мг/л кобаламина при содержании в среде 8 г/л метанола. В России производство кормового препарата витамина B12 основано в основном на переработке барды (отхода ацетонобутилового или спиртового производства) биоценозом бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Используют сложный консорциум анаэробных микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии. К, барде добавляют метанол - до 2%, СоСl2-6Н2О - 10 г/м3, мочевину - 300 г/м3 и сухие кормовые дрожжи - 230 г/м3. Дозировку обогатителей производят автоматически. Барду подают в нижнюю часть ферментатора метантенка (па 4-5 тыс. м3), в котором автоматически регулируют параметры процесса, обеспечивая контроль температуры (55-57°С), рН (7,5-8,0) и длительности брожения. Брожение ведут непрерывно, ежесуточно заменяя 20-25% бродящей жидкости на свежую барду. В качестве пеногасителя используют рыбий жир. Для получения кормового препарата бражку выпаривают и сушат. Поскольку витамин В12 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют. Для этого получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием подкисляют до рН 5,0-5,3 и добавляют к ней сульфит натрия (0,1-0,25%). Содержание витамина В12 в исходной сброженной жидкости - 4,4 г/м3. Сгущение сброженной барды осуществляют на выпарных аппаратах (до 14-17% содержания сухих веществ), а сушку в распылительной сушилке. Концентрация витамина B12 в высушенном препарате - 500-600 мг/кг. Истинный витамин составляет 20-25% от суммы корриноидов, фактор III - 35-40%, фактор В и другие - 40-45%. Получаемый препарат называют КМБ-12.

Схема представлена на рисунке 5. Ацетоно-бутиловая барда из нижней части бражной колонны поступает в сборник барды 1 и насосом подается в декантатор 3. Отстой барды собирается в сборнике 4 и используется на корм скоту. Декантат, охлажденный до температуры 55-57°С, метанол и хлористый кобальт поступают в ферментер 12. Сброженную массу из верхней части ферментера отбирают и направляют в реактор 19, где осуществляют стабилизацию витамина B12 путем добавления сульфита натрия и соляной кислоты, смешанных в смесителе 18. Из стабилизированной бражки удаляют газы в сепараторе газов 22, бражку упаривают в выпарной установке 24 и собирают в сборниках 26. Сгущенная метановая бражка перекачивается насосом 27 в сборник метановой бражки 28, а оттуда насосом 29 в распылительную сушилку 31.

В качестве теплоносителя для сушки используют газы брожения, сжигаемые в печи 39. Сухой порошок поступает в бункер 33 и расфасовывается в полиэтиленовые мешки, вложенные в крафт-пакеты.

Отсутствие промышленных отходов, доступность сырья, непрерывность метода, не требующего стерильных условий, делают его экономичным.

Кормовой витамин В12 получают в Советском Союзе на Грозненском ацетоновом и Ефремовском биохимическом заводах. Для производства витамина В12 предусмотрены и за последнее время внедрены системы автоматизации основных стадий технологического процесса.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В12 (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина B12 с малыми дозами антибиотиков, в частности с биомицином. Реализация в нашей стране описанного способа и получение концентрата витамина В12 позволили полностью обеспечить животноводство этим витамином.

В США почти все вырабатываемые комбикорма для свиней и птиц обогащают витамином В12. Показано, что белок животного происхождения можно заменить растительным белком при условии обогащения кормосмесей витаминов В12 в дозе 60 мкг/кг.


Рисунок 5 - Технологическая схема получения концентрата витамина В12 с помощью смешанной культуры метанообразующих бактерий: 1 - сборник барды; 2 - насос для барды; 3 - декантатор барды; 4 - сборник сгущенной барды; 5 - сборник декантата барды; 6 - насос для декантата барды; 7 - холодильник для охлаждения декантата барды, 8 - сборник-мерннк метанола; 9 - насос-дозатор метанола; 10 - сборннк-мерннк раствора хлористого кобальта; 11 - насос-дозатор раствора хлористого кобальта; 12 - ферментатор для метанового брожения; 13 - насос для метановой бражки; 14 - сборник-мерннк соляной кислоты; 15 - насос-дозатор соляной кислоты; 16 - сборник-мерник раствора сульфита натрия; 17 - насос-дозатор раствора сульфита натрия; 18 - смеситель метановой бражки, соляной кислоты и раствора сульфита натрия, 19 - реактор для стабилизации витамина Bi2 в метановой бражке; 20 - насос для стабилизированной метановой бражки; 21 - подогреватель стабилизированной метановой бражки; 22 - сепаратор газов, выделяющихся из метановой бражки; 23 - насос для подачи стабилизированной метановой бражки на выпарную установку; 24 - подогреватели метановой бражки; 25 - выпарная установка для сгущения метановой - бражки (а-1 корпус, 6-II корпус, s - III корпус, г-IV корпус, д-барометрический конденсатор, е - вакуум-насос); 26-сборник сгущенной метановой бражки; 27-насос для сгущенной метановой бражки; 28 - сборник сгущенной метановой бражки (передаточный); 29 - насос для сгущенной метановой бражки; 30 - подогреватель сгущенной метановой бражки; 31 - распылительная сушилка с центробежным распылением; 32 - циклоны распылительной сушилки; 33 - бункер сухого концентрата; 34 - расфасовка в мешкн; 35 - скруббер для очистки дымовых газов сушилки от порошка концентрата; 36 - установка для каталитического сжигания газов, выделяющихся при подкисленни и нагревании метановой бражки; 37 - газгольдер для газов брожения; 38 - холодильник для отделения воды из газов брожения; 39 - газовая печь распылитель ной сушилки.


Украинским научно-исследовательским институтом спиртовой и ликеро-водочной промышленности разработана технология получения кормового концентрата витамина В12 путем сбраживания мелассно-спиртовой барды смешанной культурой метанообразующих бактерий. Предварительно на мелассно-спиртовой барде выращивают кормовые дрожжи. После сепарирования дрожжей получают культуральную жидкость, содержащую 7-8 % сухих веществ. На этой жидкости выращивают метанообразующие бактерии и получают с 1 м1 исходной барды 1,5-2 г витамина В12.

Культуральную жидкость упаривают до содержания 60-70 % сухих веществ, смешивают с наполнителем и высушивают. В качестве наполнителя используют кукурузную муку, отруби и т.п. Сухой концентрат размалывают и расфасовывают в мешки. В 1 кг кормового концентрата содержится: витамина B12 18 - 20 мг, В2 41 мг, РР 146 мг и другие витамины. Срок хранения 12 месяцев.

Мезофильные и термофильные метаногенные бактерии, в том числе Metanobacterium thermoautotrophi-сит, Mb. thermoformicuin, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, Ms. vacuolata, Ms. mazei, Methanococcus hatopilus, синтезируют исключительно фактор III. Истинный витамин B12 образуют неспорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Путем создания искусственных биоценозов и подбора условий ферментации возможно целенаправленное регулирование процесса биосинтеза витамина В12. Новые разработки. Для удешевления производства витамина B12 и утилизации дешевого возобновляемого сырья изучалось образование корриноидов бактериями Prop, atidipropionici ATCC 25562 при росте на ксилозе как главной составной части гидролизатов гемицеллюлоз. Используя ксилозу, бактерии аккумулировали 0,35 мг корриноидов в одном литре среды без внесения солей Со. Для продукции корриноидов из ксилозы больше всего подходит UFR-реактор, работающий с ультрафильтрационной рециркуляцией клеток. Иммобилизованные клетки в Японии сразнивали стабильность и продуктивность биокатализатора при включении клеток Propionibacterium sp. в гели каппа - каррагенана, Na-альгината, агара и форполимерные уретановые смолы. Оптимальной подложкой служит форполимер PU-9, полимерная матрица которой не снижала активности включенных в нее клеток. В оптимальных условиях ферментации 5 г иммобилизованных клеток вновь синтезировали и экскретировали 900 мкг витамина за 18 дней повторной периодической ферментации, продемонстрировав возможность проведения многоступенчатого сложного синтеза (подобных примеров известно немного). Усовершенствование штаммов-продуцентов. В последние годы усовершенствование штаммов было достигнуто путем мутаций и селекции. Этим методом в 50 раз увеличена продуктивность по витамину у Ps. denitrificans. Для грамположительных бактерий Propionibac-terium, Bacillus, Streptotnyces применимо слияние протопластов, для грамотрицательных бактерий, например, Pseudomonas, доступны конъюгативные плазмиды. Пока весомых практических результатов этими новыми и мощными методами не получено, но начало таким работам положено. Клонировали 11 генов, кодирующих ферменты биосинтеза витамина B12 у бактерии Вас. megaterium. Полагают, что в геноме содержится всего 20-30 таких генов. Поэтому DNA Вас. megaterium подвергли фрагментированию и крупные фрагменты встраивали в плазмиды, которыми далее трансформировали мутанты-ауксотрофы по В12. Такие мутанты приобрели способность синтезировать витамин В12. Метод может быть использован для получения штамов-продуцентов в производственных масштабах. В бактерии Е. coll клонированы гены Prop, technicum, ответственные за синтез витамина В12. Бактерия Prop. technicum не содержит плазмид, поэтому из этого штамма выделили, очистили и частично разрушили ДНК, получив фрагменты 15 - 20 килобаз. Эти фрагменты включили в расщепленную плазмиду pBR 322 и полученной гибридной плазмидой трансформировали Е. соli. Новые трансформанты отличались от контрольного штамма в отношении морфологических и физиологических признаков.


2.4 Применение витамина В12


Цианокобаламин обладает выраженным липотропным действием, он предупреждает жировую инфильтрацию печени, повышает потребление кислорода клетками при острой и хронической гипоксии. Витамин B12 участвует в процессах трансметилирования, переноса водорода. Цианокобаламин принимает непосредственное участие в процессе синтеза метионина. Он принимает участие в синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеиновых кислот, необходимых для процесса эритропоэза, активно влияет на накопление в эритроцитах соединений, содержащих сульфгидрильные группы.

Ампулы с витамином B12 - это один из лекарственных препаратов, применяющийся в традиционной медицине для лечения различных гематологических заболеваний (рисунок 6). В частности, к ним относятся: хронические анемии, сопровождающиеся дефицитом витамина B12 (алиментарная макроцитарная анемия, болезнь Аддисона-Бирмера); железодефицитная анемия; апластическая анемия; геморрагическая анемия; анемии, вызванные воздействием токсичных веществ или сильнодействующих лекарственных препаратов.

Цианокобаламин помогает нормализовать пониженное кровяное давления. Стимулируя синтез протеина в человеческом организме, витамин В12 является своеобразным анаболиком. В самое последнее время получены данные, что витамин B12 имеет важное значение и для образования костей. Рост костей может происходить лишь в том случае, когда в остеобластах (клетках, из которых создаются кости) имеется достаточный запас витамина. Витамин В12 увеличивает количество лейкоцитов и ускоряет их деятельность, то есть воздействует на ретикулоэндотелиальную систему, благодаря данному препарату повышается сопротивляемость организма всем возможным заболеваниям. Недостаток витамина B12 значительно сокращает жизнь больных СПИДом. Витамин В12 стимулирует деятельность кровеносных органов и оказывает существенное влияние на способность человека к восприятию и усвоению новой информации. Его недостаток вызывает депрессивное состояние и рассредоточение внимания. Витамин B12 является одним из веществ, необходимых для здоровья репродуктивных органов. Очень важен для поддержания в хорошей форме женского и мужского здоровья он способен корректировать снижение содержания сперматозоидов в семенной жидкости.

Витамин B12 принимает непосредственное участие в процессе кроветворения: именно он способствует нормальному созреванию эритроцитов и увеличивает их толерантность к гемолизу. В результате применения витамина B12 активируется свертывающая система крови и повышается способность тканей организма к регенерации. Помимо этого, данный лекарственный препарат оказывает благотворное воздействие на функцию нервной системы и печени, а также понижает концентрацию холестерина в крови.

Кобаламин стимулирует деление клеток, от наличия его в организме зависит благополучие тех тканей, которые наиболее подвержены интенсивному делению: иммунные клетки, клетки крови и кожи, а также клетки, составляющие верхнюю часть кишечника. Витамин B12 влияет на миелиновую оболочку (покрытие нервов), и нехватка витамина вызывает необратимые разрушения нервов.


Рисунок 6 - Формы отпуска витамина В12 из аптек

Заключение


В ходе анализа литературы было рассмотрено несколько продуцентов витамина В 12. Наиболее активно продуцируют представители вид Propioni bacterium, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Одним из основных методов получения витамина В12 выбран был метод с помощью пропионовокислых бактерий, так как этот метод представляет штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Он наиболее выгоден и даёт получить довольно большой выход продукта, например, в России составил 58 мг/л витамина, а во Франции достигли невероятного высокого выхода - 216 мг/л. Изучены были недавно открыты новые аналоги витамина В12: три из них получены при частичном синтезе (фтор-метилфосфито-Р-кобаламид, диметилфосфито-Р-кобаламин, Fe-кобаламин) и один фактор VA выделенный из активного ила.

Так же широкое применение получил метод получения витамина В12 с помощью бактерии Pseudomonas denitrificans. Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных количествах витамин B12, но чаще всего используют мутант Ps. denitriflcans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В12 удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до 60 мг/л. Так же новый штамм бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д, используют для получения штамма бактерий, способных синтезировать витамин В 12 в более высокой концентрации, чем известные микробные продуценты.

Фармацевтические заводы (Борисовский завод медицинских препаратов, ОАО "Экзон", ОАО Несвижский завод медицинских препаратов, ПРУП "Минскинтеркапс", Гродненский завод медицинских препаратов, СООО "Лекфарм") покрывают потребность витамина В12, отечественного производства по доступной для населения цене и удовлетворяют потребности препарата для республики в целом.

Список использованных источников


1.Березовский, В.М. Химия витаминов / B.М. Березовский. - М.: Мир, 1973. - 587 с.

2.Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. - М., 1985. - 375 с.

3.Букин, В.Н. Микробиологический синтез витаминов / В.Н. Букин. - М., 1972. - 296 с.

4.Букин, В.Н. Биохимические и микробиологические основы промышленного получения витамина B12 методом термофильного метанового брожения. Сб. Витамин В12 и его применение в животноводстве / В.Н. Букин. - М., 1971. - 376 с.

.Быков, В.А. Производство белковых веществ / Биотехнология, под ред.Н.С. Егорова и В.Д. Самуилова; т. 5. - М., 1987. 307с.

.Быховский, В.Я. Микробиологический синтез витамина B12/В.Я. Быховский. - М., 1984. - Сер. V.

.Быховский, В.Я. Промышленное получение витамина B12 методом метанового брожения / В.Я. Быховский. - М.: Пущино, 1983. - 209 с.

.Викторов, П.И. Опыт применения продуктов микробиологического синтеза в кормопроизводстве / П.И. Викторов. - М., 1979. - 456 с.

.Воробьева, Л.И. Микробиологический синтез витаминов / Л.И. Воробьева. - М., 1982. - 267 с.

10.Воробьева, Л.И. Пропионовокислые бактерии и образование витамина B 12/Л.И. Воробьева. - М., 1976. - 315 с.

11.Гальцова, Г.Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов / Г.Д. Гальцова. - М., 1980. - 356 с.

.Гусев, М.В. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. - М.: Издат. Центр "Академия", 2003. - 464 с.

.Голубев, В.Н. Пищевая биотехнология / В.Н. Голубев. - М.: ДеЛи принт, 2001. - 123 с.

.Деймен, А. Н Промышленная микробиология / А.Н. Деймен. - М., 1984. - 216 с.

15.Диканская, Э.М. Биосинтез флавииов микроорганизмами / Э.М. Диканская. - М., 1972.Т. 3.

.Емцев, В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. - М.: Дрофа, 2005. - 445 с.

.Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. - М.: Издательская фирма "Наука" СПБ, 1995. - 319 с.

.Лысак, В.В. Микробиология: учебное пособие / В.В. Лысак. - Минск: БГУ, 2007.

.Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев. - М., 1982. - 256 с.

.Никтин, Г.А. Биохимические основы микробиологических производств: Учеб. пособие / Г.А. Никтин. - Киев: Вища школа. Головное изд-во, 1981. - 312 с.

.Письменный, В.В. Автоматизация процессов производства кормового концентрата витамина B12/В.В. Письменный. - М., 1985. Сер. IX.

.Поморцсва, Н.В. Перспективы получения витаминов и коферментов с помощью микроорганизмов / Н.В. Поморцсва. - М., 1986. № 8. - 968 - 987 с.

23.Робышева, 3.Н. Эргостерин дрожжей / З.Н. Робышева. - М., 1972. - Т. 3.

.Сартакова, О.Ю. Промышленная микробиология: учебное пособие по курсу "Основы микробиологии и биотехнологии" / О.Ю. Сартакова. - Барнаул: Изд. АлтГТУ, 2009. - 239 с.

25.Шавловский, Г.М. Механизм регуляции биосинтеза в микроорганизме/Г.М. Шавловский. - М., 1976. № 5. - 34с.

.Шильникова, А.А. Микробиология / А.А. Шильникова, Г.В. Годова. - Сер. М.: Дрофа, 2006. - 288 с.

27.Jeter, R., Е s с а 1 а п t е - S e m е г е n a J.С. et al. Synthesis and use of vitamin B12 // Escherichia coli and Salmonell typhimurium / R. Jeter. 1987. Vol. 1. P. - 551-556 c.

28.. Demaiti A. Z. Riboflavin oversynthesis. Ann. Rev. Microbiol / A. Z. Demaiti. 1972. - 390 c.

29.Vitamin-portal.ru [Электронный ресурс] / Витамин В12 (кобаламин, антианемический витамин). Режим доступа: <http://www.vitamin-portal.ru>. - Дата доступа 15. 05.2015

30.Studopedia.ru [Электронный ресурс] / Значение витамина В12 в организме человека. Режим доступа: http://studopedia.ru. - Дата доступа: 15. 05.2015.

31.Findpatent.ru [Электронный ресурс] / Новый штамм бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д. Режим доступа: http://www.findpatent.ru/patent/218/2180001.html. - <http://www.findpatent.ru/patent/218/2180001.html.%20-> Дата доступа: 15. 05.2015.