Методы повышения устойчивости растений к стрессовых факторам
Актуальность и
перспективы развития устойчивости растений к различным стрессовым факторам
Экстремальное влияние окружающей среды, такое как
засуха, избыточное увлажнение, воздействие высоких или низких температур,
засоление и кислотность почв приводит к значительным потерям
сельскохозяйственной продукции. Поэтому использование сортов растений,
толерантных к стрессовым воздействиям, имеет большое экономическое значение.
Сложность
селекционной работы по повышению устойчивости к абиотическим стрессам состоит в
наличии большого комплекса генов, контролирующих реакцию растений на
абиотические стрессы, многие из этих генов к тому же характеризуются сложной
регуляцией. Для достижения существенного увеличения стрессоустойчивости
необходим отбор по многим генам, контролирующим этот комплексный признак. Этим
в основном и объясняется отсутствие значительных достижений в традиционной
селекции растений по устойчивости к абиотическим стрессам. В связи со
значительным отрицательным экономическим эффектом абиотических стрессов в
последние годы внимание биотехнологов привлекают гены, изменяющие реакцию
растений на стрессовые условия. Результатом биотехнологических разработок по
модификации толерантности растений должно стать повышение стабильности урожая в
стрессовых условиях. Современная биотехнология в отличие от предыдущего этапа
молекулярно-генетических исследований, целью которого было определение генов,
изменяющих экспрессию в ответ на стресс, пытается связать изменения
физиологических и фенотипических признаков при стрессе с регуляцией
транскрипции, синтезом белков и их комплексов с устойчивостью вследствие
мутаций генов или генно-инженерных манипуляций.
Генетическая обусловленность
стрессоустойчивости растений. Механизм реализации эффектов
Можно
следующим образом сгруппировать гены, влияющие на толерантность растений к
абиотическим стрессам:
- гены,
которые кодируют ферменты, участвующие в синтезе различных видов
осмотических и других протекторов;
- гены,
кодирующие белки, которые активно синтезируются на поздних стадиях эмбриогенеза;
- регуляторные
гены, контролирующие развитие стрессового ответа;
- гены,
регулирующие уровень фитогормонов;
- гены
ответа на оксидативный стресс;
- гены
молекулярных шаперонов;
- гены,
кодирующие белки транспорта ионов (антипортеры и транспортеры, локализованные
в плазмалемме и мембранах вакуолей и органелл);
- другие.
В
стрессовых условиях у растений происходит индукция генов, которые контролируют
синтез соединений, вызывающих ответную реакцию растений на абиотические
стрессы, в том числе гены ферментов синтеза и деградации осмолитов –
низкомолекулярных органических соединений, не тормозящих в высоких
концентрациях протекание клеточного метаболизма. К таким осмолитам относятся
аминокислоты (пролин, аланин), четвертичные ионы (бетаин, глицинбетаин), сахара
и сахароспирты (маннитол, сорбитол, трегалоза, инозитол), углеводы. Они
понижают водный потенциал клеток, защищают ферменты от инактивации,
обеспечивают целостность структурных белков и пр.
Роль аминокислоты пролина в
создании солеустойчивых растений
Достаточно
интенсивно изучается роль пролина при абиотических стрессах: засолении, засухе,
пониженной и повышенной температуре. Считается, что пролин регулирует
кислотность цитозоля и поддерживает соотношение НАД+ / НАДH, усиливает
фотохимическую активность фотосистемы ІІ в мембранах тилакоидов и снижает
перекисное окисление липидов. Дополнительный синтез этой аминокислоты повышает
общую устойчивость растений к абиотическим стрессам, так как пролин защищает
мембраны, макромолекулы и структурные элементы клетки, приводя таким образом к
повышению неспецифической устойчивости.
Пролин
синтезируется из глутамина или орнитина. Показано, что в стрессовых условиях
доминирует синтез пролина из глутамина, и пирролин-5-карбоксилатсинтетаза
(P5CS), ключевой фермент биосинтеза пролина, играет главную роль при стрессовых
воздействиях. Были получены трансгенные растения картофеля, несущие ген P5CS
арабидопсиса, которые характеризовались повышенным содержанием пролина и
солеустойчивостью, тогда как у контрольных растений в условиях солевого стресса
урожайность падала на 63 %.
Ген
P5CS, клонированный из вигны борцелистной (Vigna aconitifolia), был использован
для трансформации табака, риса и пшеницы. В трансгенных растениях табака и
петунии наблюдали возрастание свободного пролина и повышение устойчивости к
засухе.
Другим
ферментом синтеза пролина является орнитинаминотрансфераза (ОАТ). Созданы
трансгенные растения Nicotiana plumbaginifolia, экспрессирующие ген ОАТ
арабидопсиса. Генетически модифицированные
растения отличались повышенной активностью ОАТ и уровнем свободного
пролина по сравнению с контролем. В условиях осмотического стресса
трансформанты имели большую биомассу и более высокую всхожесть семян, чем
нетрансгенные растения.
Другим
подходом для получения трансгенных растений с повышенным содержанием пролина
является ингибирование ферментов деградации пролина. Трансгенные растения
арабидопсиса с геном пролиндегидрогеназы были более устойчивы к заморозкам и
засолению по сравнению с контрольными растениями.
При
введении в растения табака фрагмента гена пролиндегидрогеназы были получены
растения с повышенным содержанием пролина. Повышенную солеустойчивость
демонстрировали как проростки, так и растения, выращенные до стадии двух
листьев в контрольных условиях, а затем пересаженные на среды с добавлением
300, 400 и 500 мМ хлорида натрия. В этих экспериментах контрольные растения
табака быстро погибали на среде с 400 мМ NaCl, ГМ растения выживали на среде с
500 мМ хлорида натрия в течение 2–3 нед. Трансгенные растения характеризовались
также повышенной устойчивостью к осмотическому стрессу.
Основные направления в создании
растений, устойчивых к тяжелым металлам
Интересным
фактом оказалась устойчивость трансгенных растений с повышенным уровнем пролина
к токсическим концентрациям солей тяжелых металлов – кадмия, никеля, свинца,
ртути. ГМ растения характеризовались меньшим отставанием в росте, признаки
хлороза у них были менее выражены или практически отсутствовали. По-видимому,
увеличенное содержание пролина способствует повышению неспецифической
стрессоустойчивости, возможно, за счет его антиоксидантной и осмопротекторной
функций.
Однако
при накоплении токсических концентраций тяжелых металлов, растению необходимо
поддерживать гомеостаз. Одним из таких приспособительных механизмов, является
синтез из глутатиона специальных пептидов – фитохелатинов (ФХ). ФХ связывают
тяжелые металлы, образуя комплексные соли, препятствуя, таким образом,
взаимодействию ионов металла с цитоплазматическими белками. Они формируют
комплексы с Cd, Ag, Bi, Pb, Zn, Cu, Hg, Au, As, Sb, Ni, Au, Sn, SeO3 2–, Sb,
Te, обеспечивая их детоксикацию.
Устойчивость
к тяжелым металлам обеспечивают также низкомолекулярные белки, богатые
цистеином – металлотионеины, способные связывать тяжелые металлы в цитозоле,
что играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза. Эти свойства
характерны и для ФХ, однако ферментативный синтез последних служит
отличительным признаком: металлотионеины являются продуктом трансляции с мРНК.
Положительные результаты были достигнуты при получении ГМ растений ярутки
полевой Thlaspi goesingense, экспрессирующих металлотионеиновый ген TgMTP1, что
обеспечивало перекачивание ионов никеля из внутриклеточного пространства в
вакуоли и увеличивало способность накапливать такие ионы.
Роль бетаинов в реализации
механизмов стрессоустойчивости растений
Установлено,
что другой совместимый осмолит – глицинбетаин – защищает некоторые ферменты
растений от высокотемпературной инактивации. Фотосистема II чувствительна к
воздействию высоких температур, а введение генов, экспрессия которых
увеличивала содержание в растениях бетаинов, обеспечивало защиту белков
фотосистемы. Синтез глицинбетаина у A. thaliana повышал толерантность к
солевому и холодовому стрессам. Внесение бактериального betА гена, кодирующего
холиндегидрогеназу, в растения табака привело к накоплению глицинбетаина и
повышению солеустойчивости трансгенных растений, увеличению зеленой массы ГМ
растений, выращенных при 300 мМ NaCl, на 80 % по сравнению с контролем. Показано
и повышение устойчивости растений к засухе при экспрессии этого гена в
растениях кукурузы. Рис метаболизирует бетаинальдегид в глицинбетаин и является
сравнительно солеустойчивым видом. При дополнительной экспрессии гена betА в
хлоропластах риса наблюдалось эффективное накопление глицинбетаина и повышение
солеустойчивости. Китайскими учеными при введении гена
бетаинальдегиддегидрогеназы шпината в растения табака показано повышение
синтеза глицинбетаина и, как следствие, повышение жароустойчивости: при
температуре 45°С растения были способны к фотосинтезу.
Введение
гена codА холиноксидазы в геном растений арабидопсиса и риса привело к
увеличению уровня бетаина в хлоропластах ГМ растений и более высокой
устойчивости при солевом, низко- и высокотемпературном стрессах, повышенном
уровнe освещения. В семенах растений A. thaliana, экспрессирующих этот ген,
отмечен высокий уровень накопления глицинбетаина, что коррелирует с большей
устойчивостью к воздействию повышенных температур, причем наблюдалась большая
устойчивость и к кратковременным воздействиям, и к более длительному действию
стрессового фактора.
Роль полиаминов и сахаров в
формировании устойчивости растений к засухе, засолению и низким температурам
В
качестве низкомолекулярных осмолитов, повышающих устойчивость растений, могут
выступать полиамины. Введение в геном растений риса и табака генов
S-аденозилметиониндекарбоксилазы (SAMDC) или аргининдекарбоксилазы (ADC) –
ключевых ферментов биосинтеза полиаминов – привело к усилению засухо- и
солеустойчивости, а также устойчивости к грибным патогенам.
Кроме
того, осморегуляция клеток растений осуществляется за счет синтеза сахаров или
сахароспиртов. Фруктаны – полисахариды, накапливающиеся во многих растениях и
бактериях. Примерно 45 000 видов растений используют фруктаны в качестве
основного типа углеводов. Поскольку фруктаны растворимы, они также могут играть
роль регуляторов осмотического давления. Чтобы создать трансгенные растения
табака, накапливающие фруктаны (в норме у табака они не синтезируются),
использовали ген SacB из Bacillus subtilis. В условиях засухи скорость роста ГМ
растений была выше на 55 %, а прирост массы на 59 % больше, чем у контрольных
растений. Трегалоза является дисахаридом, состоящим из двух соединенных
?-связями молекул глюкозы, и встречается у бактерий, грибов, насекомых и
некоторых групп растений. Виды растений, синтезирующих трегалозу, часто
являются очень устойчивыми к засухе. Гены E. coli otsA и otsB, кодирующие
соответственно трегалозо- 6-фосфатсинтазу и трегалозо-6-фосфатфосфатазу,
вводили в растения табака. У растений, которые экспрессируют ген дрожжей tps1,
кодирующий трегалозо-6-фосфатсинтазу, усиливался синтез трeгалозы и повышалась
устойчивость к засухе. У таких ГМ растений наблюдали также более эффективный
фотосинтез. Повышенная экспрессия бактериального гена биосинтеза трегалозы в
растениях риса вызвала значительное возрастание устойчивости полученных
растений к засолению, засухе и воздействию низких температур.
Маннитол
также может играть заметную роль в адаптации растений к неблагоприятным
воздействиям. Его роль как осмопротектора отмечена при засухе и засолении. В то
же время было показано, что маннитол оказывает антиоксидантный эффект в
стрессовых условиях. При введении в табак бактериального гена mtlD,
контролирующего синтез маннитол-1-фосфатдегидрогеназы, отмечено накопление
маннитола и повышение устойчивости к солевому стрессу. Интересен также и тот
факт, что растения баклажана, экспрессирующие бактериальный ген mtlD и
характеризующиеся повышенным содержанием маннитола, обладали повышенной
устойчивостью к трем грибным инфекциям, вызываемым Fusarium oxysporum,
Verticillium dahliae и Rhizoctonia solani. Таким образом, экспрессия этого гена
повышает устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам. Трансгенные
растения табака, несущие бактериальный ген левансахаразы (levU) Zymomonas
mobiles, характеризуются повышенным темпом роста в условиях осмотического
стресса, вызванного добавкой полиэтиленгликоля (ПЭГ), или холодового стресса.
При введении в табак гена imt1 инозитолметилтрансферазы, кодирующего синтез
?-инозитола, и гена stpd1, обеспечивающего синтез
сорбитол-6-фосфатдегидрогеназы, у полученных ГМ растений наблюдали повышение
солеустойчивости и устойчивости к водному стрессу.
Введение
гена imt, клонированного из хрустальной травки Mesembryanthemum crystallinum, в
геном сои привело к усилению синтеза маннитола в 10–80 раз и увеличению
стрессоустойчивости. Изучение ферментов гликолиза и ферментации спиртов
показало их связь с устойчивостью к анаэробному стрессу. ГМ растения табака и
риса с повышенной экспрессией гена pdc, кодирующего фермент пируватдекарбоксилазу,
и гена adh синтеза алкогольдегидрогеназы характеризовались устойчивостью к
затоплению.
Введение дополнительных генов для
создания холодоустойчивых растений
Для
получения засухоустойчивых трансгенных растений рассматривается подход, связанный
с введением различных генов: синтеза пролина – гена P5CS арабидопсиса или
Vigna, гена SacB, кодирующего синтез левансахаразы Bacillus subtilis, гена
соdА. Трансформация растений табака этими генами привела к получению линий,
характеризующихся повышенным содержанием пролина, глицинбетаина и фруктана
соответственно. Кроме засухоустойчивости, полученные трансгенные растения были
способны выдерживать воздействие отрицательных температур (–2 °С) при
экспозиции 24 ч без повреждения, в то время как контрольные растения после
такой обработки теряли тургор и погибали.
Адаптация
растений к заморозкам сопровождается экспрессией сor (cold-regulated) генов.
Ген сor15a арабидопсиса экспрессируются в ответ на низкие температуры, засуху и
на присутствие абсцизовой кислоты (АБК). Ряд этих генов экспрессируются только
при низкой температуре, но некоторые также индуцируются и другими видами
стрессов. Многие из этих белков являются дегидринами, и часть их обладает
криопротекторными свойствами. Были получены трансгенные растения арабидопсиса,
конститутивно экспрессирующие cor15a, исследование которых показало, что экспрессия
трансгена усиливает морозоустойчивость хлоропластов трансгенных растений in
vivo примерно на 2°С по сравнению с контрольными растениями.
Различные
механизмы адаптации растений к абиотическим стрессам дают представление о
комплексе генов, включающихся при стрессовых воздействиях, описывают получение
трансгенных растений, толерантных к этим стрессам. Таким образом, используя
накопленные данные, можно получать растения с устойчивостью к большому спектру
абиотических стрессовых воздействий.