трипсинизированный
Развитие методов вирусологического исследования и, прежде всего, методов культивирования тканей и клеток вне организма явилось залогом успехов, достигнутых в изучении вирусов за последние годы. Метод тканевых культур сыграл исключительную роль в изучении таких основных биологических проблем, как механизм репродукции вирусов и изменение их наследственных свойств. С помощью этого метода расшифрована этиология и разработана диагностика некоторых заболеваний, созданы высокоэффективные средства специфической профилактики при ряде вирусных инфекций. Значительная заселенность животного организма вирусами, свидетельствующая о широком распространении латентной формы взаимодействия в системе вирус - организм, была установлена благодаря методу культуры ткани.
Разработка относительно простых методов приготовления тканевых культур и большие возможности их применения в разнообразных исследованиях послужили причиной широкого внедрения их в вирусологию. В настоящее время трудно представить лабораторию, в которой могли бы выполняться современные вирусологические исследования без применения тканевых культур.
Значительные преимущества культуры ткани по сравнению с животными открыли новые возможности для количественного изучения вирусов и обеспечили проведение массовых вирусологических и иммунологических исследований.
Особое место культура ткани занимает и в производстве специфических лечебно-профилактических и диагностических вирусных препаратов. В течение относительно короткого периода культивирование вирусов стало одной из ведущих проблем вирусологии. Ее успехи являются результатом совместных усилий представителей многих наук и, прежде всего, цитологии, биохимии, вирусологии и генетики. Внимание этого раздела вирусологии сосредоточено на системе, которую схематично можно определить как среда - клетка - вирус.
Благоприятные результаты, полученные с помощью эффективных культуральных вакцин при многих вирусных заболеваниях человека и животных, привели к разработке методов культивирования вирусов в практических целях. Широкое применение в производстве вирусных препаратов получили первичные культуры.
В последнее время стали разрабатывать методы глубинного культивирования вирусов, успешное решение которых сулит заманчивые перспективы [1].
1.Обзор литературы
1.1 Краткая история развития метода культуры ткани
Последние годы ознаменовались достижениями в области изучения репродукции вирусов и разработки методов их выращивания с использованием тканевых культур. Дальнейшее развитие многих аспектов проблемы культивирования вирусов тесно связано с успехами общей и частной вирусологии, биохимии, цитологии и других наук.
Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур. Первые убедительные доказательства в пользу длительного поддержания тканей в жизнедеятельном состоянии вне организма представил Гаррисон в 1907 году. Предложенная им методика давала воспроизводимые результаты, благодаря чему получила признание и дальнейшее развитие.
Большая заслуга в деле разработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю. Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и жидкой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.
В 1928 году Мейтланд разработал очень простой метод культивирования тканей для размножения вируса. Метод заключается в суспендировании кусочков ткани в жидкой среде. С помощью этого метода в дальнейшем был проведен ряд интересных исследований. Практически сейчас нет ни одной области биологических исследований, где бы с успехом не применялся метод культивирования тканей [9].
1.2 Терминология клеточных культур
Быстрое развитие метода тканевых культур и применение его в различных отраслях биологической науки требует создания общепринятой терминологии.
июня 1966 года в Сан-Франциско на ежегодном совещании Ассоциации тканевых культур была предложена терминология для тканевых культур животных [10].
Тканевая культура - клетки, ткани или органы, эксплантированные из организма животного, сохраняющие жизнеспособность или растущие in vitro более чем 24 часа.
Культура клеток - клетки, растущие in vitro без образования ткани.
Культура ткани или органов - поддерживание ткани или целого органа, или его кусочков in vitro с обеспечением дифференциации или сохранением структуры и функции.
Эксплантат - изолированный кусочек ткани или органа, используемый для культивирования.
Монослой - клетки, растущие на поверхности в один слой.
Суспензионная культура - культура, в которой клетки сохраняют жизнеспособность и размножаются будучи взвешенными в питательной среде.
Первичная культура - культура, происходящая из клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной до тех пор, пока она не субкультивируется. Культуры, происходящие из эксплантатов опухолей, развившихся в организме животных после введения культивированных клеток, являются продолжение клеточной линии или штамма.
Линия клеток - первичная клетка со времени получения субкультуры; состоит из разнотипных клеток, первоначально присутствующих в первичной культуре.
Стабильная клеточная линия - клетки, способные субкультивироваться in vitro до бесконечности.
Штамм клеток - популяция однородных клеток (по одному или нескольким маркерам), сохраняющая специфические свойства в процессе последующего культивирования.
Субштамм - специфическая популяция клеток, выделенная из штамма путем изолирования отдельной клетки или группы клеток.
Клон - популяция клеток, происходящяя от одной клетки путем митоза.
Линия диплоидных клеток - клеточная линия, в которой по крайней мере 75% клеток обладают кариотипом нормальных клеток исходного вида.
Линия гетероплоидных клеток представляет собой популяцию, в которой менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом.
Эффективность посева - процент клеток, дающих начало колониям. При этом необходимо указывать общее число клеток в инокуляте, тип культурального сосуда и условия (среда, открытая или закрытая система, газовая фаза и т.д.).
Изменение культуры - устойчивое изменение свойств или поведения культуры, т.е. изменение морфологии, хромосомного состава, чувствительности к вирусам, пищевых потребностей, пролиферативной способности, характеристик злокачественности и т.д. Термин должен быть всегда квалифицирован точным описанием изменения, которое претерпела культура.
Клеточная трансформация - изменения, вызванные в клетках введением нового генетического материала. Природа и источник генетического материала, вызвавшего изменения, должны быть определены.
1.3 Требования к факторам внешней среды
Кроме питательных веществ, для сохранения жизнеспособности, роста и размножения клеток в культуре, а также для выполнения специфических функций требуются определенные физические и химические условия [12].
Температура является одним из важных условий нормальной жизнедеятельности клеток. Для большинства клеток млекопитающих и птиц оптимальная температура 36 - 38 0. В отличие от клеток холоднокровных позвоночных и насекомых имеют более высокий температурный оптимум и несколько хуже хранятся при низких положительных температурах.
Крайние температуры обратимости для клеток млекопитающих 42 0, а для клеток птиц 46 0. Фибробласты оказались более чувствительны к нагреванию (44 - 46 0), чем эпителиальные клетки.
При снижении температуры выращивания ниже оптимальной постепенно замедляются процессы обмена и происходит остановка роста. Охлаждение культур клеток до 4 - 5 0 не сопровождается заметным повреждением (кроме задержки клеточного деления) [7]. Установлено, что некоторые типы клеток чувствительны к процессам охлаждения. Если клетки охладить ниже точки замерзания, они разрушатся вследствие кристаллизации льда внутри цитоплазмы. Но при добавлении в среду какого-либо предохраняющего агента, например глицерина, и при быстром замораживании до очень низкой температуры (- 70 0) клетки могут сохраняться месяцами и после оттаивания не теряют способности к размножению[13].
Осматическое давление среды также является важным фактором, обуславливающим нормальную жизнедеятельность клеток животных в культуре. В питательных средах, так же как и в жидкостях животного организма, оно определяется концентрацией неорганических солей, и в первую очередь хлористого натрия. Однако органические вещества, особенно низкомолекулярные, как, например, глюкоза, также влияют на осматическое давление среды. Для клеток млекопитающих нормальное осматическое давление при 38 0 равно около 7,6 атм (соответствует давлению при точке замерзания около - 0,630). Клетки легко переносят колебания давления в пределах ± 10%. В действительности клетка может переносить значительно большие колебания давления, если они происходят не очень быстро. Следует поддерживать нормальное давление без особых колебаний[11].
Концентрация водородных ионов играет исключительную роль в обеспечении нормального метаболизма клеток. Клетки теплокровных животных размножаются наиболее интенсивно при нейтральном рН (6,9 - 7,1), хотя их размножение не прекращается при сдвиге рН в кислую или щелочную сторону (6,8 - 7,6). Следует отметить, что наиболее терпимы к изменению рН культуры клеток и органов и в меньшей степени однослойные культуры клеток. Клетки, растущие в суспензии, весьма чувствительны к отклонению рН за пределы границ оптимального роста.
Это объясняется тем, что в однослойной культуре и особенно в культуре клеток органов, клетки создают на своей поверхности «микроклимат», который несколько отличается от окружающей питательной среды, в том числе и по величине рН. В постоянно перевиваемой суспензии условия везде одинаковые, как в околоклеточном пространстве, так и вне его. Имеются доказательства, что рН среды может быть неодинаков для разных клеток. Для максимального размножения целого ряда перевиваемых клеток оптимальный рН среды оказался индивидуальным.
При культивировании эксплантатов тканей млекопитающих начальный рН питательной среды устанавливают, как правило, на более высоком уровне (7,2 - 7,8), чем в случае приготовления однослойных клеточных культур. Это связано с высоким соотношением ткани и питательной среды и резким снижением рН в первые сутки культивирования эксплантатов.
Уровень рН среды при первичной эксплантации устанавливают с учетом концентрации клеток, активности их метаболизма, состава питательной среды и условий аэрации [14].
Газовая среда. Многие исследователи отмечали важное значение газовой среды при культивировании клеток и тканей. Оказалось, что кислород необходим для сохранения жизнеспособности клеток и особенно для их размножения.
Интенсивность дыхания (потребление клеткой кислорода в единицу времени при определенной температуре и давлении) зависит от вида, возраста животных и вида ткани.
В основе возрастных различий в потреблении кислорода лежат особенности метаболизма эмбриональных и взрослых тканей. Ткани эмбрионов в отличие от тканей взрослых животных характеризуются преобладанием гликолиза. Поэтому насыщение питательной среды кислородом при культивировании тканей взрослых животных является более критическим фактором, чем при культивировании эмбриональных тканей.
Потребление кислорода различными тканями неодинаково.
В процессе культивирования клеток куринных эмбрионов эффект Пастера ослабляется.
Потребление кислорода тканевыми эксплантатами различных видов животных обратно пропорционально весу их тела [6].
Учитывая важное значение дыхания для многих культур тканей, было уделено внимание наиболее эффективному насыщению питательной среды кислородом. Связь между напряжением кислорода в среде и дыханием клеток представляет значительный интерес, так как кислород должен поступать в растворенном состоянии.
Высокая концентрация кислорода (80 - 95%) подавляла, а низкая (0,01%) стимулировала синтез ДНК в однослойной культуре клеток куриного эмбриона. Ввиду слабой диффузии кислорода в клетки для культур тканей и органов требуется значительно большее насыщение кислородом и рекомендовано применять карбоген (5% СО2 + О2).
В большинстве питательных сред СО2 выполняет функцию буфера, обеспечивая стабилизацию рН. Кроме этого, наличие СО2 в газовой среде улучшало переживание тканевых эксплантатов.
Имеется сообщение, что СО2 необходим для дифференциации тканей и играет роль в физиологической регуляции размножения клеток. Полагают, что при размножении клеток вне организма основная функция СО2 состоит в обеспечении синтеза предшественников пурина, пиримидина, щавелевоуксусной кислоты. Необходимое количество СО2 продуцируется самими клетками. Поэтому в закрытых сосудах при достаточной густоте посева клетки не нуждаются в притоке СО2, тогда как при выращивании их в открытых сосудах его может не хватить [2].
Другие неорганические вещества. Для всех клеток необходимо присутствие других неорганических веществ в дополнение к регулирующим осмотическое давление и концентрацию водородных ионов. Для большинства клеток животных необходимы ионы натрия, калия, кальция, магния, железа, карбонаты, фосфаты, сульфаты.
Ион натрия главным образом необходим для поддержания осмотического давления среды. Ион калия служит в клетке для этих же целей. Ионы кальция и магния необходимы для функции некоторых внутриклеточных энзимов, в то же время ион кальция может быть особенно связан с изменениями между состоянием цитоплазмы в виде золя или геля. Оба иона, как кальций, так и магний, необходимы для роста клеток на поверхности стекла. Железо необходимо для некоторых дыхательных пигментов, и в особенности цитохромов. Ион бикарбоната необходим для многих биохимических процессов в клетке и, кроме того, выполняет одну из главных функций буфера в среде. Ион фосфора необходим для обмена энергии, так как большая часть энергии клетки поддерживается в форме макроэргических фосфадных связей; он также играет роль буфера [6].
1.4 Пищевые потребности и некоторые особенности метаболизма клеток в культуре
Для биосинтетической деятельности клеток животных в культуре необходимо присутствие незаменимых аминокислот, углеводов, неорганических солей, витаминов и в большинстве случаев сывороточного белка. Наличие этих веществ в питательной среде обеспечивает пластическую и энергетическую потребности клеток животных. Необходимые для поддержания жизнедеятельности и размножения в культуре. Незначительные особенности метаболизма клеток in vitro и поразительное сходство пищевых потребностей клеток различного происхождения облегчили задачу создания высокоэффективных питательных сред широкого назначения.
Аминокислоты. Для роста и размножения клеток широкого спектра требуется, по меньшей мере, 13 аминокислот. Кроме 8-ми кислот необходимых организму (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин), клетки млекопитающих для размножения в культуре нуждаются еще в 5 аминокислотах: аргенине, цистине, глютамине, гистидине, тирозине.
Некоторые необходимые аминокислоты (гистидин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин) могут быть заменены соответствующими кетокислотами, которые с помощью клеточных трансаминаз превращаются в аминокислоты, подобно тому, как это происходит в организме.
Необходимость присутствия в среде 5 аминокислот, не требующихся для целого организма, вызвана различными причинами и связана, прежде всего, с их ограниченным синтезом клетками, как в организме, так и в культуре.
Из всех 13 аминокислот необходимых для размножения большинства культивируемых клеток, только глютамин подвергался активному превращению. Остальные аминокислоты главным образом включались в структурный клеточный белок.
Глютамин выполняет важную роль в метаболизме клеток в культуре, участвуя в образовании протеина и нуклеиновых кислот. Он превращается в глютаминовую и аспарагиновую кислоты, аспарагин, пролин и в меньшей степени - в серин и аланин. На долю аминного азота глютамина приходится более Ѕ всего азотного баланса.
Клетки из организма и выращенные в культуре не отличаются между собой по способности аккумулировать аминокислоты. Приблизительно 80% веса клеток составляет вода, в которой растворены метаболиты, поступившие из среды, а также синтезированные клетками. Разница между объемом среды и объемом воды в клетках огромна, что создает определенные трудности в накоплении в клетках жизненно важных метаболитов в необходимой концентрации.
Содержание аминокислот в культивируемых клетках находится в динамическом равновесии с окружающей средой.
Аминокислоты быстро проникают в клетки (70% от максимального значения за 15 минут) и выделяются в среду. Концентрация аминокислот в клетках в 3 - 50 раз выше, чем в среде и зависит от типа аминокислоты, концентрации ее в среде и характера клеток. Например, если в среде концентрация аминокислот 0,001 мМ и 10 мМ, то в клетках она увеличивается соответственно в 200 и 2 раза. Многие культуры клеток наиболее интенсивно потребляют из среды определенные аминокислоты, такие, как глютамин, лейцин, изолейцин, цистин, аргинин.
При концентрации в среде, сходной с жидкостями организма (около 0,1 мМ), большинство незаменимых аминокислот концентрируются в клетках в 5 -10 раз больше. Концентрация аминокислот, синтезируемых клетками, обычно превышает в 20 - 50 раз их содержание в среде. Однако, если соотношение клеток и среды слишком мало (1:2500 при 105 клеток/мл), их концентрация в клетках резко падает. Установлено, что синтез белка и размножение клеток в культуре происходит, если концентрация незаменимых аминокислот в клетках не ниже 0,01 - 0,04 мМ.
На содержание белка в клетках могут влиять различные факторы, такие, как тип клеток, плотность популяции и состав питательной среды. Поэтому потребление аминокислот при воспроизводстве клеток может быть различным.
Витамины. Для длительного роста в культуре клетки нуждаются в 8-ми витаминах: никотинамиде, тиамине, пантотенате, пиридоксале, рибофлавине, фолиевой кислоте, холине и инозитоле. Они росли с максимальной скоростью, если концентрация этих витаминов в среде была не ниже 10 -7 - 10 -8 г/мг.
За исключением холина и инозитола, потребность клеток в витаминах, как в организме, так и в культуре была одинаковой. Шесть витаминов являются составной частью коэнзимов, играющих важную роль в метаболизме клеток. Например, пиридоксаль имеет большое значение в биосинтезе аланина, серина, глицина и пролина. При недостатке пиридоксаля содержание этих аминокислот в клетках резко падает, и для поддержания роста клеток их следует вносить в среду.
Значение холина и инозитола в обмене веществ клеток в культуре не выяснено, хотя роль их доказывается дегенерацией клеток при отсутствии этих витаминов. Возможно, они необходимы культивируемым клеткам только при определенной плотности популяций.
Имеется мнение, что холин играет важную роль как источник метильных групп. Инозитол, витамин В12 и биотин не всегда были необходимы клеткам.
Из жирорастворимых витаминов чаще всего в состав сред включают витамины А, Д, Е и реже К, главным образом с целью поддержания специальных функций и дифференциации клеток.
Углеводы. При обычных условиях выращивания клетки получают энергию главным образом за счет гликолиза углеводов. В качестве энергетического материала чаще всего используют d-глюкозу, хотя она более или менее эффективно может быть заменена другими углеводами. Гликолиз усиливается с повышением интенсивности размножения клеток.
Концентрация в среде глюкозы, так же, как аминокислот влияет на скорость роста клеток. При культивировании клеток различного происхождения выявлена некоторая специфичность действия простых сахаров, проявляющаяся в изменении скорости роста и морфологии клеток.
Сывороточный белок. Почти все культуры клеток для поддержания жизнедеятельности и роста требуют наличия сывороточного белка или его компонентов. Лишь немногие специально адаптированные или селекционированные линии клеток могут обойтись без сывороточного фактора. Одна из причин неудач выращивания многих перевиваемых клеток в синтетических средах, по мнению Линга и сотр., состоит в том, что в таких средах в отличие от сывороточных сред, низкая концентрация аминного азота.
Известно, что белки, как таковые, не утилизируются клетками, и поэтому ростовой фактор сыворотки не является протеином, как таковым, а представляет собой низкомолекулярное соединение. Белки диализата сыворотки крови (плотность > 1,21) не заменяли нативной сыворотки при выращивании клеток печени кролика в первичной культуре.
Добавление в среду 10% нативной сыворотки крупного рогатого скота или других белков, выделенного из сыворотки плода коров, резко увеличивало синтез ДНК в культуре клеток эмбрионов крыс.
Синтез РНК усиливался сразу после смены среды и вторично перед началом синтеза ДНК. Через 48 часов после смены популяция клеток удваивалась. Оказалось, что фактор, стимулирующий метаболизм и пролиферацию клеток, содержится в сыворотке крупного рогатого скота.
Присутствие в среде определенного химического состава низкомолекулярных и высокомолекулярных гликопротеинов, полученных из сыворотки крови, улучшало рост клеток эмбрионов мыши в первичной культуре. Значение сывороточного белка в адгезии клеток с твердым субстратом хорошо известно.
В среде с сывороткой в начальный период культивирования клетки прикреплялись медленнее, но их количество постоянно увеличивалось, и они не отделялись от стекла. Прочная связь клеток со стеклом наступает лишь в присутствие сыворотки.
Клетки куриного эмбриона менее чувствительны к сывороточному фактору роста, чем клетки других животных [6].
1.5 Питательные среды и солевые растворы
Среда является одним из наиболее важных условий при культивировании клеток и тканей.
Идеальная среда должна быть точно определенной смесью химических веществ.
По количеству и качеству компонентов питательные среды для тканевых культур значительно различаются между собой. Они могут состоять из компонентов, химический состав которых точно известен. Такие среды принято называть синтетическими.
В целом клетки организма животного для своего развития нуждаются в естественной среде либо в среде, в которую добавлены некоторые естественные продукты.
Поэтому в большинстве случаев применяют синтетические среды не как таковые, а в смеси с сывороткой или другими биологическими продуктами. Основу любых питательных сред составляют растворы неорганических солей. Питательные среды различаются между собой не только по содержанию пищевых субстратов, но и по содержанию неорганических солей. Среды для кратковременного поддержания жизнедеятельности клеток имеют более простой состав, нежели среды, предназначенные для длительного размножения клеток. Состав питательных сред может зависеть также от характера культивируемых клеток.
Сбалансированные солевые растворы содержат основные ионы приблизительно в тех же количествах, что и в сыворотке крови. Они обеспечивают осмотическое давление, ионный баланс, рН среды. Интегрированная функция ионов в метаболизме клеток исключительно велика. Термин «сбалансированный» означает, что в растворе основные ионы содержатся в физиологических соотношениях, а суммарная концентрация их обеспечивает необходимое осмотическое давление и рН.
Так же как сыворотка крови, большинство питательных сред имеет хорошо сбалансированные фосфатно-карбонатные буферы. Такие среды быстро теряют СО2, и поэтому при их использовании тканевые культуры выращивают в герметически закрытых сосудах или содержат в инкубаторах с повышенным содержанием СО2 в атмосфере.
Первым солевым раствором, предназначенным для тканевых культур, был раствор Тироде. В дальнейшем для этой цели был предложен ряд солевых растворов, которые принципиально не различались между собой по обеспечению клеточного роста [9].
В настоящее время в качестве солевой основы при изготовлении питательных сред для культур клеток и тканей млекопитающих в основном применяют растворы Хэнкса и Эрла. Оба раствора имеют в своем составе бикарбонатный буфер. Однако давление СО2 и буферность раствора Хэнкса ниже, чем раствора Эрла.
В последнее время с успехом испытаны комбинированные органические буфера, среды которых наибольшего внимания заслуживает НЕРЕS-буфер. Оказалось, что сочетание 2 - 3 органических буферов эффективно стабилизирует рН питательных сред на различных уровнях в пределах 6,4 - 8,3. Среды с НЕРЕS-буфером оказались пригодными для выращивания многих первичных и перевиваемых клеток, как на стекле, так и в суспензии.
Питательные среды для тканевых культур млекопитающих. В течение длительного времени в качестве питательных сред для тканевых культур использовали естественные жидкости организма, смешанные с солевыми растворами. Однако это не всегда удовлетворяло исследователей ввиду сложности и нестандартности таких сред.
В настоящее время предложено большое количество синтетических сред, отличающихся между собой по числу и концентрации компонентов. Например, по количеству входящих в их состав аминокислот они различаются от минимального набора и умеренной концентрации до максимального набора и высокой концентрации. Большинство синтетических сред применяется вместе с сывороткой или различного рода белковыми гидролизатами, которые являются источником важных факторов питания.
Первый значительный успех в разработке искусственных питательных сред выпал на долю Фишера и Уайта.
По числу, входящих в состав компонентов, все синтетические среды можно разделить на «богатые» и «минимальные».
К богатым средам можно отнести среды 199, NСТС 109, F - 12, 7С и другие.
К минимальным средам следует, прежде всего, отнести среду Игла, Нэгла и МВ 752/I. Среда Игла является наипростейшей из всех известных синтетических сред. Она составлена на основе исследований, показавших, что для роста и размножения широкого спектра клеток требуется по меньшей мере 13 аминокислот (аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, цистин, метионин, тирозин, глютамин), 8 витаминов (тиамин, рибофлавин, холин, пантотенат, инозитол, фолиевая кислота, никотинамид, пиридоксаль), глюкоза и 6 неорганических ионов (натрий, калий, кальций, магний, хлор, фосфор).
Все сложные синтетические среды готовят в виде ряда основных растворов, которые затем объединяют вместе. Некоторые компоненты добавляют в среду непосредственно перед применением.
1.6 Соединение клеток в культуре
Получение достаточного количества изолированных неповрежденных клеток с целью культивирования оказалась сложной задачей. На результатах дезагрегации тканей сказывались многие факторы, связанные как с самими тканями (вид, возраст, физиологическое состояние донора, специфичность ткани), так и с условиями выделения клеток. Увеличение выхода и повышение жизнеспособности клеток зависело от знания наиболее эффективных средств и режимов диссоциации тканей на составные клеточные элементы.
Для объяснения природы сил, удерживающих клетки относительно друг друга, предложен ряд гипотез. Наиболее прочное соединение клеток могут обеспечить прямые химические связи (водородные, эфирные, иминные, амидные) благодаря комплементарному расположению активных групп (-ОН, - NН2 и - SН) или ионов на поверхности смежных клеток. Существует мнение, согласно которому на молекулярном уровне контакты всех типов клеток одинаковы, а специфичность взаимодействия различных типов клеток определяется расположением комплементарных групп на их поверхности. Имея одинаковый заряд (отрицательный), клетки должны отталкиваться друг от друга, на самом же деле они притягиваются друг к другу.
Существующие факты заставили предположить наличие сил притяжения, которые преодолевают электростатические силы отталкивания. С увеличением расстояния между клетками силы притяжения убывают медленнее, чем электростатические силы отталкивания. Силы взаимного притяжения возрастают с увеличением сходства в строении поверхности клеток. На основании данных литературы и собственных исследований с тканями эмбрионов Картис высказался в пользу физических сил (Ван-дер-Ваальса-Лондона), лежащих в основе межклеточных связей. Аналогичные данные были получены другими авторами.
Ослабление межклеточных связей при удалении или связывании кальция или других двухвалентных катионов породило гипотезу о важном значении кальциевых мостиков в связывании клеток между собой. Имеются также данные, указывающие на более существенную роль калия в соединении клеток по сравнению с кальцием.
Многие исследователи отдавали предпочтение идее, согласно которой между липопротеиновыми мембранами клеток находится «межклеточный цемент». Электронная микроскопия предоставила доказательства в пользу наличия пространства между клеточными мембранами, заполненного особым веществом. Обнаружение межклеточных веществ в разных тканях привело к мысли, что именно они ответственны за адгезию клеток. Несмотря на то, что во многих тканях клетки расположены очень тесно и между ними остается небольшое пространство, объяснимое межмолекулярными связями или физическими силами взаимодействия, предположение о межклеточном цементе не развеялось. В известной степени этому способствовала диссоциация тканей различными протеолитическими ферментами, в результате которой получали жизнеспособные клетки. В этих случаях диссоциация тканей ферментативным путем происходит благодаря разрушению химических связей между «цементом» и поверхностью клеток.
Механизм соединения клеток в ткани может сильно отличаться в зависимости от типа ткани, возраста животного, а также может быть различным у клеток нормальных и злокачественных тканей [2].
Известно, что протеолитические ферменты действуют главным образом на мертвые клетки и оказывают незначительное действие на жизнеспособность клетки.
Изменения хромосом в живых клетках при продолжительной инкубации в трипсине связаны с нарушением проницаемости клеточных мембран.
Идеально диспергирующие вещества должны действовать избирательно на межклеточные вещества и не должны проникать в клетки. Адсорбируясь на клеточной мембране, энзим может гидролизовать заново синтезируемое клеткой мукопротеиновое покрытие. При этих условиях клетка может истощить свои синтетические механизмы и утратить в силу повышенной проницаемости запасы важных метаболитов, прежде чем она восстановит свою целостность и проницаемость, необходимые для нормальной жизнедеятельности в культуре [3].
Таким образом, сохранение или восстановление нормальной проницаемости клеток является критическим фактором успешного выделения клеток, обладающих высокой жизнедеятельностью.
Для выделения жизнеспособных клеток из тканей животных применяют ферментативное переваривание, механическое расщепление, обработку веществами, связывающими двухвалентные катионы, и другие воздействия.
1.7 Первичные культуры
К первичным культурам относится, прежде всего, культура тканевых эксплантатов и органов. Это один из наиболее ранних методов тканевых культур, применяющихся до настоящего времени. В такой культуре в основном сохраняется жизнеспособность клеток, и лишь в опытах с некоторыми органами и тканями эмбрионов бывает выраженная пролиферация клеток и дифференциация тканей. В последнее время для различных целей стали применять суспензии свеже изолированных клеток. Этот метод отличается от предыдущего тем, что не ткани, а их составные элементы - клетки выращивают в толще питательной среды. Суспензия свеже изолированных клеток во многих случаях обнаружила хорошие субстратные свойства для размножения вирусов. И, наконец, наиболее распространенными представителями этой группы тканевых культур являются однослойные первичные культуры клеток. Культуры клеток, выращенные на стенке стеклянных сосудов, получили широкое применение в различных исследованиях [4]. Метод приготовления первичных однослойных культур клеток животных стал обычным в вирусологической практике. В таких культурах клетки располагаются непрерывным тонким слоем на поверхности стекла и представляют собой удобную модель для обнаружения вирусов и изучения их биологических свойств. В настоящее время первичные однослойные культуры занимают ведущее место в приготовлении многих вирусных препаратов [5].
Однослойные культуры
В настоящее время дезагрегацию тканей для приготовления первичных культур проводят, как правило, ферментативным путем.
Важное значение для получения жизнеспособных клеток имеет быстрое отделение клеток от диспергирующих растворов, особенно при ферментативной обработке ткани из-за увеличивающейся проницаемости и крайней нестойкости клеток. Кроме того, источником повреждения клеток могут служить также продукты распада самих клеток, из которых наиболее опасны нуклеазы.
С целью уменьшения повреждающего действия изолированные клетки отделяют центрифугированием, а остаточное действие фермента, адсорбированного клетками, ослабляют промыванием или нейтрализуют средой [7].
Первичные культуры клеток обычно выращивают в стеклянных сосудах, закрытых резиновыми пробками. Клетки прикрепляются лучше к мягким сортам стекла (содержащим больше ионов натрия), нежели к твердым, типа пирекс. При физиологических значениях рН клетки заряжены отрицательно, и их связь с отрицательно заряженными центрами стекла может осуществляться с помощью двухвалентных катионов (главным образом Са ++) [4].
Установлено, что клетки в культуре образуют макромолекулярные экссудаты, которые играют важную роль в адгезии с субстратом и избирательной сортировке клеток при реагрегации.
Прикрепление клеток к твердому субстрату не является жестким и не исключает возможности их передвижения вдоль его поверхности.
На стекле в отсутствие контактов с другими клетками поверхность клетки находится в непрерывном движении.
Клетки тканей взрослых животных прикрепляются к стеклу в меньшем количестве, чем клетки эмбриональных тканей. С возрастом животного способность к росту в культуре клеток различных тканей меняется неодинаково.
Однослойные культуры могут быть получены только при посеве определенного количества клеток на единицу поверхности сосуда. Недостаточное количество клеток, так как чрезмерный избыток их, тормозит рост культуры. Для клеток многих тканей оптимальная посевная концентрация находится в пределах 2 -5 Ч 10 5 / мл.
Несмотря на удовлетворительный рост клеток различных тканей в однослойной культуре, для культивирования вируса чаще всего используют культуры клеток почечной ткани или культуры клеток куриного эмбриона. Выбор этих тканей обусловлен следующими причинами: легкой дезагрегации тканей трипсином; относительной неприхотливости клеток к условиям культивирования; широким спектром чувствительности к вирусам.
Несмотря на общие принципы выращивания свежее изолированных клеток, в приготовлении однослойных культур клеток различных тканей животных имеются некоторые особенности.
Разработаны приемы, позволяющие наиболее эффективно получать и выращивать клетки различных тканей животных в первичной культуре. Такие разработки относятся, прежде всего, к приготовлению первичных культур клеток, получивших широкое применение в производстве биологических препаратов. Одной из наиболее универсальных и изученных культур является первичная культура клеток куриного эмбриона.
2. Материалы для приготовления культуры клеток
Солевой раствор Хэнкса содержит соли натрия, калия, магния и кальция, а также глюкозу. Обеспечивает сохранение рН, осмотического давления в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ.
,25% раствор трипсина использовали для дезагрегации ткани на отдельные клетки.
Для получения культуры клеток использовали флаконы для питательных сред и растворов, колбы для трипсинизации, пипетки, чашки Петри. Качество посуды имеет очень важное значение для успешного культивирования клеток in vitro.
Посуда должна быть стерильной и абсолютно чистой, потому что клетки очень чувствительны к токсическому действию минимальных примесей посторонних веществ.
Одним из обязательных условий успешной работы с культурой клеток является высокое качество воды. Для ополаскивания посуды используют дистиллированную воду.
Перед использованием посуду обрабатывают в 2%-ом растворе гидроокиси натрия 5-6 часов, ополаскивают 3-4 раза проточной водой, замачивают на ночь в моющий раствор, тщательно моют, промывают
-10 раз проточной водой, выдерживают 1-2 часа в растворе соляной кислоты, промывают 4-5 раз проточной водой и ополаскивают 5-6 раз дистиллированной водой.
Резиновые изделия (пробки, груши) сначала кипятят 1 час, а потом ополаскивают 3 раза дистиллированной водой, высушивают, заворачивают в пергаментную бумагу и стерилизуют в автоклаве.
Металлические инструменты моют горячей водой с мылом, промывают проточной и дистиллированной водой, стерилизуют кипячением в дистиллированной воде на протяжении 30 минут. Во время работы инструменты находятся в посуде с 960 - ым этиловым спиртом, перед использованием их прокаливают.
Куринные эмбрионы (получены из хозяйства благополучного по инфекционным заболеваниям птиц) 11-дневной инкубации овоскопировали. Отбирали яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечали границы воздушной камеры и расположение зародыша.
Поверхность скорлупы протирали йодированным спиртом.
Стерильными ножницами срезали скорлупу на 2 -3 мм выше границы воздушной камеры, разорвали подскорлупную и хориоалантоисную оболочки и за шейку извлекли эмбрион в стерильную чашку Петри. У эмбриона удалили головку, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожно-мышечный мешок перенесли в другую стерильную чашку Петри и измельчили ножницами на кусочки 3-4 мм.
Измельченную ткань 2-3 раза отмыли раствором Хэнкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и перенесли в колбу для трипсинизации. В колбу налили 0,25% раствор трипсина, подогретого до 37 0 С (соотношение ткани и трипсина 1:3), внесли стерильный магнит и поставили на магнитную мешалку. Трипсинизацию проводили дробно несколько раз по 5 минут. Трипсин с клетками, которые отделились, сливали через 3 слоя марли в колбу, которую помещали в холодильник для прекращения действия фермента. Трипсинизацию проводили 5 раз до полного истощения ткани.
Суспензию клеток разлили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин.
Надосадочную жидкость слили, к осадку клеток добавили небольшое количество ростовой среды.
Количество клеток считали в камере Горяева.
Количество клеток в 1 мл суспензии определяли по формуле:
Х = (А Ч 9 Ч 1000): 0,9, где
А - среднее количество клеток в одной камере;
,9 - объем камеры Горяева в мм3;
- количество мм3 в 1 см3;
- коэффициент разведения суспензии.
После этого суспензию клеток развели ростовой средой до оптимальной концентрации. Для уничтожения бактериальной микрофлоры к среде добавили антибиотики: 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина. Перелили в пробирку, добавили Геоссен (1 мл) и закрыли пробкой. На пробирке восковым карандашом провели продольную линию, указали число, положили в лоток продольной линией вверх под углом 50 и поместили в термостат при температуре 37 0 С.
Результаты собственных исследований: наблюдение за ростом монослоя проводили через 24-48 часов. Через 24 часа культивирования монослоя клетки частично прикрепились к стеклу. Через 48 часов наблюдали равномерный ост монослоя. В процессе культивирования цвет питательной среды не изменился.
Выводы
1.Быстрое развитие метода клеточных культур и их широкое применение в практической вирусологии связано с тем, что культура клеток является наиболее совершенной лабораторной системой для культивирования вирусов.
2.Приготовление первично-трипсинизированной культуры клеток является очень важным, т.к. из нее получают другие культуры клеток.
.Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды.
Список использованной литературы
1.Анджапаридзе О.Г. Использование культуры тканей в вирусологических исследованиях. - М., 1964
2.Маленков А.Г. Биофизика. - М., 1963
.Нортроп Д. Кристаллические ферменты. - М., 1950
.Паникар И.И. Практикум по ветеринарной вирусологии. - Харьков, 1990
.Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани. - М.: Колос, 1966
.Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976
.Соловьев В.Д. Тканевые культуры в вирусологии. - М., 1963
.Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. - М.: Агропромиздат, 1989
.Пол Д. Культура клеток и тканей: пер. с англ. - М.: Медгиз, 1963
.Фрешни Р. Культура животных клеток: пер. с англ. - М.: Мир, 1989
.Анджапаридзе О.Г. - «Вопросы вирусологии», 1973, №1, с. 102
.Антонов П., Дундаров С. - «Вопросы вирусологии», 1963, №2, с. 616
.Гендон Ю.З. - «Вопросы вирусологии», 1963, №2, с. 144
14. Соловьев В.Д., Жданов В.М. «Вестник Академии медицинских наук СССР», 1974, №1, с. 18