Тема: Екологія вірусів

  • Вид работы:
    Учебное пособие
  • Предмет:
    Биология
  • Язык:
    Украинский
  • Формат файла:
    MS Word
  • Размер файла:
    66,09 Кб
Екологія вірусів
Екологія вірусів
Вы можете узнать стоимость помощи в написании студенческой работы.
Помощь в написании работы, которую точно примут!

План

1. Вступ

. Екологія вірусів, основні терміни та поняття.

. Загальна характеристика та відомості про віруси.

.1 Вірусна морфологія.

.2 Структура вірусів.

.3 Структура та функції вірусних протеїнів.

.4 Склад та структура вірусних нуклеїнових кислот.

.5 Інші складові вірусів.

. Історія та сучасні принципи номенклатури та класифікації вірусів рослин.

.1 Фітовірусні родини та групи.

.2 Одноланцюгова РНК, без суперкапсиду, двофрагментна.

.3 Одноланцюгова РНК, без суперкапсида, трифрагментна.

. Функціональні особливості будови та експансії геному фітовірусів.

.1 Біологічне функціонування вірусних компонентів.

.2 Вірусне інфікування та вірусний синтез.

.3 Особливості реплікації фітовірусів із позитивним та негативним геномами.

.4 Функціональність продуктів вірусних генів.

.5 Загальний процес вірусного синтезу.

. Патогенез та передача вірусних інфекцій.

6.1 Вірусіндуковані симптоми на рослинах.

.2 Передача фітовірусів.

.3 Механічна передача вірусів через сік.

.4 Передача вірусів через насіння.

.5 Передача пилком.

.6 Передача комахами.

.7Передача кліщами.

.8Передача нематодами.

.9Передача грибами.

.10Передача омелою .

. Фізіологія вірусінфікованих рослин. Противірусний імунітет.

.1 Фізіологія вірусінфікованих рослин.

.2 Противірусний імунітет.

. Діагностика та ідентифікація вірусів.

.1 Полімеразно-ланцюгова реакція .

.2 Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції.

.3 Переваги методу ПЛР як методу діагностики інфекційних захворювань.

.4 Обмеження методу ПЛР.

. Мікрональне розмноження та оздоровлення рослин.

.1 Основні етапи мікроклонального розмноженн.

.2 Індукція розвитку пазушних меристем.

.3 Утворення придаткових пагонів.

.4 Регенерація рослин з калюсу.

.5 Основні етапи мікроклонального розмноження.

.6 Фактори, що впливають на процес мікроклонального розмноження.

.7 Одержання безвірусного посадкового матеріалу.

. Роль вірусів в біосфері.

.1 Чинники, що пов'язані з рослиною-господарем.

.2 Чинники, що впливають на сприйнятливість рослин до зараження.

.3 Чинники, пов'язані з вірусом і переносником.

.4 Шляхи розповсюдження вірусів рослин в природі та агроценозах.

Література.

1. Вступ

Наука, що розглядає питання про місце та роль вірусів рослин в біогеоценозі - називається "екологією вірусів". Перше чітке описання вірусного захворювання було зроблено в далекій давнині грецьким лікарем, кумиром олімпійських спортсменів того часу - Гіппократом. Історики медицини, вивчаючи його роботи показали, що ним було пророблено чітку характеристику паротиту із усіма симптомами хвороби, етапів розвитку хвороби, поясненням його етіології, особливо для маленьких дітей. Дуже багато лікарів та мікробіологів будували свої думки на аналогії між мікробними та вірусними хворобами, тому, що саме мікробіологи почали займатися вірусами. Світ вірусів та світ мікробів діаметрально протилежні один одному, і ці організми взагалі не схожі: їх фізіологія, структура та способи розмноження відрізняються. Для того, щоб це стало аксіомою, потрібно було багато часу. Так що ж таке вірус?

2. Екологія вірусів, основні терміни та поняття

Вірус - це біологічна неклітинна форма існування, яка характеризується облігатним, внутрішньоклітинним паразитизмом та антигенністю для всіх відомих тварин, рослин, бактерій, грибів, найпростіших та інших живих істот.

При цьому вони мають власний, нерідко унікальний геном і спроможні до відтворення лише в живих клітинах-господарях. Саме в останні дві декади 19-го століття були обргунтовані відомості про бактерії та їх роль, як патогенів. Це було повязано із запропонуванням методу іммерсійної мікроскопії та інших винаходів, що було повязано із імям Роберта Коха та інших науковців. Вік дійсної науки про віруси - нараховує трохи більше 100 років, коли у 1892 році наш співвітчизник Дмитро Йосипович Івановський в Київському університеті, захищав дисертацію на тему "О двух болезнях табака" і вперше говорив про дивного агента захворювання, що проходить крізь бактеріальний фільтр. Трохи пізніше у 1898-99 році голандський вчений Мартін Бейеринк показав, що цей агент являє собою не бактерію, як говорив Івановський, а інфекційний рідкий зачаток - contagium vivum fluidum. В цьому ж 1998 році два вчені Леффлер та Фрош показали, що збудник ящура рогатої худоби проходить через бактеріальний фільтр. Трохи пізніше було доведено, що і інші збудники хвороб тварин і рослин викликаються агентами, подібними за своїми властивостями. Згодом з"явились повідомлення про вірусну природу збудників корі, поліоміеліту, грипу, енцефаліту та ін. рирода таких збудників залишалась ще невивченою протягом 30-ти років, і навіть на початку тридцятих років всі спроби виділення вірусів із екстрактів рослин можна було порівнювати із "пошуками чорного кота в темному підвалі, коли ти не впевнений, що кішка там". Затишок у вивченні вірусів продовжувався до 40-вих років, поки не було описано моделі по їхньому виділенню, культивуванню та ідентифікації. В 1935 році Стенлі зконцентрував ВТМ, а інші вчені - Френкель-Конрат, Гірер та Шрамм в 1956 показали, що за інфекційність у віруса тютюнової мозаїки виступає РНК. Відомий французький вірусолог, Нобелевський лауреат Андре Львофф дослідив та описав віруси в двох варіантах. Перше із них - Вірус - це вірус, друге - так чи ні, у випадку віднесення вірусів до організмів, це справа смаку. Це був 1962 рік. Виникає питання, чому саме вірусологія, яка зародилася в надрах мікробіології, за період 25-30 років зробила такий потужний крок? Що до цього спонукало?

По-перше - по мірі скорочення ролі бактерій, найпростіших та грибів в інфекційній вірусології людини, тварин та рослин, для профілактики та лікування яких вже відомо багато біологічних та хіміотерапевтичних препаратів, відносна маса вірусів в інфекційній патології значно зросла. Проти багатьох вірусних захворювань наука ще не винайшли подібних препаратів, а хіміотерапія вірусних хвороб - явище тонке і робить ще тільки перші кроки.

По-друге - загальновідомо, що віруси - незалежна категорія нижчого ступеню існування. Завдяки відносній простоті їх широко використовують в якості біологічних моделей в молекулярній біології, генетиці, генній інженерії, біохімії, імунології та ін.

По-третє - віруси це модельна система по вивченню багатьох біологічних закономірностей з боку величезної користі людству. Роль вірусів, як складових біогеоценозу неперевершена. Відношення цих патогенів знаходить себе у багатьох розділах науки - медицині, легкій та харчовій промисловостях тощо.

Тільки у 40-ві роки нашого століття стало відомо, що майже 80% всіх інфекційних хвороб викликається вірусами, а не мікробами, як це вважали раніше. На вивченні вірусів та хвороб, що вони викликають, зконцентрувалось багато ведучих наукових установ у всіх країнах світу. В Україні це були Інститут інфекційних захворювань, Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного, Інститут епідеміології та ін. На базі КДУ ім. Тараса Шевченка у 60-ті роки створюється кафедра вірусології, на той час друга кафедра на весь Радянський Союз після МДУ ім. Ломоносова. Перелік описаних вірусних захворювань живих істот зростає кожен день. У теперішній час щодо вірусів рослин, так їх відомо вже більше 750 штук. І так в кожному розділі вірусології. На жаль це сумна статистика. Так, розглянувши саму розповсюджену вірусну інфекцію у людей - грип, протягом сторіччя, можна відмітити, що після описання цього вірусу у 1933 році Смітом в Англії, ця хвороба відома ще з 12 століття. Так, починаючи з 16 сторіччя, грип періодично вражував населення Европи, і пандемії періодично повторювались через 10-20 років. Одна із найнебезпечніших 6 сторінок історії - це "Іспанка", коли протягом двох років у 1918-1919 рр, грип вразив майже всіх людей земної кулі. Хворів кожний другий. В Европі з кожної 1000 населення померло 5 людей, а на всій земній кулі - 20 млн. Так, ще в середині 60-х років, визнано вірусну теорію етіології раку, лейкозів та інших злоякісних новоутворень. Таким чином, з розвитком вірусології повязано також вирішення важливої проблеми патології - розкриття природи раку. СНІД - синдром набутого імунодифіциту людини. Чума другого століття, вірусне захворювання, причиною якого є вірус імунодифіциту людини (ВІЛ). Описаний вперше у 80-ті роки і на даний час зустрічається майже по всій земній кулі. Як наслідок, викликає повне гальмування власного імунітету організму.

Щодо рослин-так практично кожна рослина має свій власний вірус, що призводить до значних змін у фізіології та втрат властивих функцій організму, і як наслідок для сільськогосподарських культур - втрати врожаїв та технологічної якості в досить великих відсотках. Взагалі, для кожного проживаючого на земній кулі організму є свій вірус. Не виключено, що і масове вимирання древніх плазунів могло бути повязано із розповсюдженням невідомого вірусу серед цих гігантів. Окремі вірусні захворювання з давніх часів використовувались людьми для своєї користі та навіть для розваг. Високоцінні та незвичайні по кольоровій гаммі смугасті тюльпани, виникли, як раз завдяки враженню цих рослин специфічними вірусами тюльпанів, що переносяться попелицями. Такі тюльпани, самих фантастичних кольорів, можна побачити на деяких полотнах Рембранта. Зараз це називають помилкою кольору, а в середньовіковій Голландії існував звичай, по якому наречена вважала себе щасливою тільки тоді, коли в її весільному букеті було декілька тюльпанів нової, незвичної кольорової гами. Щодо стратегіїї сучасної фітовірусології, то завдання та їх вирішення переплітаються із майже усіма біологічними науками. Так, питання щодо найсучасніших методів та їх використання - полімеразна ланцюгова реакція, реверстранскрипція, модифікації імуноферментного аналізу, електрофорезу та інші, то вони є направляючими у вирішенні проблем молекулярної генетики, біотехнології, фізіології, мікробіології та ін. Актуальним для всього світу питанням є створення трансгенних рослин, з метою покращення технологічних якостей сировини, стійкості до вірусів, бактерій, гербицидів та пестицидів, є питанням №1 для господарств всього світу.

3. Загальна характеристика та відомості про віруси

Біохімічний склад, морфологія та структура вірусів. Біологічна характеристика простих та складних вірусів по білкам, нуклеїновим кислотам та ліпідам. Загальні відомості про існуючі ферментні системи вірусів.

Вірус - це нуклеопротеїн, який може викликати захворювання. Він розмножується тільки у живих клітинах і такий малий у розмірах, що його неможливо побачити у світовий мікроскоп Загальна кількість вірусів на 1998 рік складала 2000, а нові віруси описуються кожного місяця. Біля третини описаних вірусів вражають рослини, викликаючи при цьому захворювання. Так, один вірус може заражувати один або цілу низку різних видів рослин, і при цьому кожен із видів вражається ще багатьма іншими вірусами. Цікавий той факт, що рослина може бути вражена в один і той же час декількома вірусами. Так, вірус являє собою як і мікроорганізми, агент, що викликає захворювання, Самі із нуклеїнової кислоти та білку. При цьому білок формує захисну зовнішню оболонку - капсид. Кристалографічний аналіз, в останні роки сучасної науки дає змогу уявити вигляд ззовні вірусної частки, а саме білкову упаковку. В одному вірусі генетичним матеріалом являється тільки один тип нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК, і більшість фітовірусів мають тільки один тип білку. Але існують і такі, що мають два і більше різних білків. Віруси на відміну від інших біологічних форм існування та життя не діляться і не утворюють спеціальних репродуктивних структур, таких як спори у бактерій. Вони репродукують себе використовуючи клітину-господаря і всі її необхідні для цього цикли і субстанції. Віруси викликають захворювання поїдаючи клітини, або інтоксикуючи їх, вони використовуючи різні клітинні субстанції для своїх потреб - реплікації, та інше, вимотують клітини порушуючи притаманні їм фізіологічні функції, впливаючи негативно в цілому на весь організм.

Віруси - це не клітини, і вони як такі із них не складаються.

3.1 Вірусна морфологія

Фітовіруси бувають різної форми та розмірів. Близько половини їх видовжені - нитковидні або паличковидні, інші - сферичні (ізометричні або поліедричні), або утворюють собою бациловидні часточки. Деякі видовжені віруси являють собою структури в середньому 15 х 300 нм, але такі, які являють собою гнучкі, тонкі і більш довгі палички - на 10-13 нм ширші, а в довжині складають 480-2000 нм. Наприклад, Рабдовіруси невеличкі, бациловидної форми, циліндричні, близько в 3 -5 разів довші відносно ширини (52-75 на 300-380 нм). Більшість сферичних вірусів мають в поперечнику від 17 нм (сателітний вірус некрозу тютюну), до 60 нм (вірус раневих пухлин ). Вірус бронзовості томатів вкритий зовнішньою мембраною і має гнучку, сферичну форму біля 100 в діаметрі. Багато рослинних вірусів мають фрагментований геном, що складається із двух або більше нукленових фрагментів, що упаковані в один і той же білок, але по різному. Віруси складаються із двох складових - одна 195 на 25 нм, і другої - 43 на 25 нм, а вірус мозаїки люцерни складається із 4- х компонентів, що відрізняються по розміру. Цікавий також факт про те, що деякі ізометричні віруси мають два або три різних компонентів однієї форми, але вміщуючи при цьому різні по довжині нуклеїновокислотні фрагменти. Для таких мульті компонентних вірусів всі ці ділянки нуклеїнової кислоти повинні бути в рослині, для того, щоб вірус був спроможен до свого нормального відтворення - репродукції. Вірусна поверхня або капсид складається із різної кількості білкових складових, які розміщуються спірально на видовжених вірусах і упаковані по сторонах сферичних вірусів. На поперечному зрізі видовжених вірусних частинок вони виглядають як порожня трубка із білковими субстанціями, формуючи при цьому оболонку для нуклеїнової кислоти, яка також спіралізована і упакована серед білкових закінчень капсомерів, що формують капсид. Що стосується сферичних вірусів, то на зрізі також спостерігається утворення із білкових субодиниць навколо нуклеїнової кислоти, яка в свою чергу упакована невідомим манером. У випадку Рабдовірусів і деяких сферичних відмічається про структурну належність ліпопротеїдного капсиду - або суперкапсиду. Внутрі суперкапсиду вміщується нуклеокапсид, що складається із нуклеїнової кислоти і білкових субодиниць.

3.2 Структура вірусів

Кожен фітовірус складається як мінімум із нуклеїнової кислоти і білку. Деякі віруси складаються більш ніж із одної форми нуклеїнової кислоти та білків, деякі вміщують ліпіди та мембранні ліпіди. Нуклеїнова кислота займає від 5 до 40% вірусу, білок - 60-95%. Найменшу кількість нуклеїнової кислоти знайдено у паличковидних, видовжених вірусах, а найбільшу кількість нуклеїнової кислоти мають сферичні віруси. Загальна маса нуклеопротеїну вірусних частинок варіюєж від 4,6 до 73 млн. Да, а маса очищенної НК складає в середньому 1-3 млн. Да. на вірусну частку для більшості вірусів, але деякі мають і 6 млн. Да, а 12-ти компонентна нуклеїнова кислота одного вірусу, що вражує тютюн (wound tumor virus) складає 16 млн. Да. Цікаво те, що всі нуклеїнові кислоти вірусів в нативному вигляді, досить невеликих розмірів, тому, що вони специфічно упаковані.


Вірусні білки, як і всі білки, складаються із амінокислот, яких також відомо 20, як і для інших істот. Сіквенс амінокислот вірусного білку залежить від послідовності нуклеотидів в генетичному матеріалі і установлює природу даного білку. Так, вірусний капсид фітовірусів складається із капсомерів, що повторюються. Вміст амінокислот та сіквенс капсомерів одного і того ж вірусу постійний, але відмінний для інших вірусів, навіть до іншого штаму одного і того ж вірусу. Також слід відмітити, що амінокислотний склад і сіквенс різних вірусних білків однієї вірусної частинки буде різним, не говорячи про другі вірусні частинки. Склад та сиквенс амінокислот вже відомий для багатьох вірусних білків. Наприклад, білкова субодиниця ВТМ складається із 158 амінокислот із молекулярною масою - 17,6 кДа. В білку ВТМ білкові субодиниці розміщуються у вигляді спіралі, вміщуючи 16 та 1/3 субодиниць на один оберт (або 49 субодиниць на 3 оберти). Внутрішній канал ВТМ складає 4 нм, а загальний діаметр вірусної частинки складє 18 нм. Кожна вірусна частинка вміщує біля 130 обертів спіралі із білковими субодиницями. Нуклеїнова кислота в свій час упакована ретельно між біками. У рабдовірусів спіральний нуклеопротеїн вкритий мембраною. У поліедричних фітовірусів білкові субодиниці упаковані ретельно в угрупування, що складаються із 20 чи іноді більше фасеток, формуючи капсид, що вкриває нуклеїнову кислоту. Якщо розглянути в порівнянні кількість білків, що притаманні для різних організмів та форм існування, то виявляються дуже цікаві факти.10 Майже всі віруси кодують білок чи білки необхідні для реплікації вірусного геному. В деяких вірусах присутні також і ферменти. Один чи декілька вірус-кодуємих білків складають капсид, що вкриває геномну нуклеїнову кислоту. Але все ж таки віруси спроможні кодувати білки із іншими функціями, наприклад: - Рух чи транспорт - спроможність вірусного транспорту від клітини до клітини. - Передача - можливість передачі безхребетними чи грибними векторами. - Білковий процессінг - активність протеази, що розділяє поліпротеїн на функціональні продукти.

3.4 Склад та структура вірусних нуклеїнових кислот

Майже всі віруси рослин включають до свого геному рибонуклеїнову кислоту, але близько 80 вірусів включають ДНК. Обидві нуклеїнові кислоти довгі, спіралізовані і вміщують сотні, а частіше тисячі своїх субодиниць - нуклеотидів. Кожен нуклеотид складається із кільцевої структури, що називається основою, азотиста основа в свій час звязана із пятивуглецевим цукром - рибозою в РНК, та дезоксирибозою в ДНК, який в свою чергу звязаний із фосфорною кислотою. Цукровий залишок одного нуклеотиду реагує із фосфатом другого нуклеотиду, і так повторюється багато разів, формуючи ланцюг РНК або ДНК. Так, в молекулі РНК вірусів тільки одна із чотирьох основ - аденін, гуанін, цитозин та урацил можуть контактувати із кожною молекулою рибози. Перші два - А та Г - це пуріни, а інші - У та Ц - піримідини. Хімічні формули цих основ, що представлені в молекулі РНК представляють собою слідучі структури. Структура ДНК подібна до РНК, але є дві маленькі відмінності, які дуже важливі - одна молекула кисню відсутня в гідроксильному радикалі цукру, та друге - урацил переструкторований в метилурацил, краще відомий як тиамін - Т. Розміри і РНК і ДНК виражаються в Дальтонах (як до речі і білки), або в кількості основ - в кілобазах - кб - для одноланцюгових РНК або ДНК і в парних кілобазах - пкб - для дволанцюгових РНК чи ДНК. Дуже важливим фактом являється те, що рослини та неінфіковані їхні клітини вміщують тільки дволанцюгову ДНК і одноланцюгову РНК. Більшість рослинних вірусів (-540) вміщують одноланцюгову РНК, але 40 фітовірусів вміщують і дволанцюгову форму РНК, 30 штук вміщують дволанцюгову ДНК, і біля 50 вміщують одноланцюгову ДНК.

3.5 Інші складові вірусів

Крім води, рослинна клітина вміщує багату кількість різноманітних невеликих по масі складових субстанцій. Всі вони включені до таких клітинних процесів, як метаболізм, синтез амінокислот, основ нуклеїнових кислот, цукрів, жирних кислот та ін., що використовуються в синтезі макромолекул для будови клітинних структур. Багато клітин також, вміщують невеликі за масою субстанції, що включені в спеціалізовані клітинні процеси. Для прикладу, віруси - вміщують дуже мало таких субстанцій. Такі віруси, що мають суперкапсид - капсид із білку з ліпідами, вміщують ту ж саму пропорцію води, що і клітини - біля 3 - 4 г/г сухої маси. А віруси, що немають такого ліпопротеїну - біля 0,7 - 1,5г, так само як і розчинні клітинні білки. Деякі рослинні віруси вміщують двовалентні іони металів, часто Кальцій 2+, в специфічних ділянках своєї структури, що позитивно впливає на увторення стійкої структури вірусного капсиду. Деякі фітовіруси мають специфічні домени - цинковий палець, в білку, що включений до упаковки нуклеїнової спіралі, що специфічно звязаний із атомом цинку. Декілька вірусів вміщують поліаміни, які допомогають їм у стабілізації РНК в вірусній частці. На заключення, віруси мають слідуючі характеристики, в порівнянні із клітинами: - Крім води, вірус складаєтья із одного виду нуклеїнової кислоти і білку (чи білків), які структурно побудовані із тих же самих нуклеотидів та амінокислот, що знайдені в клітинах. - Деякі віруси мають ліпопротеїновий капсид з ліпідами, що звично мають клітинне походження і складають клітинні мембрани. - Кількість води залежить від того, чи має вірус ліпопротеїн побудований за схожістю до клітини, або до розчинних клітинних білків. - Як і клітини, віруси вміщують низькомолекулярні компоненти, відмінні від води. Невеличкі кількості іонів металів та поліамінів, що можуть бути присутніми у вірусах, мають більше відношення до структурної організації вірусу ніж до його метаболічних функцій. вірус інфекція рослина біосфера

4. Історія та сучасні принципи номенклатури та класифікації вірусів рослин

Поняття нових некласифікованих вірусів. Спільні та відмінні риси щодо інших класифікацій фітопатології.

В 1966 році був створений Комітет по номенклатурі вірусів. В 1973 році його перейменували в Міжнародний комітет по таксономії вірусів МКТВ (International Committee on Taxonomy of Viruses ICTV). Завдання даного комітету є підготовка та видавництво праць по удосконаленню 12 таксономії та номенклатурі вірусів. Правила що встановлює ця організація є обовязковими для всіх наукових публікацій в міжнародних журналах. Існувало багато варіантів класифікацій вірусів взагалі, наприклад класифікації по Брауну, Метьюзу, Балтімору. На даний час однією із нових являється класифікація по Франкі (1991). На останньому засіданні виконавчого комітету МКТВ було затверджено універсальну таксономічну систему яка представлена 3 порядками, 64 родинами і 233 роди (втому числі 24 плаваючих роди, що не ввійшли ні водну родину) вірусів тварин, рослин та мікроорганізмів. Система містить сотні поки що некласифікованих вірусів в звязку з відсутності даних про їх властивості. Всі віруси належать до царства - Vira. Це царство розподіляється на РНК та ДНК вмістні віруси. Надалі віруси розподіляються на одно та дволанцюгові по структурі нукленової кислоти, або від заряду таких - негативний геном чи позитивний. Також іде розподілення по морфології - нитковидні, видовжені чи ізометричні. Але також слід замітити, що до одних і тих же груп можуть відноситись віруси, що реплікуються через фермент полімеразу (+РНК або ДНК віруси), або через реверстранскриптазу (-РНК чи ДНК віруси). Більшість вірусів, як відомо, складаються із нуклеїнової кислоти та білкового капсиду, що її вкриває, але є розподілення також на такі, що мають суперкапсид. Деякі віруси мають свій геном в одній часточці (моногеномні), але існують і такі, що мають свій геном в багатьох частках вірусів (мультигеномні). Він розподіляється на дві, три рідше на чотири часточки. Інші характеристики в класифікації вірусів включають в себе симетрію спіралі у ізометричних вірусів, розміри вірусів, а також інші фізичні, хімічні та біологічні властивості. Порядок вірусів є зібрання родин з загальними характеристиками, що відрізняються від інших порядків та родин. Він позначається іменуванням з суфіксом -virales. Віруси рослин обєднані в три порядка: Caudovirales , що включає родини Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae ; порядок Mononegavirales включає в себе Paramyxoviridae, Phabdoviridae, Bornaviridae і Filoviridаe; порядок Nidovirales який включає роди Coronaviridae і Alteriviridae. Родини, підродини обєднують роди вірусів з загальними характеристиками, що відрізняються від властивостей інших родин. Вони позначаються суфіксом -viridae. Більшість родин відрізняються від інших морфологією віріона, структурою геному, або стратегією реплікації. Роди вірусів представляють собою групу вірусів, що мають загальні характеристики, які мають загальні характеристики і відрізняються від вірусів інших родів. Вони позначаються суфіксом -virus. Вид вирусів. Видовий таксон є найбільш важливою одиницею в системі класифікації. Визначення виду вірусу Вірусний вид є політипічною 13 категорією, що складає схожу лінію реплікації і займає особливу екологічну нішу. Члени цього класу визначаються більше ніж по одному признаку. Фітовірусологи вважають, що концепція видів для фітовірусів являється не досить досконалою. В основному із-за механізму розмноження - на відміну від багатьох інших груп організмів. Практично кожного тижня у світі стає відомо про нові і нові віруси, серед яких вагоме місце займають фітовіруси. Такі віруси мусять бути класифіковані і віднесені до певної вірусної групи. Певний час досліджує мі віруси являються не класифікованими і досконально вивчаються. Не слід забувати, про високий рівень штамоспецифічності серед вірусів. Нерідко нові віруси можуть являти собою якийсь окремий ізолят вже відомого вірусу. В даний час для таксономічних цілей використовується багато характеристик вірусів: морфологія (розмір, форма віріона, наявність оболонки, структура капсиду), фізико-хімічні властивості (молекулярна маса, коефіцієнт седиментації, стійкість до розчинників), тип геномної НК, розмір генома в тисячах пар основ, кількість ниток НК, лінійність або кільцевидність, нуклеотидну послідовність, співвідношення Г+Ц, властивості білків (кількість, розмір та функціональна активність структурних білків, наявність ферментів, амінокислотна послідовність). Більшість фітовірусів мають назву, що походить від зовнішніх симптом захворювання, що вони викликають. Віруси рослин угруповані на відміну від інших вірусів у групи. Назва вірусологічних груп походить як правило від першого хазяїну, де їх було виявлено. Наприклад, вірус викликаючий мозаїчне захворювання тютюну - названий вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) (tobacco mosaic virus), а вірусологічна група таких вірусів названа - Тобамовірус, вірус, що викликає бронзовість томатів - tomato sрotted wilt virus - Тосповірус, і т.д. Конгресом було вирішено забороняти давати фітовірусам офіціальні назви, але віруси досі називають по-різному, нерідко по-місцевому, в основному на англійській мові. Такі назви часто включають імена або основну рослину, на якій його вперше було виявлено. Як уже зазначалося найбільш направляючими дослідженнями по класифікації вірусів являються сіквенс нуклеотидів. Такі дослідження дають змогу уявити про дійсний еволюційний звязок серед царства Vira.

4.1 Фітовірусні родини та групи

Одноланцюгова РНК, без суперкапсидна, однофрагментна.

1) Група Потівірус - У-вірус картоплі. Розміри 680 - 900 х 12 нм.

) Група Потексвірус - Х-вірус картоплі.14 Розміри 470 - 580 х 11 - 13 нм.

) Група Клостеровірус - вірус жовтянниці цукрового буряку. Розміри 1100 - 2000 х 12 нм.

) Група Карлавірус - вірус штрихуватої мозаїки конюшини. Розміри 610 - 700 х 12 - 13 нм, РНК 7,4 - 7,7 кб. ( Також існують групи Капілловірус та Тріховірус, що має величезну подібність, але і відмінність - в сіквенсі білку капсиду).

) Група Тобамовірус - вірус тютюнової мозаїки. Розміри - 300 х 18, м.м. вірусу - 39 млн. Да.

) Група Кармовірус - вірус крапчатості гвоздики.

) Група Лютеовірус - вірус західної мозаїки цукрового буряку. Ізометричні, 25 - 30 нм.

) Група вірусу хлорозу кукурудзи.

) Група Некровірус - вірус некрозу тютюну.

)Група вірусу жовтої крапчатості пастернаку.

)Група Собемовірус - вірус мозаїки корвячого гороху.

)Група Томбусвірус - вірус кустистої карликовості томатів.

)Група Тімовірус - вірус жовтої мозаїки турнепсу.

4.2 Одноланцюгова РНК, без суперкапсиду, двофрагментна

)Група Бімовірус - вірус жовтої мозаїки ячменю. Розміри першої частки 550 - 700 х 12 нм, друга 275 - 300 х 12 нм.

15)Група Фуровірус - вірус золотої штрихуватості проса. Розміри 65 - 390 х 18 - 24 нм в діаметрі. 16)Група Тобравірус - вірус погремковості тютюну. Розміри першої частки 190 х 22, другої 100 х 22 нм.

)Група Діантовірус - вірус некротичної мозаїки конюшини.

)Група Комовірус - вірус мозаїки корвячого гороху. Діаметр 30 нм.

)Група Неповірус - вірус мозаїки арабісу. Діаметр 30 нм.

)Група Фабавірус - вірус сильного пригнічення бобів. Розміри 30 нм.

)Група вірусу мозаїчних енацій гороху.

4.3 Одноланцюгова РНК, без суперкапсида, трифрагментна

)Група Хордеівірус - вірус штрихуватості ячменю.

Три частки складають 100 - 150 х 20 нм.

)Група Кукумовірус - вірус огіркової мозаїки. Розміри 29 нм в діаметрі.

)Група Бромовірус - вірус мозаки костра. Розміри 26 - 35 нм.

)Група Іларвірус - вірус некротичної пламистості сливи. Розміри 20 - 32 нм.

)Група вірусу мозаїки люцерни. Розміри 30 - 57 х 18 нм. Одноланцюгова РНК, без суперкапсиду, чотирифрагментна

)Група Тенуівірус - вірус штрихуватості кукурудзи. Розміри 290 - 2100 нм. Дволанцюгова ДНК, без суперкапсиду

)Група Баднавірус - вірус пухлин стебла кокосу. Розміри 30 - 100 х 300 нм.

)Група Каулімовірус - вірус мозаїки кольорової капусти. Розміри 50 нм. Одноланцюгова ДНК, без суперкапсиду

)Група Гемінівірус - вірус штрихуватості кукурудзи. Розміри 20 нм в діаметрі. Дволанцюгова РНК, без суперкапсиду

)Група Криптовірус - криптовірус буряку. Розміри 50 - 75 нм.

)Група Реовірус - вірус стерильності проса. Розміри 65 - 70 нм.16 Одноланцюгова РНК, із суперкапсидом

)Група Тосповірус - вірус бронзовості томатів. Розміри 80 - 110 нм.

)Група Рабдовірус - вірус мозаїки кукурудзи. Розміри 200 - 500 х 50 - 95 нм.

5. Функціональні особливості будови та експансії геному фітовірусів

Біологічне функціонування вірусних компонентів. Їхнє кодування. Вірусне інфікування та вірусний синтез. Особливості реплікації фітовірусів із позитивним та негативним геномами. Процеси синтезу вірусних білків в клітині - господарі. Загальний процес вірусного синтезу.

5.1 Біологічне функціонування вірусних компонентів

Їхнє кодування. Білок капсиду вірусів виконує не тільки протекторну функцію нуклеїнової кислоти, а й виступає важливим фактором у питанні передачі вірусу і симптомів, які він викликає. Білок як такий, не має власної інфекційності, але його присутність значно підсилює інфекційність нуклеїнової кислоти, яка за її виступає. Згадаймо також, що у вірусів рослин це в більшості випадків - РНК. Деякі віруси також вміщують транскриптази (РНК-полімераза)- ферменти, які їм необхідні для розмноження та інфекційного процесу. Вірусна РНК являється переносником всіх вірусних генетичних детермінант. Прояв всіх властивих характеристик залежить від послідовностей нуклеотидів в певній зоні РНК, які мають залежність також при синтезі з неї в майбутньому білку або ферменту. Це називається кодуванням і слід помітити, що ідентичним для всіх живих істот та вірусів. Генетичний код складається із складових одиниць - кодонів. Кожний кодон вміщує три сусідні нуклеотиди (триплет), що кодує певну амінокислоту білку, що буде синтезований. Кількість РНК, що вміщується у кожному вірусі показує в середньому довжину, число нуклеотидів вірусної нуклеїнової кислоти. По кількості кодонів можна вирахувати кількість амінокислот, що кодується вірусом. Важливо відмітити про існування вірусного ферменту - РНК полімерази (РНК синтетази або РНК реплікази), що необхідний для реплікації РНК вірусу. Специфічні вірусні білки та їх роль, що кодуються вірусною нуклеїновою кислотою ще досі невідома. 17 На даний час вже відомо і показано про роль вірусних білків в процесах вірусного транспорту через клітинні мембрани, інші білки включені до процесу переносу вірусів різними векторами, участь при реплікації нуклеїнових кислот, а саме видовищне - це утворення вірусних включень в рослинних клітинах, функція та роль яких ще досі являється невідомою. Отже, як вже говорилося, в клітинах рослин, що інфіковані вірусом результатом являється дезорганізація та порушення нормальних метаболічних процесів в інфікованій паренхімі або спеціалізованих тканинах та клітинах. Такі зміни викликаються повальною присутністю та відтворенням вірусів, і ще також, деструктивним або токсичним ефектами в додаток, що ініціюються присутністю вірус-синтезоаних білків або їхніми продуктами, хоча таких не було ще знайдено на сьогодні.

5.2 Вірусне інфікування та вірусний синтез

Фітовіруси проникають в клітини тільки (1998) через пошкодження, що зроблені механічно або векторами, або через проникнення до пилку рослин. Щодо розгляду процесу реплікації РНК вірусу, то нуклеїнова кислота вірусу перш за все звільняється від капсидного білку, що її вкриває (роздягається). Цей процес індукує активацію вірусної РНК полімерази. Цей фермент формує комплементарну РНК (дзеркальну копію). Ця перша нова РНК не вірусна, певний час зв'язана із комплементарною копією материнської РНК. З часом, дві форми РНК розділяються, продукуючи при цьому інфекційну вірусну РНК та дзеркальний (-) ланцюг РНК, що виступає в ролі матриці для синтезу (+) вірусної РНК. У деяких вірусів реплікація проходить трохи по іншій схемі, ніж було наведено вище. У вірусів, в яких геном представлений у двох чи більше вірусних частках, цікавим являється те, що вони повинні бути присутніми в одній і тій же клітині рослини одночасно. Це необхідно не тільки для реплікації вірусу, а й для розвитку інфекційного процесу. У одноланцюгових, (-) геномних РНК вірусів із сімейства Рабдовіріде, РНК не інфекційна, бо вона негативного заряду. Така РНК повинна бути транскрибована (переписана) в (+) ланцюгову РНК, за допомогою ферменту транскриптази, що кодується та переноситься вірусом. Із такої (+) РНК, що синтезована в клітині формуються вірусні (-) РНК. У випадку дволанцюгових РНК, на прикладі ізометричних вірусів, РНК сегментується у самому ж вірусі. Вона являє собою не інфекційну форму і залежить від реплікативних процесів клітини-господаря, а також від ферменту транскрипази, який також вміщується у вірусі. Він копіює геномні РНК у інформаційні РНК. Далі після активації ферменту проходить ініціація інфекції. Для вірусної реплікації вірусів із геномом, що представлений дволанцюговою ДНК властиво проникнення в клітину, процес роздягання 18 вірусу, проникнення в ядро клітини-господаря, де проходить дуже важливий і непростий процес формування так званої суперспіралізованої молекули (комплексу), пізніше формуючи мініхромосому. Далі проходить перенесення та формування двох одноланцюгових РНК. Менша за розмірами РНК транспортується в цитоплазму, де вона транслюється, утворюючи при цьому вірус-кодовані білки. Більша молекула РНК також транспортується в теж саме місце цитоплазми, але з нею проходить процес інкапсидації капсидним білками і використання її як матриці для зворотної транскрипції у повну молекулу вірусної дволанцюгової ДНК. Варіант реплікації одноланцюгової ДНК, то цей процес ще досі являється неоднозначно описаним. Існують відомості про те, що одноланцюгова ДНК реплікується формуючи при цьому кільцеву структуру, що продукує мультиметричний (-) ланцюг, що виступає в ролі матриці для синтезу мультиметричних (+) ланцюгів, які далі розпадаються, формуючи певної довжини (+) ланцюги.

5.3 Особливості реплікації фітовірусів із позитивним та негативним геномами

Процеси синтезу вірусних білків в клітині - господарі. Вірусний геном вміщує всю інформацію, необхідну для реплікації in vitro. Чи буде нуклеїнова кислота інфекційна чи ні залежить від двох факторів - фізична стабільність і різновидність. В першому випадку все залежить від стану фосфодиефірних звязків. Чи не зруйновані вони під впливом фізичних, хімічних факторів, чи ферментами. В другому випадку все залежить від різновиддя НК вірусу. Число генів, що знайдені у послідовностях фітовірусів коливається від одного - вірус-сателіт вірусу некрозу тютюну, до 12 для деяких реовірусів. Більшість одноланцюгових (+) РНК вірусних геномів кодують 7 білків. В додаток, слід зауважити, що кожна НК в ділянці кодування білку, має cis- кодон із сайтом розпізнавання та контролю функцій, що важливо для вірусної реплікації.

Цікавий факт показали вчені дослідивши економію використання геному фітовірусів. Так, геном фітовірусів використовується набагато компактніше в порівнянні із іншими вірусами:

* Кодуючі послідовності переважно компактно розміщені із невеликою кількістю некодуючих нуклеотидів між ними.

* Кодуючі регіони двох генів можуть частково перекриватись.

* Спільне використання термінуючих послідовностей при синтезі білків різної молекулярної маси та призначення.

* Функціональний вірусний фермент може використовувати клітинний білок в комбінації із вірусним поліпептидом.

* Регуляторні функції у послідовностях нуклеотидів можуть перекриватись із кодуючими послідовностями.

* Некодуючі послідовності 5 та 3 кінців одноланцюгових РНК вірусів можуть відповідати більш ніж за одну функцію.

5.4 Функціональність продуктів вірусних генів

). Структурні білки - капсидні білки маленьких вірусів; - матриксні або суперкапсидні білки реовірусів а також тих вірусів, що мають ліпопротеїнову мембрану (суперкапсид);

). Ферменти - протеази; - ферменти, що використовуються у синтезі нуклеїнових кислот (полімерази, РНК-зал-РНК-пол або репліказа, РНК-зал- ДНК-пол або зворотна транскриптаза).

). Білки руху вірусів та білки передачі - це специфічні вірусні білки, що зустрічаються в деяких вірусних групах і являються необхідним фактором для транспорту по рослині-господарю. Інші продукти вірусних генів являються допоміжними для передачі вірусів безхребетними переносниками (попелицями, кліщами, цикадками тощо). Також вірусні білки можуть бути включені до процесу передачі грибами.

). Не ферментні білки при синтезі РНК - 5VP білок, що знайдений у деяких вірусів і виступає у ролі праймеру.

). Капсидний білок Іларвірусної групи - приймає участь у ініціації інфекції з боку вірусної РНК.

). Білки, що розпізнають клітину-господаря - по зовнішній поверхні клітини. Висновок: слід відмітити про те, що тільки дві функції вірусних білків являються загальними для всіх вірусів, виключаючи віруси-сателліти. Відомі білки капсиду та ферменти, що включені до процесів синтезу геномів. Все більша кількість вірусів показує необхідність використання білків руху для транспорту по рослинному організму. Властивості рослинного організму, що використовуються вірусом. Так само як і інші віруси, віруси рослин прямо залежні від життєдіяльності рослинних клітин в багатьох моментах реплікації.

). Віруси використовують амінокислоти та нуклеотиди, що синтезовані клітинами для побудови своїх власних білків та нуклеїнових кислот. Цікавий факт про те, що деякі спеціалізовані компоненти що кодуються самим вірусом, синтезуються також клітиною-господарем.

). Енергетика - яка необхідна для синтезу білку та нуклеїнових кислот черпається із клітинних джерел, звично у вигляді нуклеозидтрифосфатів.


5.5 Загальний процес вірусного синтезу

Після того, як нова вірусна нуклеїнова кислота синтезована, певна її частина транслюється, тим самим примушуючи клітину господаря синтезувати білкові молекули, що кодовані цією нуклеїновою кислотою. Синтез білку в здорових клітинах залежить від присутності амінокислот та кооперації рибосом, інформаційної РНК та транспортних РНК. Кожна тРНК специфічна для одної амінокислоти, що підносить її до визначеного місця іРНК. Яка в свою чергу синтезується у ядрі і повністю подібна до коду ДНК. Вона кодує вид білку, що буде синтезований із певної її послідовності. Рибосоми в свою чергу рухаються вздовж іРНК і визначають енергетику та формування із амінокислот білку. У випадку синтезу вірусного білку, частина вірусного коду РНК для вірусного білку відіграє роль іРНК. Вірус, як вже говорилось використовує клітинні амінокислоти, рибосоми та тРНК, але і свої власні субстанції - іРНК та білки, що він формує спеціально для капсиду або для інших цілей. Коли вірусна нуклеїнова кислота та білок вже синтезовані, то НК починає організовувати навколо себе білковий капсид і як результат отримуємо вже зібраний (цілий) вірус - віріон. Дуже важливо і цікаво знати про те, що місце синтезу білку та нуклеїнової кислоти вірусу, а тим паче місце кінцевої збірки віріонів являється строго специфічним для кожного вірусу і відрізняється за класифікаційними ознаками груп фітовірусів. Так, наприклад, у більшості РНК-вмісних фітовірусів, НК при звільненні від білкового капсиду реплікується в цитоплазмі, де вона також виступає іРНК, кооперує із рибосомами і тРНК, продукуючи при цьому білкові субодиниці. Збірка віріонів також проходить в цитоплазмі. У випадку інших вірусів, наприклад з одноланцюговою ДНК, і синтез і збірка віріонів проходить як досліджено в ядрі, із якого вірусні частинки виходять до цитоплазми.21 Перші синтезовані вірусні частки зявляються вже через 10 годин після зараження рослини вірусом. Вірусні часточки виявляються як поодиноко так і в групах чи скопиченнях, утворюють кристалоподібні включення в клітинах, як правило в цитоплазмі чи ядрі.

6. Патогенез та передача вірусних інфекцій

Транслокація та розповсюдження вірусів в клітинах. Симптоми рослин індуковані фітовірусами. Вегетативна та механічна передача вірусів. Передача вірусів через насіневий матеріал, пилком, комахами, кліщами, нематодами, грибами та ін. Попередження вірусних інфекцій.

В процесі вірусного інфікування рослини, вірус рухається із однієї клітини до іншої, при цьому відбувається його розмноження. Віруси транспортуються від клітини до клітини в основному через плазмодесми - специфічні містки між контактуючими клітинами. Віруси розмножуються в паренхімі кожної клітини, що вони інфікували. Так, в паренхімних тканинах листка вірус рухається приблизно 1 мм або 8 - 10 клітин в день. Важливо відмітити про те, як віруси використовують системні комплекси рослини, яку вони інфікують. У випадку транспорту їм необхідно досягти флоеми, по якій вони дуже швидко розповсюджуються на довгі відстані по рослині. Але ж все таки, більшість вірусів потребує 2 - 5 днів щоб розповсюдитись в рослині із місця його інокуляції (листка). У випадку проникнення вірусу у флоему він досить швидко попадає у всі вегетуючі частини (апікальна меристема наприклад) та органи рослини - бульби, різоми. З флоеми, вірус розповсюджується системно по рослині і проникає по- новому в паренхімні клітини через плазмодесми. Далі, розвиток локальних пошкоджень - вірусних симптомів - являється проявою локалізації вірусу в даному місці рослини. Для певної кількості вірусних захворювань, властивий подальший розвиток інфекції та її вихід за межі локальних некротичних утворень (наприклад на листках). При системних вірусних інфекціях, деякі віруси лімітовані розповсюдженням по флоемі та декількома шарами паренхімних клітин. Так, віруси, що викликають мозаїчні хвороби у рослин вражають тканини у вигляді штрихуватості, тобто із різноманітною, але структурованою локалізацією. Відомо, що вірус-інфіковані клітини по типу мозаїки, вміщують від 100 тисяч до 10 млн вірусних часток на клітину. Відомо також, що вірусні частки можуть інфікувати до 100% рослинних клітин. Деякі із них заповнюють тільки певні частини тканин, інші із яких являються безвірусними. Щодо апікальних меристем рослин, то вони можуть 22 також інфікуватись деякими вірусами, але в більшості випадків вони являються вільними від вірусів.

6.1 Вірусіндуковані симптоми на рослинах

Майже всі віруси рослин викликають певним чином скручування, карликовість та інші симптоми, що в кінці кінців проявляється на фізіології всієї рослини. Віруси значно знижують строк життя рослин, хоча рідко і призводять рослину до загибелі. Про такі впливи широко відомо і вони добре спостерігаються. Найбільше розповсюджені симптоми на вірусінфікованих рослинах на листках, але деякі віруси викликають зміни у морфології та анатомії стебла, плодів та коренів, навіть іноді незалежно від їхньої прояви на листках. Майже при всіх вірусних інфекціях рослин, що виявляються на полях (агроценозах), віруси присутні у всьому рослинному організмі, це - системна інфекція, а такого роду симптоми називаються - системними. У багатьох рослин, що були заражені штучно вірусами, вірус викликає розвиток маленьких, хлоротичних чи некротичних утворень тільки у місцях проникнення (локальна інфекція). Такі симптоми називаються - локальними.

З іншого боку слід відмітити, що деколи віруси вражають різні рослини зовсім не проявляючи розвитку зовнішніх симптомів. Такі віруси називають - латентними, а рослини, що їх вражають - безсимптомними переносниками.

В інших випадках, зустрічаються випадки, коли рослини, які проявляють зовнішні вірусні симптоми, часом (під впливом різних екологічних факторів - різниця температур, вологість…) взагалі не проявляють симптомів ураження. В такому випадку такі симптоми називають - маскованими.

І на кінець, часто вірусні симптоми можуть проявлятись в різній формі, після моменту проникнення вірусу в рослину. Вони можуть сильно прогресувати, приводячи до значних порушень метаболізму рослини і до її швидкої загибелі.

Найбільш відомими вірусними симптомами, що являються системними є - мозаїки та кільцева плямистість. Мозаїки характеризуються світло-зеленими, жовтими чи білими смугами, що чередуються із нормальними зеленими на листках чи плодах, чи просто більш світлішими зонами в порівнянні із нормальними кольорами квіток чи плодів. В залежності від інтенсивності чи штрихуватості цих зон, мозаїчні симптоми можна розподілити на - штрихувату, кільцеву, міжжилкову, хлоротичну. Кільцева плямистість характеризується появою хлоротичних чи кільцевих утворень на листках, іноді на стеблах чи плодах. Нерідко при подібних захворюваннях, рослина з часом може втрачати ці специфічні симптоми, але не вірус, який викликає це захворювання. Велику кількість інших вірусних симптомів можна дуже широко охарактеризувати. До них можна віднести карликовість, пожовтіння, енації, пухлини, розсихання стебла. Такі симптоми можуть бути в той же самий час в комплексі із іншими симптомами нарізних органах рослини (листки, стебла, корні). Іллюстративний матеріал - відображає вірусні симптоми карликовості рису та морфологію вірусного патогену - вірусу штрихуватості рису - 290 - 2100 нм довжиною. Іллюстративний матеріал - відображає (а) утворення галлів на коренях конюшини при вірусному інфікуванні. (в) - листок рису та утворення на ньому хлоротичних симптомів. (с) - хлороз рису. (д) - очищені вірусні частки вірусу галової карликовості рису. Іллюстративний матеріал - захворювання різоманія цукрових буряків, що викликається вірусом жовтої некротичності судин буряків - зліва і контрольні - справа. Іллюстративний матеріал - вірусні симптоми на бобових листках та плодах. Внизу - вірусні симптоми, що викликаються на сливі - вірусом віспи сливи, та вірусні симптоми на абрикосових плодах та кісточках. Іллюстративний матеріал - вірус огіркової мозаїки та симптоми, що він викликає на листках огірків. Інфіковані симптомні листки перцю та томатів. Внизу - некротичні пагони картоплі при вірусному інфікуванні У-вірусом картоплі.

6.2 Передача фітовірусів

Фітовіруси переносяться від однієї рослини іншій багатьма шляхами. Серед таких, відомі шляхи передачі - вегетативно, механічно через сік рослин, насіння, омелою (повиликою), та специфічними комахами - кліщами, нематодами та грибами. Розглянемо вегетативну передачу. В будь-якому із варіантів вегетативного розмноження сільськогосподарських та інших культур, що широко використовується в народному господарстві, а саме - розмноження брунькуванням, живцюванням або зрізами, чи у варіанті використання бульб, цибульками, різомами, слід говорити про те, що у разі первинного інфікування цих материнських рослинних форм, присутність вірусу в наступних поколіннях буде спостерігатись 100 відсотково. Відмічаючи про такий факт повального інфікування при розмноженні вегетативно, слід відмітити про те, що такий шлях розмноження (наприклад, картопля - бульбами) являється широко застосовуючим у господарствах, і важливо знати про те, що цей шлях не гарантує отримання високоякісних рослин у варіанті вірусного інфікування. Навіть у варіанті використовування точки росту чи апікальної меристеми із інфікованої вірусом рослини для 24 подальшого розмноження може бути досить не ефективним у варіанті отримання чистих від вірусу рослин. Передача вірусів також може спостерігатись шляхом контактів коренів між різними рослинами, особливо серед дерев. Для деяких вірусів дерев цей шлях являється тільки єдиним, що описані на даний час.

6.3 Механічна передача вірусів через сік

Механічна передача фітовірусів в природних умовах прямим контактом через сік від однієї рослини до іншої не досить притаманна і не досить актуальна. Таку передачу вірусів можна спостерігати при впливі сильних вітрів, коли мають місце сильні пошкодження рослин та їх органів. В цьому випадку можна говорити про передачу вірусів, шляхом прямих контактів інфікованої та здорової рослин. Також слід відмітити про передачу вірусів через садовий інвентар (лопати, граблі, культиватори), руками, у варіанті харчування тварин, коли сік потрапляє на здорові рослини, тим самим уражуючи їх. Такі віруси, як Х-вірус картоплі, вірус тютюнової мозаїки, ВОМ - переносяться через сік рослин на полях і призводять до великих втрат врожаїв. Велике значення має механічна передача при вивченні вірусів при штучному зараженні. Слід зазначити, що таксономічна спорідненість у вірусів та рослини- індикатора не дуже важлива. Мається на увазі, коли вірус одного виду рослини пасується на не специфічній рослині - вірус, що вражає травянисті рослини чи дерева переноситься на неспоріднені рослини - овочі, квіти чи злакові. Але ж, все таки, деякі віруси, і особливо рослини із корою, дуже важко пасуються і деколи являється не можливим їх передати через сік.

6.4 Передача вірусів через насіння

Більш ніж 100 фітовірусів передаються через насіння. Як правило, тільки невелика кількість (1 - 30%) насіння спроможна переносити в собі вірус. Але іноді вірус переноситься насінням у 100% випадків. Велика залежність у варіанті зараженості насіння відіграє процес інфікування рослини на певній стадії онтогенезу. Найбільш враженим являється насіння, коли рослина була заражена в момент формування овули, але відомі випадки, коли це ж проходить на стадії формування безпосередньо насіння та формування квітки чи на стадії цвітіння. Нерідко вірус інфікуючи насіння, при їхньому проростанні проявляє свою активність, негативно вливаючи на проростання та утворення живців рослин.

6.5 Передача пилком

Вірус інфікує пилок рослин. При цьому, як результат, іде інфікування насіння, і далі проростаючої із неї рослини. Такий шлях передачі, відомий наприклад для вірусу некротичної плямистості сливи у варіанті інфікування черешні.

6.6 Передача комахами

Цей варіант передачі вірусів, без сумнівів, являється одним із самих розповсюджених для агроценозів. До передачі вірусів спроможні представники деяких груп комах . Група Homoptera включає в себе попелиць (Aphididae), листоїдів (Cicadellidae) та представників (Delphacidae), та інших основних представників переносників вірусів. Також треба відмітити інших представників цієї групи - білокрилки (Aleurodidae), що переносять звично Гемінівіруси та деякі інші, борошнисті жуки (Coccoidae), та представники Membracidae. Певна кількість векторів належать до іншої групи - Hemiptera, Thysanoptera, Coleoptera. Цікавий факт про те, що навіть коники спроможні до переносу деяких вірусів також. Найбільш стратегічними векторами вірусів являються в першу чергу - попелиці, листоїди, білокрилки та тріпси. Слід також розрізняти їх по будові ротових апаратів. Існують комахи-переносники із жувальним та сосальним апаратами. Комахи із сосальним апаратом переносять віруси в стилетах - стилетпереносні віруси - і спроможні передавати вірус протягом короткого їстівного періоду - від декількох секунд до декількох хвилин. Віруси спроможні знаходитися у переносчику протягом декількох годин. Вони також відомі як не персистентні віруси. У випадку інших вірусів, часом комаха повинна накопити в собі певну достатню кількість вірусу для його подальшої передачі (хвилини-години- дні). Такі комахи, що накопили вірус, спроможні його передавати вірус протягом декількох хвилин чи годин. Такі віруси. Що персистують у векторі протягом 1 - 4 днів називають напівперсистентними. Існують віруси, які після того, як комаха його переносить на іншу рослину, рецилькулюється знову ж на ротовий апарат, і спроможений залишатися на довго. Такі віруси називаються циркулятивними чи персистентними. Деякі такі віруси спроможні розмножуватися прямо у переноснику, і такі віруси називаються пропогативними вірусами. Віруси, що переносяться комахами із жувальним ротовим апаратом (жуками) можуть також циркулювати на ротовому апараті. Найбільшу кількість стилетпереносних вірусів (понад 250) переносять попелиці. Іноді одна попелиця може переносити по декілька вірусів одночасно. Все таки ж, треба відмітити про велику спорідненість та специфічність системи вектор - вірус. Для попелиці необхідно передати 26 вірус протягом 30 секунд після живлення на враженій рослині. Але відомі випадки коли вони спроможні вміщувати в собі активний вірус протягом декількох годин. Відомі також варіанти, коли попелиці накопичують вірус і спроможні ніби зберігати його в собі тому, що неспроможні його передати зразу ж після того, як він попав в організм комахи. Також відомі випадки, коли попелиці спроможні переносити віруси персистентно. Близько 50 фітовірусів (1997 рік) переносяться листоїдами та трі та плант- хоперсами, включаючи складні за будовою віруси із груп Рабдовірус та Гемінівірус. Такі комахи в основному проникають своїми ротовими апаратами до судинних систем флоеми передаючи при цьому віруси. Всі ці віруси являються циркуляторними. Деякі із них являються пропогативними, деякі передаються на стадії утворення яєць переносником. Більшість трі та плант- хоперів потребують декількох днів, поки вони набувають вірулентності щодо вмісту вірусу, і при набутті таких властивостей вони спроможні бути вірулентними протягом всього подальшого життя. Нормальний відрізок часу для передачі вірусів цими векторами - 1-2 тижні з моменту попадання вірусу до організму до моменту його подальшої передачі.

6.7 Передача кліщами

Як показали наукові дослідження, тільки одна родина кліщів - Eriophyidae - переносить не менше як 6 вірусів, включаючи - вірус штриховатої мозаїки пшениці і також деякі інші, що вражують злакові. Такі кліщі мають специфічний ротовий апарат - колюче-сосучий. Кліщова передача фітовірусів дуже специфічна і іноді вони являються єдиним переносником того чи іншого вірусу.

6.8 Передача нематодами

На даний час відомо по меньшій мірі 20 фітовірусів, що передаються одним чи більше видом трьох генерацій грунтоживучих, ектопаразитичних нематод. Нематоди різних генерацій - Longidorus, Paralongidorus, Xiphinema переносять декілька поліедричних фітовірусів, відомих як група Неповірус. До них відносять вірус скручування листя винограду, вірус кільцевої плямистості тютюну та деякі інші віруси. Генера нематод - Thrihodorus, Paratrihodorus переносять по меньшій мірі два ізометричних тобравіруса - тютюну та гороху. Нематоди переносять віруси від інфікованої рослини до здорової шляхом поїдання коренів. Личинки нематод також спроможні до переносу вірусів. Але вони спроможні його переносити в результаті поїдання хворих коренів рослин, а не через попереднього інфікування яєць нематод.

6.9 Передача грибами

Відомо, що організми грибної природи - Olpidium, Polymyxa, Spongospora переносять близько 15 фітовірусів. Деякі із вірусів переносяться інтернально (внутрі), а деякі - ектернально (ззовні) через спори чи зооспори грибів. При перенесенні вірусу грибами на здорові рослини спостерігається розвиток симптомів, характерних для вірусу, якого вони переносять.

6.10 Передача омелою

Деякі фітовіруси передаються від однієї рослини на іншу шляхом утворення містків паразитичною рослиною Cuscuta sp. Багато вірусів було переносять таким шляхом експериментально, при цьому часто навіть для таксономічно віддалених рослин. Вірус по клітинам флоеми інфікованої рослини передається на здорову рослину.

7. Фізіологія вірусінфікованих рослин. Противірусний імунітет

Гістологічні, цитологічні та субмікроскопічні зміни в інфікованих рослинах. Загальні відомості та класифікація. Локалізація та транспорт вірусів в рослині. Суть та ознаки природньої резистентності рослин до вірусів. Неспецифічні клітинні та загальнофізіологічні реакції в противірусному імунітеті рослин. Спільні та відмінні риси в патогенезі вірусів людини та тварин.

7.1 Фізіологія вірусінфікованих рослин

Морфо-анатомічні зміни в клітинах рослини-господаря в значній мірі залежить від властивостей патогена і, як-що після проникнення у клітину вірус починає впливати на її життєдіяльність, певним чином змінюючи обмін нуклеїнових кислот, білковий синтез та ряд інших метаболічних процесів. В залежності від того, на якій стадії розвитку листка відбувається його зараження, відповідно і вираженність викликаних вірусом патологічних змін буде різною. На даний час відомо три основні види гістологічних змін у рослин при вірусній інфекції: 1) некроз або загибель клітин, тканин або органів; наприклад, Х-вірус картоплі (ХВК) викликає повний розпад флоемної тканини. 2) гіпоплазія; наприклад, клітини мезофілу проявляють мозаїчну хворобу, але вони не відрізняються від нормальних. 3) гіперплазія, коли нормальний поділ спостерігається в звичайних клітинах, але спостерігається ненормальний поділ в клітинах камбію. Також відомо два основних ефекту цитологічних змін при вірусній інфекції - ефект вірусної інфекції на нормальні клітинні структури та ефект утворення вірус-індукованих структур в клітині. 28 Вплив вірусу на окремі клітинні структури часто може бути подібним, але проявляється він для кожного вірусу специфічно. В залежності від описаного процесу вірусної інфекції рослини та стадій інфікування, доречно збагнути на те, що всілякий контакт вірусу із клітиною проходить через взаємодію із клітинною стінкою та мембранними комплексами клітини. Величезних структурних змін набуває клітинна стінка. У випадку клітинної стінки, як основної бар' єрної структури клітини, відомо три основні видозміни, такі, як: 1). Ненормальне потовщення, яке призводить до відкладення калози біля кордонів вірус-індукованих некрозів. 2). Виступи клітинної стінки, іноді плазмодесм, що вже відомо для деяких вірусів. 3). Відкладення електронно-щільного матеріалу між клітинною стінкою та плазматичною мембраною. Деструктивна дія вірусів на клітинні комплекси описана досить не погано, хоча і на зараз являється дуже важливо знати механізми вірусної локалізації та транспорту. Почнемо із органоїду №1 в клітині - ядра. Багато вірусів, наприклад, не викликають цитологічного ефекту на ядро, хоча деякі із них, такі, як наприклад, потівіруси спроможні викликати різноманітні видозміни у ядрі. Ядро може змінювати свою морфологію, утворювати інвагінації мембрани. Розглянемо подібні патологічні зміни в ядрі при вірусній інфекції скручування листя хмелю. Такі віруси, як Geminivirus, Rhabdovirus, вражуючи клітину, проводять реплікацію власних нуклеїнових кислот саме в ядрі, викликаючи певного роду видозміни. Для мітохондрій, у випадку вірусного впливу деяких вірусів, відмічається ненормальний розвиток мембранних систем, але на даний час ще бракує даних про зв, язок вірусної реплікації із утворенням дегенеративних ефектів. У випадку вірусної інфекції представника карлавірусної групи - ВСЛХ, спостерігалось присутність віріонів в мітохондріях та деструктивна дія останніх на систему зовнішньої та внутрішньої мембран. Великих змін набувають в результаті інфікування такі органели, як хлоропласти. Так, наприклад, вірус жовтої мозаїки турнепсу (ВЖМТ) викликає утворення сферичних везикул в структурі хлоропластів та біля них. Це все призводить до структурних та біохімічних порушень інших органел. Кардинальних цитологічних змін набуває клітина, коли вона наближається до летального вироку. Ці зміни вивчені за допомогою світлової та електронної мікроскопії, але всі ці дані не дають змоги зрозуміти, як саме вірусна інфекція вбиває клітину. Слід відмітити про безпосередню локалізацію вірусів в клітинах рослин - перше місце з яких займає цитоплазма, далі органоїди. Величезної цікавості 29 заслуговує вивчення питання про утворення вірусних включень в клітинах. Так, найбільшими представниками щодо утворень включень в клітинах, являються Потівіруси. Ці віруси (досить чисельні по представникам на різноманітних рослинних культурах) спроможні утворювати дуже різноманітні і цікаві за морфологією включення. Відомо багато змін у біохімічних та фізіологічних процесах, коли вірус інфікує рослину. Це зниження фотосинтетичної активності рослини, що супроводжується зменшенням кількості фотосинтетичних пігментів, рибосом хлоропластів та рибулозобіфосфаткарбоксилази, підвищення траспірації, підвищення активності деяких ферментів, в основному поліфенолоксидаз, підвищення чи зменшення активності регуляторів росту рослини. Для багатьох вірусних захворювань основні види метаболічних змін призводять до процесу старіння рослин. Метаболічні зміни, що індукуються вірусною інфекцією, часто не специфічні. Подібні зміни можуть проявлятись, коли причиною являються клітинні патогени, механічне або хімічне втручання. Іноді одна генетична мутація в рослині-господарі чи одна точкова мутація у вірусу призводить до переходу безсимптомного протікання захворювання до його бурхливого прояву. Також слід відмітити, що не тільки процес реплікації вірусу призводить до метаболічних змін рослини. Іноді патологія проявляється вже в момент проникнення вірусу в клітину. Такий ранній негативний вплив на рослину іноді перевищує всі інші стадії розвитку вірусного захворювання. Отже, рослинам притаманний широкий спектр вірусних захворювань. Він залежить від біологічних особливостей окремих сортів, географії, агротехніки та культивування, відповідних для цього екологічних умов, таких як температура, види грунту, вологість, тощо. Згадаймо ще раз загальну схему вірусного відтворення. Віруси, попадаючи в клітини хазяїну, частково або повністю розпадаються на макромолекули, що їх складають. Після цього проходить трансляція вірусного геному або інформаційної РНК (матричної, мРНК), що синтезується на ньому, як на матриці. Для трансляції використовується генетичний апарат клітини-господаря. В результаті виникають нові вірусні білки, а також відбувається реплікація геному вірусу. В результаті із синтезованих нуклеїнових кислот і одного чи декількох вірусних білків збираються нові віруси. Цікаво, що на деяких етапах реплікації неможливо спостерігати зрілі вірусні часточки. Широко розповсюдженим шляхом проникнення вірусу в клітину є механічна передача. Вірус проходить із клітини до клітини по плазмодесмам від місця інокуляції, але цей процес іде повільніше на відміну від шляху проходження по судинам рослини, найчастіше це клітини флоеми. Не являється секретом, що велику кількість вірусів (більше 200 штук) передають наприклад попелиці. Останні пробивають своїми стилетами епідерміс рослин і пють сік флоеми, який багатий на продукти фотоасиміляції - полісахариди. В цей же час можна спостерігати передачу вірусів неперсистентним шляхом 30 від однієї рослини до іншої, якщо цей шлях передачі властивий для вірусу та рослини. Відомо також про існування транспорту вірусів по судинам ксилеми - провідним пучкам, що несуть по собі воду та розчинені в ній мінеральні солі від коренів до верхівки рослини. Так, наприклад, ВСЛХ транспортується переважно саме таким шляхом - по ксилемі. Більшість вірусів в рослинах переміщуються на довгі дистанції все ж таки по флоемі, але віруси, що передаються членистоногими, спроможні переміщуватись і по ксилемі. По флоемі рух вірусів досить швидкий. Так, Geminivirus, інфікуючи цукровий буряк, розповсюджується по рослині 2,5 см/хв. На шляху контамінації вірусом існують захисні барєри рослини- хазяїна. Перший із них це проходження вірусу від першої враженої клітини, наступний це проходження через паренхіму до судинної системи рослини, а останній-це проходження через паренхіму до інших частин рослини-хазяїна. Слід відмітити, що можливі також не специфічні шляхи проникнення та розповсюдження вірусів в клітинах рослин. Дуже багато факторів, такі, як генотип рослини, генотип вірусу, захисні механізми є визначальними в розповсюдженні та зараженні рослини вірусом. Протягом всього періоду вивчення вірусів рослин дискутується питання, у якій формі вірус переміщується у клітині. Зрілі вірусні часточки виявляються в плазмодесмах, але такі дослідження не завжди вважаються визначальними у поясненні механізмів переміщення вірусів від клітини до клітини. На короткі дистанції вірус переміщується завдяки активації специфічного білку, який він і кодує - білок руху (БP). На довгі відстані вірус переміщується, використовуючи транспортну та везикулярну систему рослини-хазяїна. Російськими вченими було показано, що вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) та деякі інші віруси переміщуються на довгі відстані завдяки формуванню комплексів з рибонуклеопротеїдами (РНП), які містять вірусну РНК, вірусний капсидний білок, та інші білки. Ці форми дають змоги вірусу переміщуватись на більш довгі відстані із деяким полегшенням. Пересування в таких комплексах описано для багатьох вірусів із різних родин. Для Тобамовірусів, Бромовірусів, Кармовірусів, Кукумовірусів та Потексвірусів. В пересуванні вірусу від клітини до клітини вагоме значення мають такі фактори, як рослина-хазяїн та її специфіка, і безперечно сама морфологія вірусу. Зараз перед вченими постає питання про те, що собою являють білки руху, яка їх природа, структура, локалізація. Була показана присутність БР вірусу тютюнової мозаїки в клітинних стінках та фракціях органел інокульованих листків, але не отримано їх в достатній кількості. Також було знайдено БР вірусу огіркової мозаїки (ВОМ) в клітинних стінках старого листя інфікованих рослин. 31 Цікаві результати отримали американські вчені, які різнобічними шляхами вивчали білки руху ВТМ та ВОМ в інфікованих та трансгенетичних рослин. Було відмічено, що білки руху вірусів із різних таксономічних груп знаходяться в тісному контакті із субклітинними компонентами і ці білки продукуються саме під час вірусного інфікування рослини. Більше того, як показують результати амінокислотного сіквенсу білків руху деяких вірусів, вони мають певну подібність, що натякає на те, що спостерігається деяка подібність у механізмах проникнення та руху вірусів.

7.2 Противірусний імунітет

Імунітет рослин - резистентність рослин до захворювань. Неповна проява імунітету називається стійкістю. Імунітет може бути специфічним, коли рослини стійкі до конкретного збудника інфекції, та груповим - коли рослина стійка до ряду захворювань. Цікаво, що імунітет, притаманний певному виду чи сорту, передається потомству і спроможен змінюватись в ту чи іншу сторону під впливом зовнішніх факторів. Так сталося, що в рослин у процесі еволюції склався ряд біологічних пристосувань, що дають їм змогу протистояти захворюванням, наприклад вірусним. До таких відносять структурно-анатомічні, фізіологічні, біохімічні та інші. Нашим вченим Б.П. Токіним було встановлено, що вищі рослини утворюють специфічні речовини, спроможні вбивати найпростіших, бактерій, грибів та вірусів. Такі речовини, названі ним фітонцидами, також являються одним із факторів, визначаючих імунітет рослин. Це спостерігається коли рослина специфічно відповідає наробкою в організмі специфічних речовин при певних інфекціях. Стійкість рослин проти захворювань часто звязана із віком вражуємих тканин: деякі хвороби, і особливо вірусні уражують тільки молоді тканини, інші тільки старіючі тканини. У першому випадку слід зауважити, що більш стійкими сортами являються скороспілі сорти, в другому - пізньостиглі. На даний момент часу такі питання, як взаємодія вірусу і клітини, відповідь рослинного організму на введення патогену вірусної природи являються дуже розгорнутими і до кінця не вирішеними. Перш за все бракує відомостей молекулярно-біологічних досліджень в порівнянні із вивченням противірусного імунітету у людини та тварин. Але все таки, на даний час вже багато відомо з таких питань, як саме проходить процес захисту самої рослини від введення чи при попаданні в неї вірусу, як відбувається активація рослинного імунітету? Відомо про існування двох варіантів рослин, що інфікуються патогенами - чутливі та толерантні (стійкі чи резистентні). Так, якщо провести механічну інокуляцію рослин вірусом, то можливо простежити типи реакцій рослини на введення патогену.

). Імунна реакція (невластива господарю) - вірус не реплікується в протопластах; цього не відбувається навіть в клітинах, які піддавались інокуляції. Вірус може навіть пройти стадію роздягання, але реплікації вірусного геному спостерігатись не буде.

). Інфекційна реакція (властива господарю) - вірус спроможен до інфікування та реплікації в протопластах. Іноді спостерігається явище гіперчутливості, коли проходить формування системних некрозів; часом спостерігається реакція рослини із утворенням чітких вірусних симптомів; нерідко проходить розвиток латентої інфекції, коли чіткого ефекту на рослину не помітно. Цікава ситуація спостерігається у випадку розвитку вірусної інфекції у рослин. Не являється необхідним вражувати рослину системно і всі органи одночасно.

Розглянемо шість випадків коли фітовірусні хвороби можуть бути відсутніми:

(1) - інфекція із невеликою концентрацією вірусу

(2) - толерантний хазяїн

(3) - відновлення росту листків із інфікованих частин рослини

(4) - листки, які не хворіють в залежності від віку на місця знаходження на рослині

(5) - темно-зелені місця в мозаїчних ділянках листків

(6) - інфікування листків кріптовірусами. В залежності від інокуляції вірусом, рослина відповідає чи імунно чи інфекційно. Якщо рослина імунна, то вона не являється хазяїном для вірусу, і вірус не реплікується в клітинах чи в цілому організмі, навіть в ізольованих протопластах. Імунність притаманна всім представникам видів рослин, але іноді це притаманно тільки для окремих представників сорту рослин. Розглянемо молекулярний механізм такої імунності на прикладі коровячого гороху сорту Арлінгтон до вірусу мозаїки коровячого гороху (ВМКГ). Горох буде імунним до ВМКГ через присутність одинарного домінуючого гену Менделіану. Цей ген кодує специфічний інгібітор, який блокує активність вірусної протеїнкінази, що необхідна для специфічного процессингу поліпротеїну ВМКГ на ранніх стадіях вірусної реплікації. Відомий процес, коли вірус спроможен до реплікації в ізольованих протопластах різних видів та сортів рослин. Рослина також може бути резистентною чи чутливою до інфекції. Ми можемо розглянути два види резистентності. До такого процесу включають надгіперчутливість, коли вірусна репродукція обмежується на первинно заражених клітинах, тому, що вірускодуємий білок, що необхідний для транспорту від клітини до клітини являється не функціональним в даному господарі. Трохи пізніше, такі ж самі випадки були описані для багатьох інших прикладів такого типу імунної стійкості.33 В іншому випадку стійкості, інфекційний процес лімітований відповіддю зон клітин, що знаходились навколо первинно інфікованих клітин, що надалі утворюють розвиток локальних точкових некрозів. Не інфіковані тканини навколо таких некрозів починають проявляти стійкість до інфекції. Така резистентність називається набутою чи фенотипічною. Така імунність включає в себе індукцію поменьшій мірі 14 білків відомих як патогенезо-споріднені (ПС) білки. Синтез таких білків простежується з моменту самого розвитку вірусної інфекції і являється частиною генералізованого неспецифічного захисту проти бактерій, грибів, комах, хімічних чи механічних пошкоджень, також і вірусів. У багатьох рослин- господарів, некротичний гіперчутлива відповідь (на протилежність до не некротичної відповіді, що призводить до системної інфекції та хвороби) керується окремим домінуючим геном Менделіану. Також відомо про деякі інші види сортової стійкості до вірусної інфекції. Більшість із них визначаються одним чи декількома домінантними генами. Інші керуються тільки частинами домінантних генів, також і рецесивними генами. Відомо, що вірус невикликаючий системної хвороби в даній рослині являється непатогенним для неї і навпаки. Ген резистентності в такій рослині чи виді в цілому спричинює стійкість до цього вірусу. Такий вірус називається авірулентним. Але ж відомі випадки, коли вірус спроможен до мутацій чи перебудов резистентності, і як наслідок до переходу в вірулентну форму. Від так, обидва геноми рослинний та вірусний знаходяться в постійному контакті і борються за результат після інокуляції. Перехід вірусу від авірулентної форми в вірулентну часом залежить від різниці в одну амінокислоту в вірускодуємому білку. В видах та сортах рослин, що являються чутливими до вірусів, останні реплікуються і транспортуються системно. У варіанті чутливої реакції господаря на вірус, як результат, проявляється розвиток захворювання, а якщо рослина толерантна, значного впливу на неї не спостерігається. Про розвиток інфекційного процесу слід говорити, як на роботу обох, і рослинних і вірусних генів. Наприклад, заміна вільної основи в гені капсидного білку ВТМ буде достатньою для зміни природи захворювання взагалі. Дійсні механізми процесів, що включені до індукції хвороб, ще недосконало вивчені. Багато біохімічних змін, що спостерігаються при інфікуванні вірусом, можуть бути незвязані на пряму із вірусною реплікацією. Затримка росту рослин можливо залежить від змін в балансі гормонів росту, формування мозаїк в вірус-інфікованих листках включають процеси, які зявляються на ранніх стадіях онтогенезу листків. Багато факторів навколишнього середовища впливають також на інфікування та розвиток хвороб. До таких відносять світло, температуру, воду, годівлю а також їхній баланс протягом вегетаційного сезону. Комплексні взаємовідносини можуть виникати коли рослини інфіковані двома неспорідненими вірусами чи вірусом та патогеном, клітинної будови. 34 Таким чином, імунітет рослин складається із багатьох захисних властивостей, що виникають у рослин в результаті їх взаємовідносин із збудниками хвороб, що склалися в процесі еволюції. Сукупність всіх цих захисних властивостей може сильно варіювати на різних фазах розвитку рослин та в різних умовах. Окрім особливостей самої рослини, імунітет визначається також певними особливостями паразиту, наприклад вірусу. Кожен вид вірусу має ту чи іншу кількість ізолятів чи штамів. Так, сорт може бути імунним до одних і чутливим для інших штамів. Склад штамів в кожному районі змінюється в залежності зовнішніх умов, в тому числі і від сортового складу вражуємої рослини. Нові штами вірусу виникають чи шляхом поступового його пристосування до стійкого сорту чи шляхом гібридизації. Імунітет рослини також залежить від умов середовища, в якій вона росте. Стійкість сорту проявляється тим повніше, чим більше умови зовнішнього середовища відповідають біологічним особливостям сорту. Якщо умови зовнішнього середовища не відповідають для даного сорту, то стійкість його може бути повністю чи частково втрачена. Слід зазначити, що крім імунітету притаманному даному чи іншому виду чи сорту рослин існує також штучна імунізація. Ще досить давно, в 50 - ті роки було показано, що стійкість рослин до патогенів може бути підвищеною застосуванням хімічних речовин, а саме внесенням їх в грунт чи некорневим шляхом. Стійкість рослин до вірусів та інших патогенів підвищують деякі добрива (особливо калійні), ряд мікроелементів та спеціальні препарати. Використання хімічних речовин для підвищення стійкості рослин проти захворювань називається хімічною імунізацією.

Створення стійких сортів рослин може проходити різними шляхами:

) гібридизація та схрещування віддалених географічних форм, а також із різноманітною віковою стійкістю.

) відбір стійких рослин серед чутливих сортів та подальше мікроклональне розмноження та створення соматичних гібридів.

) пошук стійких форм серед місцевих сортів.

) трансгенні рослини отримані введенням генів, що являються копіями генетичного матеріалу патогенів різної природи. Велику роль відводять захисній функції клітини, як барєру для проникнення вірусу в клітину. Певним чином його проникнення може бути блоковано, коли клітина може змінювати свій водний та кислотний баланси, рН середовища, можливо систему калій-натрієвих насосів тощо. Велика роль відводиться вивченню захисних барєрів рослини-хазяїна і на сьогодні. В літературі описано, що являється першим барєром для вірусу в клітині. Таким є проходження вірусу від першої враженої клітини далі, наступний - це проходження через паренхіму до судинної системи рослини, а останній - це проходження через паренхіму до інших частин рослини - хазяїна.35 Слід відмітити, що можливі також неспецифічні шляхи проникнення та розповсюдження вірусів в клітинах рослин. Дуже багато факторів, такі, як генотип рослини, генотип вірусу, захисні механізми є визначальними в розповсюдженні та зараженні рослини вірусом. Так, наприклад, поширення вірусної інфекції в тканинах листка рослини часто визначається особливостями його жилкування, анатомічними та хімічними бар, єрами, що виникають у рослин у відповідь на зараження. З позиції фітопатологічних досліджень описано явище розвитку дрібних некрозів як захисної реакції рослинного організму, які є результатом надчутливості клітин рослини-господаря до патогена, проникнення якого в організм викликає загибель останніх. Механізм надчутливості проявляється в швидкому відмиранні клітин господаря в місцях проникнення патогена в результаті чого, збудник захворювання опиняється в оточенні відмерлих клітин і припиняє ріст. Надчутливість, як захисна реакція рослинного організму на проникнення патогена була досліджена у випадку грибної інфекції. Характерно, що при цьому взаємодія патогена і рослини здійснюється на рівні двох клітинних систем, навіть у випадку, коли гриб проникає в цитоплазму рослинної клітини. Цей рівень відсутній у формуванні реакцій надчутливості при розвитку вірусної інфекції. Вірус проникає в клітину перетворюючи на свій лад її метаболізм, спрямований на формування нових вірусних частинок. При цьому використовується наявний метаболічний апарат клітини. Одночасно вірус здатний проникати в суміжні клітини, інфікуючи нові тканини і органи. При формуванні таких точкових некрозів таке поширення відсутнє, про що було також показано і в варіанті розвитку вірусної інфекції скручування хмелю в кінці 90-х років в Україні. В ряді досліджень, присвячених розвитку некрозів під впливом грибної інфекції було показано, що при проникненні патогена в клітинах рослини відбуваються зміни в метаболізмі фенолів. При появі патогена наявні в клітинах фенольні сполуки починають окислюватись поліфенолоксидазою до токсичних хінонів. Ці речовини нагромаджуються в клітинах і викликають їх загибель. Можливо щось подібне спостерігається і у варіанті вірусних інфекцій.

Вченими ще в 60-ті роки було показано про існування деяких низькомолекулярних речовин, що здатні проникати в цілі клітини, гальмувати чи повністю зупиняти реплікацію вірусу, якщо обробити ними листки через декілька днів після зараження вірусом. Більшість таких інгібіторів являються аналогами пуринів та пиримідинів, але серед них є також антибіотики та інші речовини. Всі вони являються небезпечними та шкідливими для здорових рослин, хоча частина із них подавляє розмноження вірусу при достатньо низьких концентраціях, ще майже не викликаючих макроскопічних порушень у рослин. Деякі аналоги, такі як, 2 - тіоурацил, включаються в вірусну нуклеїнову кислоту, частково заміщаючи урацил. Інші аналоги, такі як, 5 - фторурацил, включається ще більш активніше, але 36 на питому інфекційність вірусу впливає набагато меньше. Наприклад частки ВТМ після введення в їх структуру такого аналогу залишаються інфекційними.

Слід також зауважити на впливі антибіотиків на віруси. Так, циклогексамід подавляє синтез цитоплазматичними рибосомами і знижує накопичення всіх вивчених вірусів рослин. Навпаки, хлорамфенікол, блокуючий синтез білку рибосомами хлоропластів, майже не впливає на віруси. Актиноміцин D, механізм діїї якого в основному зводиться до інгібування ДНК-залежного синтезу РНК, блокує розмноження тімовірусів, каулімовірусів та деяких інших. І нарешті, існує ряд інших сполук, інгібуюючих розмноження вірусів. В якості прикладу можна навести тріхотецин (складний ефір ізокротонової кислоти та тетонового спирту, трихотеколону). Його дія залежить від рослини-хазаїну, але не від вірусу.

8. Діагностика та ідентифікація вірусів

Метод рослин-індикаторів та електронна мікроскопія. Їх різновидності. Імунологічні властивості вірусів. Поняття реакції антиген-антитіло на прикладі вірусних патогенів. Серологічні методи в фітовірусології. Пріоритет та недоліки. Модельна система отримання антитіл до фітовірусів. Моно- та поліклональні антитіла. Полімеразна ланцюгова реакція.

Метод рослин - індикаторів передбачає використання чутливих рослин до механічної інокуляції в них вірусу. Як правило, легше механічно заразити вірусом травянисту рослину, ніж деревну культуру, дводольну ніж однодольну, молоді проростки, ніж старі. Робота із вірусом, як із модельною системою, передбачає постійне підтримання його в активному стані. Для цього досліднику необхідно підбирати такі рослини, які після штучного зараження досить довго зберігають в собі вірус, проявляють на собі зовнішні симптоми вірусного ураження, накопичують його у великих кількостях та концентраціях та рослини, які придатні до оцінки інфекційності вірусу, яку проводять шляхом підрахунку первинних пошкоджень (локальних пошкоджень в інокульованих листках). Для цієї мети підбирають різні види рослин. Наприклад, вірус мозаїки люцерни можливо зберігати довгий час на люцерні, але надзвичайне його розмноження можна отримати на рослинах тютюну, а для діагностичної оцінки інфекційності краще використовувати листки квасолі звичайної, а характерні симптоми, що відрізняють його від інших вірусів, зявляються на 37 тютюну, квасолі та лободі Chenopodium amaranticolor. Тим самим, використовуючи метод рослин-індикаторів та фіксуючі зовнішні специфічні симптоми ураження, можна діагностувати різний рослинний матеріал на ураження вірусами. Наступним ефективним діагностичним методом в вірусології являється метод електронної мікроскопії. Електронний мікроскоп являється найбільш використовуємим приладом для вірусологів, і нажаль самим коштовним. Те, що віруси можливо побачити тільки за допомогою пучка електронів було визначено ще у 1873 році Ернстом Аббе, який відмітив про те, що розрішаюча спроможність світлового мікроскопу залежить від апертури лінз його обєктиву та довжини хвилі світла. По скільки навіть при максимальній апертурі розрішаюча спроможність не перевищувала навіть половини довжини хвилі світлової хвилі, то за допомогою світлового мікроскопу можливо було побачити тільки віруси із родини Poxviridae, наприклад вірус осповакцини (його розміри 300х200 нм). Використовуючи видимий пучок електронів замість видимих променів, теоретично можливо отримати більше розрішення. І це дійсно так. Електронні мікроскопи досягають значень 0,2 - 0,4 нм розрішаючою спроможності, чого являється достатньо для вивчення структури та будови багатьох біологічних макромолекул. Отриманий тим чи іншим шляхом пучок електронів в електронному мікроскопі прискорюється за допомогою високої напруги і тоді фіксується системою електростатичних чи електромагнітних луп. В системі мікроскопу підтримується високий вакуум, і тому такі летючі речовини як вода випаровуються. Саме тому необхідно спеціально виготовляти електронно- мікроскопічні препарати із певною концентрацією в них обєктів (наприклад для вірусів 1 млрд часток на 1 мл). Зразок спостерігається під електронним мікроскопом тому, що він розсіює або приломлює чи змінює фазу прохідного через нього електронного променю, який тоді реєструється за допомогою флуоресцентного екрану, фотоемульсії або детектору електронів. Відомо багато різновидновидностей електронної мікроскопії, як одного із ефективних методів діагностики рослинного матеріалу на вірусоносійство. Але наряду із прислівом: Краще один раз побачити, ніж почути, не слід забувати про те, що іноді можливо і не побачити вірус в пробі, коли він там буде знаходитись. Справа в концентрації препарату. Іноді метод електронної мікроскопії не може являтись направляючим у варіанті експрес-діагностики. Але все ж таки, коли вірус спостерігається в полі зору, питання про його присутність в матеріалі автоматично знімається. В іншому випадку, коли дослідник має справу із невеликими концентраціями патогенів в досліджуємому матеріалі, своє вагоме слово мають імунологічні методи досліджень. Імунологія - це наука про імунітет. Вона вивчає механізми та шляхи управління імунітетом, а також розробляє імунологічні методи діагностики, 38 лікування та профілактики захворювань. Основоположниками імунології прийнято рахувати англійського лікаря Дженнера (1749 - 1823) та Луі Пастера , який в 1881 році зробив повідомлення про те, що у випадку зараження курей ослабленим збудником холери курей, вони стають стійкими у варіанті зараження високовірулентними культурами. Звідси і пішло вчення вакцинації (вакка - корова), названої Пастером на честь Дженнера, який працював із коровячою віспою багато років тому. Трохи пізніше, імунологія набуває широкого розвитку. Із таким повязано відкриття І.І. Мечниковим в 1883 році теорії фагоцитозу та вчення про клітинний імунітет та теорії гуморального імунітету, сформульованої Ерліхом. В 1908 році їм була присуджена Нобелівська премія, як фундаторам сучасної імунології. Імунологія складається із двох великих взаємоповязаних розділів. Перший - вчення про імунну систему організму, тобто про таку реагуючу систему, що дозволяє розпізнати генетично чужорідних речовин. Як раз вона забезпечує імунітет - захист від вірусів, бактерій, паразитів, елімінацію (виведення) відмираючих та мутаціонно змінившися власних клітин тіла. Другий розділ імунології - вчення про антигени, тобто о структурі та властивостях біологічних субстанцій, які являються чужерідними для організму, і призводять до виробки на них клітин - антитіл, що їх нейтралізують. Головне питання, що виникає у випадку вірусного процесу, це як проходить інфікування та послідуюча інактивація вірусу в організмі, вірус як антиген, і як виробляються проти нього антитіла? Імунітет при вірусних інфекціях, як відомо, забезпечується антитілами та сенсибілізованими Т-лімфоцитами. До речі, у випадку вірусів, що циркулюють в крові, то останні можуть бути знешкоджені та виведені із організму механізмами гуморального імунітету. Антитіла інактивують вірус блокуючи перші етапи взаємодії із клітиною - адсорбція та проникнення. Вони ж інактивують також токсичні властивості вірусу. Стабільність комплексу вірус - антитіло залежить від різновидностей чутливості вірусу до антитіла - їхньої авидності, температури та часу контакту тощо. Нерідко сполучення вірусу із антитілом має зворотній характер, тобто вірус спроможен зберігати свої біологічні властивості після розєднання із антитілом. Важливо знати, що антитіла не спроможні спричинити вплив на вірус, що знаходиться в нутрі зараженої клітини. В цьому випадку в організмі синтезуються цитотоксичні Т-лімфоцити, які спроможні лізувати тільки вражені вірусом клітини. Звідси, із-за внутрішньоклітинного розмноження вірусів, вагома частка належить клітинному імунітету. Крім сенсибілізованих Т-лімфоцитів при проникненні вірусів в клітини включаються К-кіллери та природні кіллери, особливо при вірусних інфекціях типу грипп та парагрипп, що мають короткий інкубаційний період. Слід також зауважити, що деякі віруси не дивлячись на імунну відповідь постійно персистують в організмі хазяїну (наприклад вірус 39 герпесу). Вони інтегруються в геном клітини без прояву клінічних симптомів. Надзвичайно цікавий факт про те, що віруси рослин попадаючи в організм тваринного походження також викликають процес синтезу антитіл. Направляюча теорія по активації цього процесу досить не погано описана. Вірусний антиген являється чужорідним по відношенню до головного комплексу гістосумісності, навіть коли він уражає в умовах in vivo рослину. Зразу ж після його попадання в організм проходить вироблення імуноглобулінів, яких відомо пять видів - M,G,A,D та Е, і які відрізняються по віку життя в організмі. Перші із них самі короткоживучі - від декількох годин до декількох днів, інші спроможні жити роками в організмі, виступаючи в ролі постійного і стабільного імунітету. Вся теорія виробки антитіл полягає в синтезі специфічних клітин, що своїми реакційними центрами (епітопами) блокують антигенні детермінанти по принципу звязування фермент - субстрат, ключ до замку. Тобто синтез антитіл відбувається згідно зовнішньої будови вірусів, його морфологічних ознак. Навіть невеликі зміни в будові вірусних капсидів потребують синтезу специфічних антитіл, які будуть визначатись вірусспецифічністю і будуть встановлювати штамоспецифічність навіть у одного і того ж роду вірусу, що визнано називати ізолятами даного вірусу. Введення вірусу в організм викликає синтез імуноглобулінів типу М, повторне введення посилює імунну відповідь організму і спричиняє виробку імуноглобулінів інших типів, які більш стійкіші . Постає питання, що ж таке реакції імунітету? РІ - це реакції між антигеном та антитілом або між антигеном та сенсибілізованими лімфоцитами, які проходять в живому організмі та спроможні до проведення в умовах in vitro. Реакції між АГ та АТ називають серологічними (від грецької - серум - сироватка) або гуморальними (від латинської - гумор - рідина). Реакції АГ із сенсибілізованими лімфоцитами називають клітинними. В вірусології та фітовірусології зокрема розрізняють багато видів та модифікацій серологічних реакцій, які направлені на діагностику, ідентифікацію та виявлення навіть у супермалих концентраціях вірусів в патологічному матеріалі. Для фітовірусології відомо досить велику низку серологічних методів. Так, в 1977 році два вчених Кларк та Адамс запропонували світу використання імуноферментного аналізу (ІФА) для детекції фітовірусів. Цей метод дуже чутливий і спроможен зафіксувати вірусний антиген навіть якщо його концентрація складає 0,3 г/кг патологічного матеріалу (наприклад листків, що уражені вірусом). Розглянемо основні і широко використовуємі серологічні методи в вірусології. Слід також зауважити про існування моноклональних антитіл - АТ, які можливо отримати з'єднанням клітини міеломи із В-лімфоцитами із 40 селезінки миші, імунізованої специфічним антигеном. В результаті отримують гібридні клітини (гібридоми), які певний час продукують високоспецифічні антитіла одного типу (МКА). Їх можливо використовувати із лікувально-профілактичною метою при деяких інфекційних захворюваннях. На прикінці лекції, необхідно зауважити про пріоритети та недоліки використання серологічних реакцій. До пріоритетів слід віднести високу чутливість та специфічність методів при детекції вірусних антигенів, швидкість визначення присутності антигену в пробі та його ідентифікації. До недоліків можна віднести високу коштовність у варіанті отримання МКА, та реактивів для проведення серологічних методів. Також існує ціла низка артефактів при проведенні ІФА, коли є варіант звязування АТ2 із присутньою в рослині в нормі пероксидази. Слід робити висновок про присутність того чи іншого вірусу в пробі спираючись на різні варіанти серологічних реакцій, а також на результати по зараженню рослин-індикаторів, електронної мікроскопії тощо.

8.1 Полімеразно-ланцюгова реакція

Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був розроблений Кері Мюллисом в 1983 році. Відкриття ПЛР стало однією з найбільш видатних подій в області молекулярної біології за останні 20 років. За розробку ПЛР-аналізу К. Мюллис в 1993 році був удостоєний Нобелівської премії в області хімії. Поява методу ПЛР була обумовлена певними досягненнями в області молекулярної генетики, передусім розшифровкою нуклеотидної послідовності геномів ряду мікроорганізмів. Не можна також не сказати, що ПЛР стала можливою завдяки відкриттю унікального ферменту taq -ДНК-полимеразы, що міститься у бактерій, що мешкають в гейзерах.

Особливість цього ферменту полягає в його винятковій термостійкості (період напівжиття при 95О і складає 40 хвилин) і високій робочій температурі - оптимум роботи 72ОС. Витонченість, простота виконання, неперевершені показники чутливості і специфічності принесли новому методу небувалу популярність. За короткий час ПЛР-аналіз поширився по всьому світу. Діагностика інфекційних захворювань, у тому числі викликаних важко культивованими агентами, генотипування мікроорганізмів, оцінка їх вірулентності, визначення стійкості мікрофлори до антибіотиків, пренатальна діагностика біологічний контроль препаратів крові - ось неповний перелік напрямів медицини, де з успіхом застосовується ПЛР.

8.2 Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК in vitro, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити певну послідовність ДНК в мільярди разів. Можливість 41 отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки генома значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК. У основі методу ПЛР лежить природний процес - добудовування комплементу ДНК матриці, здійснюване за допомогою ферменту ДНК- полімерази. Ця реакція носить назву реплікації ДНК.

Природна реплікація ДНК включає декілька стадій:

1) Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі, розбіжність ниток ДНК);

) Утворення коротких дволанцюгових ділянок ДНК (затравок, необхідних для ініціації синтезу ДНК);

) Синтез нового ланцюга ДНК (добудовування комплементу обох ниток) Відкриття термостабільної ДНК-полимеразы (Taq -полимеразы) з термофільних бактерій Thermis aquaticus, оптимум роботи якої знаходиться в області 70-72 градусів, дозволило зробити процес реплікації ДНК циклічним і використовувати його для роботи in vitro.

Створення програмованих термостатів (амплификаторов), які за заданою програмою здійснюють циклічну зміну температур, створило передумови для широкого впровадження методу ПЛР в практику лабораторної клінічної діагностики. При багатократному повторенні циклів синтезу відбувається експоненціальне збільшення числа копій специфічного фрагмента ДНК, що дозволяє з невеликої кількості аналізованого матеріалу, який може містити одиничні клітини мікроорганізмів отримати достатню кількість ДНК копій для ідентифікації їх методом електрофорезу. Добудовування комплементу ланцюга починається не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках - коротких двониткових ділянках. При приєднанні таких блоків до специфічних ділянок ДНК можна спрямувати процес синтезу нового ланцюга тільки в цій ділянці, а не по усій довжині ДНК ланцюга. Для створення стартових блоків в заданих ділянках ДНК використовують дві олигонуклеотидные приманки (20 нуклеотидных пара), звані праймерами.

Праймери комплементарны послідовностям ДНК на лівій і правій межах специфічного фрагмента і орієнтовані таким чином, що добудовування нового ланцюга ДНК протікає тільки між ними. Для отримання достатньої кількості копій шуканого характеристичного фрагмента ДНК ампліфікація включає декілька (20-40) циклів. Таким чином, ПЛР є багатократним збільшенням числа копій (ампліфікація) специфічної ділянки ДНК що каталізує ферментом ДНК- полимеразой. Для проведення ампліфікації потрібні наступні компоненти:

1 етап: Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі). Протікає при 93-95 градусах протягом 30-40 сек.

2 етап: Приєднання праймерів (відпал). Приєднання праймерів відбувається комплемент арно до відповідних послідовностей на протилежних ланцюгах ДНК на межах специфічної ділянки. Для кожної пари праймерів існує своя температура відпалу, значення якої розташовуються в інтервалі 50-65 градусів. Час відпалу - 20-60 сек.

3 етап: Добудовування ланцюгів ДНК. Добудовування комплементу ланцюгів ДНК походить від 5-конца до 3 -концу ланцюга в протилежних напрямах, починаючи з ділянок приєднання праймерів. Матеріалом для синтезу нових ланцюгів ДНК служать ті, що додаються в розчин дезоксирибонуклеотидтрифосфати (дНТФ). Процес синтезу каталізує ферментом термостабільною ДНК-полімеразою (Taq-полимеразою) і проходить при температурі 70-72 градусів. Час протікання синтезу - 20-40 сек.

8.4 Переваги методу ПЛР як методу діагностики інфекційних захворювань

. Пряме визначення наявності збудників. Багато традиційних методів діагностики, наприклад иммуноферментный аналіз, виявляють білки-маркери, що є продуктами 44 життєдіяльності інфекційних агентів, що дає лише опосередковане свідоцтво наявності інфекції. Виявлення специфічної ділянки ДНК збудника методом ПЛР дає пряма вказівка на присутність збудника інфекції.

3.Висока чутливість Метод ПЛР дозволяє виявляти навіть одиничні клітини бактерій або вірусів. ПЛР-діагностика виявляє наявність збудників інфекційних захворювань в тих випадках, коли іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити неможливо. Протягом декількох годин за допомогою ПЛР з одного фрагмента молекули ДНК можна отримати більше 50 млрд. ідентичних молекул. Таким чином, можна вивчити генетичний матеріал присутній в крихітних кількостях. Чутливість ПЛР-аналізу складає 10-100 клітин в пробі (чутливість імунологічних і мікроскопічних тестів - 1000-100000 клітин).

4.Универсальність процедури виявлення різних збудників. Матеріалом для дослідження методом ПЛР служить ДНК збудника. Метод заснований на виявленні фрагмента ДНК або РНК, що є специфічним для конкретного організму. Схожість хімічного складу усіх нуклеїнових кислот дозволяє застосовувати уніфіковані методи проведення лабораторних досліджень. Це дає можливість діагностувати декілька збудників з однієї біопроби. Як досліджуваний матеріал можуть використовуватися різні біологічні виділення (слиз, сеча, мокрота), соскобы епітеліальних клітин, кров, сироватка.

5. Висока швидкість отримання результату аналізу. Для проведення ПЛР-аналізу не вимагається виділення і вирощування культури збудника (як культуральні методи), що займає велику кількість часу. Уніфікований метод обробки біоматеріалу і детекции продуктів реакції, і автоматизація процесу ампліфікації дають можливість провести повний аналіз за 4-4.5 години.

6. Можливість діагностики не лише гострих, але і латентних інфекцій. Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, некультивованих і персистирующих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях, оскільки цей метод дозволяє уникнути складнощів, пов'язаних з вирощуванням таких мікроорганізмів в лабораторних умовах. Застосування ПЛР-діагностики також дуже ефективно відносно збудників з високою антигенною мінливістю і внутрішньоклітинних паразитів.45 Слід зазначити що методом ПЛР можливе виявлення збудників не лише в клінічному матеріалі, отриманому від хворого, але і в матеріалі, що отримується з об'єктів зовнішнього середовища (вода, грунт і так далі). Прості вимоги до умов зберігання транспортування матеріалу від пацієнта в лабораторію не вимагають збереження збудника в живому виді, в порівнянні з бактеріологічними і вірусологічними методами.

8.5 Обмеження методу ПЛР

Перехресна контамінація від проби до проби (в процесі обробки клінічних зразків або при розкопуванні реакційної суміші), що призводить до появи спорадичних псевдопозитивних результатів; контамінація продуктами ампліфікації (ампликонами), що має найбільше значення, оскільки в процесі ПЛР ампликоны накопичуються у величезних кількостях і є ідеальними продуктами для реамплификации. Контамінація слідовими кількостями ампликонов посуду, автоматичних піпеток і лабораторного устаткування, поверхні лабораторних столів або навіть поверхні шкіри співробітників лабораторії приводить до появи систематичних псевдопозитивних результатів. Як правило, визначити джерело контамінації буває дуже важко і вимагає значних витрат часу і засобів. Накопичений до теперішнього часу досвід роботи лабораторій що використовують метод ПЛР для діагностики дозволяє сформулювати основні вимоги до організації таких лабораторій і проведення самих аналізів. Дотримання цих вимог дозволяє унеможливити контамінації і отримання псевдопозитивних результатів.

ПЛР - дослідження включає 3 стадії:

- виділення ДНК із зразків;

проведення полімеразної ланцюгової реакції;

реєстрація результатів (методом електрофорезу в агарозном гелі та ін.)

іщуючи їх в окремих приміщеннях: Пре-ПЛР-приміщення, де здійснюється обробка клінічних зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші для ПЛР і постановка ПЛР (за наявності умов два останні етапи рекомендується також проводити в додатковому окремому приміщенні). У цих приміщеннях забороняється проводити усі інші види робіт з інфекційними агентами ПЛР-діагностика яких проводиться в цій лабораторії. Пост-ПЛР-приміщення, де проводиться детекция продуктів ампліфікації. У цьому приміщенні допускається використовувати інші методи детекции інфекцій. Бажано кімнату детекции продуктів ампліфікації розташувати якнайдалі від пре-ПЛР-помещений.

9. Мікрональне розмноження та оздоровлення рослин

Основні етапи мікроклонального розмноження Одержання безвірусного посадкового матеріалу.

9.1 Основні етапи мікроклонального розмножень

Термін клон (від грец. - паросток, пагін) був запропонований Вебером у 1903 році для вегетативно розмножуваних рослин. Тобто клони лише частини материнської особини ідентичні їй та між собою. Мікроклональне розмноження - це використання техніки in vitro для швидкого не статевого одержання рослин, ідентичній вихідній. Перевагами мікроклонального розмноження рослин в порівнянні з традиційними методами є: значно вищий коефіцієнт розмноження, що за рахунками досягає 105 -106 клонів за рік, тоді як традиційно за цей самий термін від однієї рослини одержують 5-100; мініатюризація процесу, що економить площі маточними і розмножувальними рослинами; оздоровлення садивного матеріалу від нематод, грибів, бактерій та вірусів. Значною перевагою технологій є те, що в умовах in vitro часто укорінюються ті рослини, які зовсім не розмножуються або погано розмножуються звичайними способами. Садивний матеріал, отриманий цим способом генетично ідентичний вихідній рослині, оскільки утворюється з меристемних соматичних клітин рослин. Водночасно за статевого розмноження рослин нащадок розвивається із зиготи, утворений в наслідок злиття двох статевих клітин двох різних особин. Ця зигота містить гени як батьківського, так і материнського організму, тому нащадок, що виникає в процесі статевого розмноження, не ідентичний батьківській формі і несе спадкові ознаки обох батьків. Залежно від характеру морфогенетичних процесів (способів одержання рослин-регенерантів) в культурі тканин розрізняють два типи мікроклонального розмноження, в основі яких лежать відмінності одержання рослин. Перший тип рослин утворюється внаслідок активації існуючих в інтакній рослині меристем (апекс стебла, пазушні і сплячі бруньки стебла), тобто шляхом прямого морфогенезу. Другий тип рослин утворюється в результаті індукції виникнення бруньок або ембріонів. Ці рослини, отримані зі спеціалізованих і калюсних клітин, яким властива генетична мінливість.

9.2 Індукція розвитку пазушних меристем

Активізація пазушних бруньок і використання пазушних пагонів - найпоширеніший тип мікроклонального розмноження рослин. В рослині в умовах in vivo ріст пазушних бруньок пригнічується апікальним 47 домінуванням. Ріст пазушних бруньок стимулюється видаленням верхівки стебла або обробкою цитокінінами. Введення в поживне середовище цитокінів пробуджує бічні бруньки і спричинює розвиток чисельних нових бруньок. Утворюється пучок пагонів, що швидко ростуть, його розрізняють на дрібніші пучки або на окремі пагони, які спроможні утворювати підчас вирощування на новому свіжому середовищі такі самі пучки (розетки) бруньок і пагонів. Для індукції пазушних бруньок важливо правильно підібрати концентрацію фітогормонів у середовищі. Велика кількість цитокінів сприяє розвитку пазушних бруньок, але змінює морфологію рослин, призводячи до появи аномальних і вироджених форм. Надлишкова кількість ауксину в середовищі індукує розвиток калюсу, який пригнічує ріст меристемної тканини або спричинює розвиток додаткових стеблових апексів, що генетично відрізняються від вихідної рослини. У таких випадках ауксин із середовища вилучається або його кількість зводиться до мінімуму. Методом індукції пазушних бруньок у культурі тканини розмножуються плодово-ягідні і декоративні культури, а також овочеві (капуста, картопля та ін.). Мікроклональне розмноження методом індукції меристем гарантує максимальну генетичну однорідність рослин- регенерантів. Проте розмноження рослин пазушними пагонами є найповільнішим шляхом із відомих типів органогенезу.

9.3 Утворення придаткових пагонів

Багатьом рослинам властиве утворення пагонів безпосередньо із спеціалізованої тканини експланта. Окремі клітини ізольованих тканин рослин диференціюються з наступним утворенням меристем них осередків, в яких закладаються стеблові бруньки. Цей тип регенерації особливо придатний для травянистих рослин у разі використання листків, лусок, цибулин, бульбоплодів, стебел, кореневищ. Експлант вміщують на живильне середовище з невеликою кількістю ауксинів та цитокінів. Утворений пучок пагонів розділяють і висаджують окремо для одержання такого ж пучка. Розвиток адвентивних (що утворилися в місцях, в яких внормальних умовах пагони не утворюються) пагонів здійснюється за рахунок бічних та інтеркалярних меристем, внаслідок чого рослини генетично ідентичні батьківським формам.

9.4 Регенерація рослин з калюсу

Іншим поширеним методом мікроклонального розмноження є індукція органогенезу в недиференційованій калюсній тканині або суспензійній культурі. Перехід до мофогенезуконтролюється співвідношенням фітогомонів у живильному середовищі. Змінюючи концентрацію регуляторів росту в живильному середовищі отримують пагони з калюсу або з безпосередньо з експланта. Регенераційна здатність калюсу значною мірою залежить від генотипу вихідної рослини , віку, фізіологічного стану донорної рослини, походження експланта тривалості та умов культивування. Ідеальним для умов культивування є калус із вмістом генетично стабільних диплоїдних меристем них клітин, аналогічних клітинам стеблового апекса, що постійно розмножуються і мають добре виражену здатність до великої кількості регенерантів.

9.5 Основні етапи мікроклонального розмноження

По своїй суті Мікроклональне розмноження аналогічне негативному типу розмноження рослин, звіюю лише різницею, що воно відбувається в пробірці в умовах in vitro, де з клітин ізольованих тканин можна одержати досить велику кількість нових рослин. На сьогодні кількість видів, що можна клону вати у пробірці становить понад 1 тисячу штук рослин. Більше 100 видів мають комерцій не застосування. Основна перевага методу в порівнянні з класичними методами - у вищому коефіцієнті розмноження. Мільйон рослин можуть вирощуватися у лабораторії площею 150-200 м2 .

9.6 Фактори, що впливають на процес мікроклонального розмноження

Вибір материнської рослини. Бажано, щоб вихідні рослини не були ушкоджені грибними, бактеріальними і вірусними хворобами. Цибулини, кореневища і бульби попередньо обробляють високими або низькими температурами протягом різного часу - від кількох годин до кількох місяців. Вибір експланта. Для забезпечення ммаксимальної генетичної стабільності клонованого матеріалу і зметою уникнення появи аномальних рослин, як вихідний експлант використовують молоді, слабко диференційовані тканини. Для цього най придатні кінчики стебел,бічні пазушні бруньки, зародки і інші меристемні тканини. Можна використовувати молоді листки, черешки, суцвіття, денце цибулини. Стерилізація вихідного матеріалу. Для знезаражування вихідних експлантів використовують загальноприйняті методи. Проте часто внутрішнє зараження вихідних експлантів буває набагато сильнішим, ніж поверхневе, тому експланти попередньо обробляють фунгіцидами й антибіотиками проти грибної і бактеріальної хвороб.

9.7 Одержання безвірусного посадкового матеріалу

Невеликий розмір експланту для клонального мікророзмноження, поверхнева стерилізація його, асептичне перенесення на живильне середовище і субкультивування в умовах, що виключають інфікування, призводять до оздоровлення отриманих рослин від нематод, грибних і бактеріальних патогенів. Але цього недостатньо для оздоровлення створеного клональним мікророзмноженням садивного матеріалу від вірусів, віроїдів, мікоплазм. Саме вірусні хвороби - причина втрати від 10 до 50 % врожаю сільськогосподарських культур, що розмножуються вегетативно. 49 Більш того, відомо, що соя, цукровий буряк і деякі інші важливі рослинні культури передають віруси нащадкам і при насінному розмноженні, тобто сорти поступово накопичують вірусні інфекції. Результати досліджень показують можливість боротьби з вірусами томатів і огірків у захищеному грунті за допомогою вакцинації рослин непатогенними вірусними штамами, мутантами вихідних патогенних. Вітчизняні вакцинні штами S7 і V - 69, отримані у ВІЗР й Інституті загальної генетики РАН, захищають врожай багатьох сортів томатів, що уражуються ВТМ. Збільшення врожаю для таких сортів складає приблизно 23%. Одержані стійких до вірусів сортів гібридизацією за стійкими дикими видами - шлях довгий, особливо якщо необхідно перенести гени стійкості до кількох найбільш хвороботворних вірусів. За допомогою генної інженерії створені рослини тютюну і томатів, стійкі до ВТМ і вірусу мозаїки люцерни. Створення безвірусного садивного матеріалу багатьох сільськогосподарських рослин залишається актуальною задачею клітинної біотехнології. Найбільш ефективний для досягнення цієї мети засіб - культивування меристем стебла або органів стеблового походження. У деяких випадках метод культури меристем доповнюють термотерапією. Фахівці з культури тканин і клітин уже давно навчилися вирощувати рослини з апікальної меристеми, що складається з конуса наростання й одного або двох листкових зачатків. Можна створити умови і для одержання рослини з тканини тільки конуса наростання без листкових зачатків. Проте чим більший розмір меристемного експланту, тобто чим більше листкових зачатків і тканин стебла він має, тим легше іде процес морфогенезу, що закінчується одержанням цілої, нормальної пробірочної рослини. Водночас зона, вільна від вірусних часток, дуже різноманітна для різних вірусів. Це залежить також від виду і сорту рослини. Так, при вичлененні під бінокулярним мікроскопом меристеми картоплі розміром 0,2 мм (конус наростання апексу з одним листковим зачатком) серед отриманих рослин тільки 10% були вільні від Х - вірусу, але 70% - від У-вірусу картоплі. Обираючи розміри меристемного експланту, фахівець-біотехнолог повинен враховувати можливості прийнятого методу одержання максимального числа рослин при максимальному відсотку безвірусних. Біотехнологи віддають перевагу використанню гранично малого розміру експланта (0,075 - 0,1 мм) і розробляють оптимальні умови для одержання нормальної пробірочної рослини. Іноді віддають перевагу поєднанню термотерапії і культури меристем. Попередня термотерапія вихідних рослин дозволяє одержувати оздоровлені від вірусів при використанні меристем них експлантів розміром 0,3- 0,8мм. Проте застосування термотерапії в ряді випадків призводить до відставання у рості і деформації органів меристем них рослин. Цей методичний прийом може також збільшити латентні вірусні інфекції. Все це змусило шукати і інші засоби ефективності виходу оздоровлених меристемних рослин. Було використано багато речовин для оптимізації методу культивування меристем у сполученні з хіміотерапією . Останнім 50 часом отриманні позитивні результати при внесенні в живильне середовище, на якому культивують меристеми аналогу гуанозина- 1р-Д-рибофуранозил- 1,2,4-триазол-карбоксаміда. Цей препарат, що одержав комерційну назву вірозол (синтетичний рибавірин), доданий до живильного середовища концентрації 40-200мМ, збільшував відсоток безвіусних меристем них рослин для ряду звичайних для цих рослин вірусів до 80-100% при 0-41% у контролі. Для технології оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів вузьким місцем є відсутність високо специфічних і високочутливих діагностикумів на вірусні інфекції. Використання імуноферментної техніки, особливо в її мікро варіанті, застосування моноклональних антитіл, метод молекулярної гібридизації мічених фрагментів РНК і кДНК віроїдів і врусів з вірусами обєкта, що тестується, дозволяє посто і швидко виявити присутність патогенів у крапельці екстракту з рослини, - ці методи задовольняють вимогам специфічності і чутливості. Проте при цьому може значно зрости вартість тестування і ціна оздоровленої рослини. Необхідно оцінити, при якому співвідношенні клонального розмноження оздоровлених рослин in vitro і in vivo будуть меншими витрати на діагностику. Оздоровлені застосуванням меристемної культури рослини розмножують далі звичайним методом клонального мікро розмноження . Метод клонального мікророзмноження має велике значення для оздоровлення вихідного рослинного матеріалу. Боротьба з вірусними хворобами багатьох сільськогосподарських культур - одна з найбільш актуальних проблем рослинництва в усьому світі, тому що з виробництва можуть випадати цінні сорти рослин. Крім методу культури меристем одержати здоровий посадковий матеріал можна і шляхом регенерації рослин з калусних , суспензійних і протонластних культур. Однією з важливих умов при одержанні безвірусного посадкового матеріалу є наявність надійних методів тестування вірусів .

10. Роль вірусів в біосфері

Віруси як внутрішньоклітинні паразити рослин нездатні самовідтворюватись без існування багатокомпонентної синтетичної біологічної системи (клітини), тому використовують клітинні субстанції (амінокислоти, нуклеотиди, ліпіди, ферменти тощо), але доволі обмежено. Вірусний патогенез у клітинах відбувається строго специфічно і на відміну від багатьох інших фітопатогенів досить рідко призводить до загибелі рослини. Це зумовлено тим, що вірус «не зацікавлений» у перетворенні рослинного організму на комплекс біологічних субстанцій, йому необхідна функціональна багатоклітинна система (організм), яку він підпорядковує на свій лад і яка стає «фабрикою віріонів». Взагалі, слід говорить про те, що фітовіруси як фітопатогени з погляду вивчення їх людиною, призводять перш за все до погіршення якості продукції рослинництва і водночас до зниження 51 врожайності. Іноді такі негативні впливи на рослину відображаються і на інших показниках, таких, як кількість та якість насіння, стійкість до хвороб і шкідників рослини на наступний вегетаційний сезон для багаторічних рослин тощо.

10.1 Чинники, що пов'язані з рослиною-господарем

. Вік. Сприятливість до зараження. Як правило, молоде листя сприятливіше до зараження, ніж старе. Разом з тим дуже молоде листя може виявитися менш сприйнятливим, ніж розвиненіше. Таким чином, на рослині з листям різного віку можна спостерігати градієнт сприятливості, проте для різних вірусів цей градієнт може бути різним. Системне розповсюдження вірусу. При інокуляції наймолодшого листя добре розвинених рослин листя нижніх ярусів може залишатися здоровим. Чим старше рослина, тим сильніше виражена ця тенденція до локалізації інфекції. При зараженні рослини картоплі Х-вірусом як природним чином в полі, так і шляхом інокуляції деякі бульби можуть залишатися незараженими. Бімстер [48] виявив, що частка бульб і вічок, заражених У- вірусом картоплі, залежить від того, на якій стадії розвитку рослини була проведена інокуляція. Пригнічення росту рослини може виявлятися і інакше. Наприклад, рослини картоплі, інфіковані Х- або У-вірусом або сумішшю цих двох вірусів, протягом перших декількох тижнів ростуть швидше, ніж здорові рослини, якщо судити про ріст по подовженню стебла, а на пізніших стадіях швидше ростуть здорові рослини.

2. Генотип. Генетична природа рослини-господаря часто чинить вплив на результат зараження рослини певним вірусом. Типи реакції рослини на зараження: а) імунна - рослини не заражаються ні за яких умов; б) стійкість до зараження; в) надчутливість - в місці інокуляції розвивається некроз, причому в інші частини листа вірус не розповсюджується; г) толерантність - вірус розмножується і розповсюджується по тканинах рослини, але симптоми захворювання виражені слабо. Крім того, важливе значення для розповсюдження вірусу в польових умовах може мати спадкова стійкість рослини-господаря до комахи-переносника.

10.2 Чинники, що впливають на сприйнятливість рослин до зараження

. Освітленість. На сприйнятливість рослин до зараження вірусом впливає зміна освітленості двох типів, а саме:

) короткочасні зміни інтенсивності світла (відхилення від нормальних умов на період не більше 1 або 2 днів) і

) зміни освітленості впродовж тривалих періодів, рослини, що впливають на ріст. Боуден і Роберте виявили, що в літній період зниження інтенсивності світла або повне затемнення протягом 24 год підвищує сприйнятливість деяких рослин до вірусів. Затемнення або витримка рослин в повній темноті за день до інокуляції використовується часто як практичний прийом, що 52 дозволяє підвищити сприйнятливість рослин-господарів до вірусів, що погано передаються механічними способами. Різними експериментами встановлено, що світло може діяти на сприйнятливість рослин до зараження в двох прямо протилежних напрямах.

2. Температура.

Зазвичай преінкубація рослин до інокуляції при вищій температурі, ніж звичайно, підвищує їх сприйнятливість до вірусної інфекції. Характер дії теплової обробки рослин після інокуляції залежить від виду або штаму вірусу

3. Водний режим і вологість. Зазвичай при вирощуванні в умовах мінімального постачання водою ріст рослин пригнічується, їх листя стає жорстким і число місцевих некрозів значно зменшується в порівнянні з контрольними рослинами, що не відчувають нестачі води. Вплив постійної нестачі вологи на сприйнятливість рослин до зараження можна пояснити зміною структури листової поверхні. Велика частина даних свідчить про те, що вянення рослин перед інокуляцією підвищує сприйнятливість до зараження.

. Умови живлення рослин. Умови живлення рослин впливають на число місцевих некрозів при зараженні рядом вірусів, причому, взаємодії між різними елементами живлення достатньо складні. Сприйнятливість найвища за найбільш сприятливих умов живлення. Помітну роль грає при цьому співвідношення різних елементів живлення, причому дія додаткової кількості одного з компонентів сильно залежить від наявності інших.

5. Час доби.

Оскільки багато важливих фізіологічних процесів в листі підкоряються добовим ритмам, то і сприйнятливість рослин до зараження вірусами, механічними способами також різна залежно від часу доби. Ефективність інокуляції досягає максимуму до полудня, а потім протягом ночі знижується до мінімуму, який зазвичай досягається перед самим світанком.

6. Пора року.

У областях, що характеризуються значними сезонними коливаннями кліматичних умов, сприйнятливість рослин до вірусів помітно змінюється залежно від пори року. Боуден і Роберте показали, що типову зимову реакцію рослин на зараження вірусом можна викликати штучно, шляхом затемнення рослини.

7. Забруднення повітря.

Деякі речовини, що забруднюють повітря, можуть підсилювати ріст рослин. Трешоу показав, що обкурювання рослин парами фтору за деяких контрольованих умов збільшує число місцевих некрозів.

10.3 Чинники, пов'язані з вірусом і переносником

У екології різних штамів вірусу відмічені важливі відмінності. Кожен штам вірусу ефективніше переноситься тими видами, з якими він зв'язаний в природі. Зазвичай в природі виживають ті штами вірусу, які інтенсивно розмножуються, але разом з тим не наносять своїм господарям настільки 53 серйозних пошкоджень, щоб викликати загибель рослин. В результаті заражена рослина стає резервуаром вірусу. У тих випадках, коли вірус має переносників декількох видів, різні переносники можуть розрізнятися по ефективності перенесення вірусу. У природній популяції переносника на долю особин, що переносять вірус, впливають і багато інших чинників. До них відносяться вікова стадія переносника, доступність відповідного джерела вірусу і навколишні умови, особливо температура. В більшості випадків, хоч і не завжди, віруси знижують конкуруючу здатність своїх рослин-господарів, що викликає необхідність переміщення вірусу на здорові рослини. Іншими словами, деякі віруси впливають на своїх господарів і (або) переносників таким чином, що шанси вірусу на розповсюдження підвищуються.

10.4 Шляхи розповсюдження вірусів рослин в природі та агроценозах

Віруси рослин мають здатність досить швидко розповсюджуватися в біоценозах. Вони можуть поширюватися завдяки переносникам (кліщі, попелиці, нематоди, гриби ), передаватися при вегетативному розмноженні через бульби, живці, цибулини. Більшість фітовірусів передаються щепленим. Близько 90 різних вірусів рослин передаються насінням, деякі фітовіруси можуть викликати інфекцію без участі переносників, коли збудник знаходиться в грунті. Знання екології збудника необхідне для використання необхідних засобів боротьбі проти нього. При ураженні рослин-господарів фітовірусами найчастіше розвивається системна реакція. При цьому інфекція часто протікає з яскраво вираженими симптомами у вигляді мозаїки, скручування, хлорозу, появи енацій та ін. Така інфекція може закінчуватись навіть загибеллю інфікованих частин рослин або і всієї рослини. Разом з тим, інколи перебіг інфекційного процесу проходить без чітких ознак хвороби, які помітні за габітусом рослин. Часто уражений організм може бути прихованим носієм інфекції. Продуктивність таких рослин знижується в незначній мірі. Так реагують на вірусну інфекцію рослини-резерватори, переважна більшість яких відноситься до бур'янів. Бур'яни (щириця біла, гірчиця біла, суріпиця звичайна, пирій повзучий та ін.) займають особливе місце серед факторів, що знижують врожай сільськогосподарських культур. Для цих рослин характерні велика енергія насіннєвого та вегетативного розмноження, тривале зберігання схожості насіння. Вони сильно виснажують та висушують грунти, часто являються джерелом розповсюдження хвороб та шкідників сільськогосподарських культур. Джерелом вірусів служить також насіння бур'янів. Завдяки його достиганню та обсипанню до збору сільськогосподарських культур, насіння накопичується на полях у великій кількості. Так, в одному шарі товщиною 30 см знаходиться в середньому від 100 млн. до 4 млрд. і більше насіння бур'янів на 1 га. При обробці грунтів значна їх частина переміщується в верхній горизонт, і їх кількість тут в сотні і тисячі разів перевищує кількість насіння, 54 що висівається. Крім того, грунт може бути забрудненний кореневищами бур'янів, що також можуть бути уражені вірусами. Багато вірусів швидко мігрують завдяки переносникам. Переносниками можуть бути попелиці, цикадки, кліщі, нематоди, гриби та ін. Напевно, перше місце по передачі вірусів серед комах займають попелиці. Попелиці і кліщі, як і інші летючі комахи, є одними з важливих факторів, що визначають дальність розповсюдження віруса від джерела. Так, за один день попелиці відносяться вітром на десятки і навіть сотні кілометрів. Грунт є також одним із джерел інфікування рослин вірусами. Потрапляючи в грунт, віруси здатні інфікувати нові рослини. Існує три групи вірусів, що передаються через грунт: віруси, що передаються грибами; віруси, що передаються нематодами; віруси, переносник яких невідомий. Крім вірусів, що переносяться або нематодами з родів Longidorus, Xiphinema і Trichodorus, або зооспорами ґрунтових грибів з родів Polymixa і Olpidium, існує група ґрунтових вірусів, представники якої "вільними" віріонами зустрічаються в грунті і воді та можуть переходити без допомоги переносчиків від хворих до здорових рослин (nonvectored viruses), хоча деякі з них можуть переноситися нематодами або грибами. В грунт віруси рослин можуть потрапити як прямим (з листових, стеблових і кореневих залишків уражених рослин, та при віддачі вірусів коренями інфікованих рослин), так і непрямим шляхом (вірусовмісні екскременти та вимивання вірусів з контамінованих грунтів дощовими водами).

Джерелами контамінації "вільних" від вірусів грунтів або інших субстратів може бути невелика кількість рослин, що постійно виділяють через корені вірус в навколишнє середовище. Деякі віруси настільки призвичаїлися до цього способу розповсюдження, що інфікують тільки кореневу систему рослин-господарів або окремі частини їх надземних органів. Діагностика в такому випадку ускладнена, і можна припустити, що віруси цієї групи розповсюджені більш широко, ніж думали до останнього часу. Численні віруси рослин містяться в грунті і в поверхневих водах, особливо в сільськогосподарських областях. Ступінь адсорбції і тривалість періоду, на протязі якого інфекційність зберігається і який може тривати тижні, а іноді і місяці, залежить від захисту вірусу і факторів зовнішнього середовища. Серед останніх це тип грунту, рівень вологості, рН, температура, вміст органічних речовин і зв'язана з цим біологічна активність середовища. Багато вірусів стабільні і здатні інфікувати рослини без допомоги векторів, а саме нематод та розповсюджених в грунті зооспор грибів. Передача вірусу з грунту та води можлива через непошкоджені корені рослин. Віруси, які є в струмках, можуть переноситись на великі відстані. 56 До теперішньою часу приблизно 9 вірусів були ідентифіковані і кілька інших ізольовані з грунту і води лісових екосистем. Вони головним чином належать до: Potex,- Tombus-, Tobamo-, Poty- та Necrovirus груп. На високородючих грунтах ймовірність розповсюдження вірусних хвороб збільшується. На ступінь ураження, безперечно, впливає живлення рослин, пригнічуючи симптоми або роблячи їх більш чіткими. Інактивація вірусу проходить швидше у вологих, добре аерованих грунтах, ніж у сухих, щільних або заболочених. Термін життя окремої рослини обмежений, тому необхідною умовою виживання вірусу є перехід його від одної рослини до іншої. Джерелом інфекції може бути насіння або пилок, вегетативні частини рослини, бур'яни, комахи (у випадку персистентних вірусів), грунт. Передача вірусів за допомогою насіння представляє собою дуже ефективний спосіб ураження будь-якої культури на ранніх стадіях розвитку, так як на ділянці, де вирощується дана культура, з'являються хаотично розміщені осередки інфекції. Трансплантаційна передача вірусів може проходити за допомогою вегетативних частин рослини (пагонів, бульб, цибулин, вусиків), щепленням (привій, підвій). Механічний або контактний спосіб передачі віруса має особливо важливе практичне значення на ранніх етапах росту польових культур. В природніх умовах віруси можуть передаватися при контакті між собою, при застосуванні агротехнічних засобів. В останні роки велика кількість фітопатогенних вірусів, що не переносяться векторами, була виявлена в грунтах, ґрунтових водах, ріках, озерах та в морі. Коли листя зараженої вірусом рослини торкається листя здорової рослини, краї листя і листові волоски можуть ушкоджуватися. В результаті цього з соком інфікованої рослини вірус може проникнути в травму здорової рослини і заразити її. Таке зараження наймовірніше в тих випадках, коли віруси присутні в соку у високих концентраціях, а рослини легко ушкоджуються і високочутливі до інфекції. Саме таким шляхом розповсюджується в агроценозах Х-вірус картоплі, причому найшвидше розповсюджуються ті штами вірусу, які досягають в заражених рослинах найвищих концентрацій. Роберте дослідив, що Х-вірус картоплі передається від рослини до рослини також при контакті рослин під землею, швидше за все при зіткненні здорового коріння із зараженими. Проте слід зазначити, що розповсюдження вірусів за рахунок механічного контакту відбувається украй рідко. Рослинні патогени можуть різними методами попадати в грунт. Найбільш ймовірним є проникненя вірусів з інфікованими рослинами або рослинними залишками, в яких віруси можуть прямим або опосередкованим шляхом попадати в грунт. Прямий шлях полягає в тому, що вірусінфіковані рослинні залишки залишаються в грунті (корінці) або з залишками рослин попадають в грунт (паростки, вегетативні органи). При цьому слід звернути увагу на те, що віруси, які містяться в рослинних залишках частіше довше залишаються інфекційними, ніж віруси, які знаходяться в грунті у вигляді вільних віріонів. Вірусінфіковані рослини, які вживають люди та тварини, що 57 можуть проходити через шлунок без втрати інфекційності та контамінувати грунт через екскременти, представляють непрямий шлях контамінації грунту. Переносниками вірусів рослин є членистоногі, нематоди та гриби. Кожен вірус звичайно має своїх переносників, що належать, як правило, до однієї таксономічної групи. Представники двох класів членистоногих - комахи (Insecta) та павукоподібні (Arachnida) можуть переносити віруси рослин. Безумовний інтерес привертає до себе ряд Homoptera, куди відносяться такі важливі переносники вірусів рослин, як цикади, попелиці та білокрилки. Представники підряду Aphidinea (попелиці) дуже широко представлені в усьому світі. На території України нараховується близько 77 видів попелиць. Найважливішими представниками попелиць, що являються пе- реносниками багатьох фітовірусів, є Macrosiphum (Sitobion) avenae (велика злакова), Rhopalosiphum padi (черемхова), Rhopalosiphum maidis (соргова або кукурудзяна), Schizaphis graminum (звичайна злакова), Myzus persicae (зелена персикова), Aphis fabae (бурякова), Macrosiphum euphorbiae (велика картопляна), Myzus (Phorodon) humuli (хмелева), Brachycaudus helichrysi (геліхризова) та ін. Ротовий апарат попелиці чудово пристосований для інокуляції вірусів. Віруси можуть передаватися попелицями неперсистентно, пересистентно та напівперсистентно. Донедавна білокрилки не відносилися до групи комах, здатних переносити віруси, що можуть викликати епідемії. Проблема широкого поширення білокрилок та пов'язаних з ними епіфітотії була актуальною переважно для тропічних та субтропічних регіонів, але вже сьогодні вона постає в агросистемах помірного клімату. На сьогодні відомо кілька видів алейродид, здатних переносити віруси культурних рослин. До них належать: білокрилка батата (Bemisia tabaci), білокрилка посрібнених листків (Bemisia argentifolii), оранжерейна білокрилка (Trialeurodes vaporariorum) та облямована білокрилка (Trialeurodes abutiloned). Представники двох родин кліщів класу Arachnida - Tetranychidae та Eriophyidae - можуть переносити віруси рослин. Представники двох основних груп грибів, що уражують корені рослин, виконують роль переносників вірусів рослин - гриб Olpidium spp. серед Chytridiales, та Polymyxa graminis і Spongospora subterranea, що відносяться до Plasmodiophorales. На сьгодні відомі дві групи вірусів рослин, що можуть передаватися нематодами. Представники групи Tobravirus мають паличкоподібні частки та розповсюджуються нематодами родини Trichodoridae родів Tricodorus та Paratrichodorus. Передача вірусів в результаті щеплення. В результаті передачі вірусу шляхом щеплення може розвинутися захворювання, яке відрізняється від захворювання, що виникає в результаті механічної інокуляції. Щеплення 58 може виявитися ефективним способом передачі вірусів, коли інші методи безуспішні, проте використання щеплення не завжди приводить до досягнення очікуваних результатів.

Література

1. Matthews R.E.F. Fundamentals of plant virology. - New York: Acad. Press., - 1992.

. Аgrios G.N. Plant pathology. - San Diego: Acad. Press., - 1997.

. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. - М., - 1978.

. Бойко А.Л. Экология вирусов. - К., - 1990.

. Сюрин В.Н. и др. Ветеринарная вирусология. - М., - 1991.

. Букринская А.Г. Вирусология. - М., - 1986.

. Пересыпкин В.Ф., Кирик Н.Н., Тымченко В.И., и др. Болезни сельскохозяйственных культур: В 3 т. - К., - 1991.

. Пересыпкин В.Ф. Атлас болезней полевых культур. - К., - 1987.

. Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология. - М., - 1982.

. Билай В.И., Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г., и др. Микроорганизмы - возбудители болезней растений. - К., - 1988.

. Тарр С. Основы патологии растений. - М., - 1975. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. - М., - 1994.

Похожие работы

 

Не нашел материала для курсовой или диплома?
Пишем качественные работы
Без плагиата!