Преимущества и недостатки авторадиографии

Преимущества и недостатки авторадиографии

Содержание

Введение

. История развития метода меченых атомов

.1 Основные понятия и терминология.

.1.2 Изотопные индикаторы

.2.1 Стабильне изотопы.

.2.2 Радиоактивные изотопы

.3 Изотопные индикаторы в медицине, биологии и сельском хозяйстве

. Авторадиография.

.1.Преимущества и недостатки авторадиографии.

. Сцентиллярные счетчики излучения

.1 Сцинтилляции и сцинтилляторы

. Введение радиоактивной метки в биологические препараты

Заключение

Список использованных источников

меченый атом радиоактивный изотоп

Введение

Искусственно получаемые радиоактивные элементы нашли широкое применение в науке и технике. Одним из методов, позволяющих на практике использовать свойства радиоактивных элементов, является так называемый метод меченых атомов. Этот метод использует тот факт, что по химическим и многим физическим свойствам радиоактивный изотоп неотличим от устойчивых изотопов того же элемента. В то же время радиоактивный изотоп легко может быть опознан по своему излучению (с помощью, например, газоразрядного счетчика). Добавляя к исследуемому элементу радиоактивный изотоп и улавливая в дальнейшем его излучение, мы можем проследить путь этого элемента в организме, в химической реакции, при плавке металла и многом другом.

. История развития метода меченых атомов

Метод меченых атомов широко используется в аналитической практике. Метод радиоактивных индикаторов позволяет судить о поведении элементов в различных химических и биологических процессах, в том числе при их разделении и концентрировании в ходе анализа. Метод базируется на установленном Д. Хевеши, Ф. Панетом и К. Фаянсом факте, что радиоактивные элементы ведут себя точно так, как эти элементы в нерадиоактивном состоянии. Говоря современным научным языком, изотопные эффекты в большинстве химических и биологических процессов в первом приближении отсутствуют. Георг Хевеши - венгерский физикохимик, радиохимик родился в Будапеште, окончил в 1908 г. Будапештский университет, затем учился в Германии, в Берлинском и Райбургском университетах. Впоследствии работал в Цюрихском университете, в Высшей технической школе в Карлсруэ с Ф. Габером в Манчестерском университете с Э. Резерфордом, в Радиевом институте в Вене с Ф. Панетом. До 1920 г. работал в Будапештском университете, в 1918 г. стал там профессором Впоследствии работал в Копенгагенском (1920-1926), Фрайбургском (1926-1940), и Стокгольмском (с 1943 г.) университетах. Метод радиоактивных индикаторов был предложен Д. Хевеши и Ф. Панетом еще до Первой мировой войны (1913); определяя растворимость солей свинца, они использовали радиоактивный изотоп этого элемента. В 1932 г Д. Хевеши разработал метод изотопного разбавления и применил его для определения свинца в горных породах. Годом раньше Д. Хевеши обнаружил, что при облучении элементов рентгеновскими лучами возникает вторичное рентгеновское излучение - так был намечен путь к рентгенофлуоресцентному анализу. В 1936 г. Д.Хевеши (вместе с Х. Леви) разработал метод нейтронно-активационного анализа. Совместно с Д. Костером Д. Хевеши открыл гафний, объяснил особое положение иттрия в ряду редкоземельных элементов и т.д. в 1944 г ученый был удостоен Нобелевской премии. Ее присудили за работу по использованию изотопов как индикаторов при изучении химических процессов.

Химики-аналитики широко использовали метод радиоактивных индикаторов, созданный Д. Хевеши, для разработки приемов разделения и концентрирования микропримесей. Метод позволял быстро и надежно контролировать степень извлечения элемента при экстракции, ионном обмене, соосаждении и в других случаях. Радиоактивные индикаторы применяли также при изучении механизма химических реакций. Исследования были обеспечены наличием большого числа долгоживущих радионуклидов, удобных для измерения их радиоактивности.

В декабре 1957 г. в Москве состоялась большая конференция по применению радиоактивных изотопов в аналитической химии. Проходила она в ГЕОХИ АН СССР, в ней участвовало 450 человек, в том числе крупные аналитики из других стран - И. М. Кольтгоф (США), Г. Ирвинг (Эрвинг) из Великобритании, Р. Пришбл из Чехословакии и другие. Это была первая после войны аналитическая конференция в СССР с участием иностранных ученых. На конференции было много докладов о применении меченых атомов при разработке и использовании методов анализа. Например, А. В. Николаев (будущий академик), А. А. Сорокина и А. С. Масленникова сообщили об использовании изотопов при разделении редкоземельных элементов. В докладе И. П. Алимарина и Г. Н. Билимовича сообщалось об использовании изотопов 95Nb, 95Zr, 82Та при разработке методов отделения тантала от титана, циркония от ниобия, определяли выделенные элементы методом изотопного разбавления. Сродни методу радиоактивных индикаторов так называемый радиоуглеродный метод, который важен для датировки разного рода объектов. К примеру, что космические лучи, попадая в земную атмосферу, создают потоки вторичных частиц. В результате этого происходит превращение радиоактивного азота-15 в радиоактивный углерод-14. В момент возникновения атомы 14С, имеющие очень высокую энергию, сразу же вступают в реакцию с кислородом, образуя углекислый газ. Последний усваивается растениями и от них переходит к животным. В целом в биосфере поддерживается постоянная концентрация углерода-14. Эти факты были установлены к 1946 г. группой исследователей, в которую входил и американский физик У. Ф. Либби. Он задался вопросом: что происходит оадиоактивным углеродом после смерти организма. Поскольку обмен шеств прекращается, изотоп 14С в организм более не поступает. А содержавшийся в организме изотоп начинает распадаться: в соответствии периодом полураспада его количество уменьшается вдвое за 5 600 лет. Значит, по относительному содержанию углерода-14 в ископаемых останках можно судить об их возрасте. Идея проста, но для создания точного и удобного метода датирования потребовались большие усилия. Метод радиоуглеродной геохронологии позволяет определять возраст археологических объектов в пределах 200-50 000 лет. Для изотопного анализа используют масс-спектрометр, поэтому требуется лишь несколько граммов исследуемого вещества.

1.1 Основные понятия и терминология

Радиоактивность (radioactivity) - это обозначение удивительного явления природы, открытого Беккерелем в конце XIX века, суть которого заключается в самопроизвольном спонтанном превращении атомных ядер некоторых элементов в другие, которое сопровождается выделением трёх видов "лучей". Природу лучей установили быстро: α-лучи - это двукратно ионизированные атомы гелия, β-лучи - это электроны, γ-лучи - это жесткое коротковолновое электромагнитное излучение. Элементы, способные к таким превращениям стали называться радиоактивными, т.е. способными к этому превращению. В зависимости от типа излучения, радиоактивные атомы стали определять соответственно как α, β или γ излучатели или источники. Правда, вскоре было установлено, что некоторые радиоактивные атомы излучают сразу два (а возможно, и три) вида лучей, поэтому такая классификация дополняется пояснениями - это "чистый" α-излучатель или имеется сопутствующее γ-излучение. К первоначальным трём типам ядерных превращений (α, β и γ - радиоактивный распад) добавились новые, однако, общие закономерности для всех остались неизменными. В конце ХХ века было рекомендовано термин "изотоп" заменить на "нуклид" и, соответственно, "радиоактивный изотоп" на "радионуклид". Особенно широкого распространения это нововведение не получило, и оба термина используются в научной литературе как синонимы.

Количественная характеристика радиоактивности получила у физиков название "активность" (activity). Так как физикам никто не давал монопольного права на термин "активность", то со временем выяснилось, что в разных областях науки под "активностью" понимают совсем разные понятия. Сравните: активность радиоактивного изотопа, химическая активность элемента или соединения, энзимологическая активность фермента, биологическая (например, антивирусная) активность препарата - всё это совершенно различные понятия. Сближение различных научных дисциплин ещё больше запутывает положение. Попробуйте охарактеризовать фермент, меченный радиоактивным изотопом углерода-14. Активность такого фермента - это его энзимологическая характеристика или радиоактивная? Поэтому в современной научной литературе (особенно биологической) все чаще термин "активность" для радиоактивных веществ заменяется термином "радиоактивность".

За единицу активности (радиоактивности) радиоактивного вещества в Международной системе СИ принята скорость радиоактивного распада, равная 1 распаду в секунду, которая получила название беккерель - Бк (в английской версии Bq). Устаревшая, но по-прежнему используемая единица активности кюри - Ки (в английской версии Ci) - это активность препарата, эквивалентная активности 1 г металлического радия-226 и равная 3,7х1010 распадов в секунду, т.е. 3,7х1010 Бк.

Строго говоря, радиоактивный распад - это превращение ядра атома радиоактивного элемента, которое сопровождается выделением продуктов такого превращения. Например, электронный захват представляет собой поглощение электрона ядром с выделением γ-кванта, и такой тип "радиоактивного распада" более точно следует называть "ядерным превращением". Впрочем, оба термина используются в литературе на равных, несмотря на предпочтительность "ядерного превращения".

Основной закон радиоактивного распада описывается замечательной формулой:

= N0e-λt

где:- количество распавшихся радиоактивных атомов;- начальное количество радиоактивных атомов;

е - основание натурального логарифма;

λ - константа скорости радиоактивного распада;- время.

На практике для работы ею никто не пользуется, однако, из этой формулы следует сразу несколько довольно простых, но очень важных выводов и следствий, которые надо знать всем работающим с радиоактивными изотопами:

)Количество радиоактивных атомов, распавшихся за некоторое время наблюдения, зависит только от их исходного количества и времени наблюдения (распада). Никакие другие параметры: астрономические, физические, химические, парапсихологические на радиоактивный распад не влияют. Константа скорости радиоактивного распада [ λ ] (иногда ее называют константой распада) определяется только природой изотопа и для каждого изотопа имеет свою величину. Все попытки замедлить радиоактивный распад охлаждением (даже в жидком азоте) или ускорить распад нагреванием абсолютно бессмысленны. Можно влиять на стабильность химического соединения, меняя температуру его хранения, но количество радиоактивных атомов в препарате при этом не изменится.

2)Скорость радиоактивного распада меняется по экспоненте (т.е. нелинейно), и рассчитывать количество радиоактивного материала в препарате надо с учетом этого факта, пользуясь либо вышеприведенной формулой, либо соответствующими таблицами распада (что обычно и делают на практике).

)Если в формуле радиоактивного распада Nt = 1/2 N0 , т.е. распалась ровно половина радиоактивных атомов, содержащихся в препарате. Время этого процесса - константа Т1\2 - называется периодом полураспада. Физический смысл - время, за которое распадается половина радиоактивных атомов данного изотопа. Эта величина весьма полезна для работающих с радиоактивностью, т.к. позволяет быстро оценить "потери на распад" препарата.

)Физический смысл константы скорости радиоактивного распада [ λ ] - это активность 1 моля (или ммоля) 100% радиоактивного изотопа и соответственно размерность этой константы - Бк/моль (Bq/mol) или Ки/ммоль (Ci/mmol). То есть, это теоретически достижимая молярная активность (активность одного моля радиоактивного вещества), знание которой позволяет оценить чувствительность метода и качество радиоактивного препарата.

.2 Изотопные индикаторы

Изотопные индикаторы, вещества <#"justify">Применение стабильных изотопов некоторых лёгких элементов.

Водород: Изотоп водорода с массовым числом два (дейтерий) занимает особое место среди изотопов других элементов. Прежде всего, играет роль то обстоятельство, что только у водорода существует такое громадное различие между массами изотопов: в 2 раза для протия и дейтерия.

Пожалуй, ни один из изотопов других химических элементов не играет такой важной самостоятельной роли в области практических приложений. Наиболее важным соединением дейтерия является тяжелая вода D2O. В настоящее время тяжелая вода имеет исключительно важное значение как замедлитель нейтронов в ядерных реакторах. Развитие работ по атомной энергетике на первом ее этапе во многом обязано разработке способов получения тяжелой воды в больших масштабах. Некоторые свойства тяжелой воды были приведены выше.

Для исследовательских и препаративных целей используется ряд неорганических и органических соединений, в которых весь водород замещен на дейтерий: например, дейтеросерная кислота D2SO4, дейтерогидразин N2D4, дейтероуксусная кислота CD3COOD и CH3COOD, дейтеробензол C6D6 и др. Соотношения между свойствами дейтерированных и «обычных» соединений приблизительно такие же, как между D2O и H2O.

Дейтериевая вода в своей молекуле содержит два атома дейтерия, который несмотря на свою незначительную удельную массу на молекулярном уровне и вобщем количестве потребляемой воды делает отрицательную погоду, неблаготворно влияет на процессы жизнедеятельности. Вред привносит дейтерий. Он в настоящее время, также как и соединения, его содержащие, достаточно хорошо изучен, пожалуй, даже лучше многих других элементов таблицы Д. И. Менделеева, так как на тяжелую воду возник промышленный спрос. Изучено влияние дейтерия на жизнедеятельность организмов: выяснено, что в больших концентрациях для высших растений и животных - это яд.

Бор: Стабильные изотопы бора 10B и 11B, резко отличаясь по ядерно-физическим свойствам, широко используются в атомной науке и технике, а также связанных с ней отраслях.

Стабильный изотоп 10B используется в реакторостроении в виде карбида бора как составная часть стержней, регулирующих скорость ядерных процессов в реакторе, а также в форме раствора борной кислоты в теплоносителе первого контура. Изотоп 10B при малом удельном весе обеспечивает высоко-эффективную (превосходящую в сотни раз бетон) нейтронную защиту, что используется при создании малогабаритных реакторов, устанавливаемых на транспорте. Он также применяется в качестве антиактивационного покрытия, предотвращающего нейтронную активацию материалов, используемых в реакторостроении и ядерно-физических экспериментах.

Способность 10B трансформировать поток нейтронов в тяжелые ионизирующие частицы с длиной пробега, соизмеримой с размером живой клетки, используется в специальном приборостроении (при производстве, например, нейтронных счетчиков), а также в нейтронозахватной терапии злокачественных опухолей в медицине.

Стабильный изотоп 11B используется в ЯМР - спектроскопии, а также в реакторостроении при создании жаростойких, "прозрачных" по отношению к нейтронам конструкционных материалов (боридов циркония, иттрия, титана и их сплавов). В последние годы интерес к изотопночистому 11B возрос со стороны электронной промышленности, где химически чистый бор используется в качестве легирующего компонента при производстве полупроводниковых изделий. Этот интерес обусловлен возможностью использовать нейтроноактивационный метод анализа для определения в таком боре до 28 различных примесей на концентрационном уровне примерно 10 - 8 %.

Углерод: На сегодняшний день редкий стабильный изотоп углерода 13С (природная концентрация 1,1 %) нашёл достаточно широкое применение. Он используется для изучения механизма химических реакций и биохимических реакций в медицине. Особое значение тяжелый изотоп углерода 13С имеет для выяснения механизмов процессов, происходящих в живых организмах. Перспективной сферой применения изотопа углерода 13С (концентрация более 90 ат. %) является диагностика различных функциональных нарушений в организме: почечной недостаточности, нарушения обменных процессов печени, диабета, кислородного голодания сердечной мышцы, легочной недостаточности, метаболических нарушений, обусловленных дисфункцией эндокринных и других органов и т. д..

Разработан уникальный метод диагностики заболеваний с применением меченных изотопом 13С соединений. Это так называемые тесты дыхания. Препарат, принимаемый пациентом, претерпевает в организме изменения, связанные с протеканием биохимических реакций в разных органах. Через некоторое время препарат частично или полностью разлагается и выводится из организма. Содержащийся в препарате углерод в процессе реакций обмена окисляется и выводится в виде углекислого газа через легкие в выдыхаемом воздухе. Если изотопный состав содержащегося в препарате углерода отличен от природного, то появление в выдыхаемом воздухе углекислоты, содержащей углерод препарата, может быть зарегистрировано с помощью соответствующей аппаратуры. Имея информацию о путях и скоростях метаболических превращений препарата в исследуемом органе и вводя в него изотопную углеродную метку, можно сделать вывод о состоянии органа. Исследования такого рода, проводимые ранее в основном для решения научных биомедицинских задач, начали с недавнего времени использоваться в повседневной клинической практике.

Наибольшее распространение получил так называемый уреазный тест, призванный определять наличие в желудочно-кишечном тракте helicobacterpilory - бактерии, ответственной за возникновение подавляющего числа наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта - язвенных болезней и гастритов. Простота, надежность, быстрота проведения и безопасность тестов дыхания для пациентов позволяют делать оптимистический прогноз относительно этой диагностики. Определенным ориентиром здесь могут служить США - ежегодно здесь проводится около 2 млн. тестов с использованием препаратов, меченных изотопами углерода.

Теплопроводность алмаза на основе лёгкого наиболее распространённого изотопа углерода 12С (конц. 12С - 99,9 ат. %) в 1,5 раза выше теплопроводности алмаза природного изотопного состава (конц. 12С - 98,9 ат. %). Использование в электронике изотопномодифицированных алмазных плёнок на основе 12С позволяет существенно улучшить технические характеристики приборов и оборудования.

В научно-исследовательском центре курортологии и реабилитации внедрена программа диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта с помощью изотопов углерода. За научными терминами кроется простой и важный для пациентов смысл: теперь для обследования желудка не надо глотать зонд - достаточно выпить 50 грамм. Врач дает пациенту разработанный в России тест-комплект. Он содержит меченые атомы - изотопы углерода. Спустя 20 минут проводится повторный тест - уже после того, как препарат будет поглощен.

.2.2 Радиоактивные изотопы

Для элементов, существующих в природе в виде одного изотопа <#"justify">Список радиоактивных изотопов, которые используются в современной жизни, вообще крайне ограничен самой природой. В состав органических соединений входят водород, углерод, кислород, азот, а также гораздо реже фосфор и сера. Следовательно, для получения немодифицированных меченых соединений круг возможных радионуклидов ограничен этими биогенными элементами. Радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совершенно неприемлемый для работы в современной жизни период полураспада - от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже применяются в медицине и технике, однако их использование в физико-химической биологии весьма проблематично. Вообще, "идеальный радионуклид" для современной жизни должен отвечать следующим критериям:

. Элемент должен входить в состав всех органических молекул. Это понятно, так как делает возможным введение "меченого атома" в любую молекулу.

. Период полураспада "идеального радионуклида" 10÷100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в диапазоне 1018÷1017 Бк/моль и сможет обеспечить высокую чувствительность метода.

. Чистый β-излучатель с максимальной энергией излучения не более 0,4 Мэв.Это позволяет сравнительно просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высокое разрешение методов, связанных с авторадиографической детекцией меченых продуктов.

.3 Изотопные индикаторы в биологии, медицине и сельском хозяйстве

В биологии изотопные индикаторы <#"justify">2. Авторадиография

Основное назначение авторадиографии - регистрация полос радиоактивно меченых препаратов (белков и НК) после электрофореза. Для этой цели используют медицинскую "неэкранированную" рентгеновскую пленку (в пленках с защитным слоем на поверхности поглощается часть излучения). Почернение рентгеновской пленки (после проявления) происходит как под действием электронов, так и у-излучения. Препараты, меченые тритием, ввиду малой проникающей способности его (3-электронов, лишь в случае очень высоких интенсивностей излучения удается регистрировать данным методом. Авторадиография препаратов, меченых S и С осуществляется вполне успешно. Однако пластинки ПААГ в этих случаях необходимо перед регистрацией радиоактивности полностью высушивать. В противном случае Р-электроны, испускаемые в глубине геля, не достигнут пленки. Сушат гель, уложив его на толстую фильтровальную бумагу (он прилипает и при сушке не съеживается), 1-2 часа в вакууме и с нагреванием или 36 часов на воздухе при комнатной температуре - до состояния тонкой, прочной и прозрачной пленки. Тем не менее, нежелательно, чтобы толщина влажного геля превышала 0,4 мм. Рентгеновскую пленку накладывают эмульсией прямо на гель. В такой постановке опыта Р-электроны углерода и серы проникают в слой эмульсии на глубину около 0,25 мм. Для хорошего прилегания пленки к гелю под крышку соответствующей кассеты с пружинными зажимами кладут прокладку из губчатой резины. Саму кассету заворачивают в черную бумагу. Экспозиция длится несколько дней. Затем следует, как обычно, проявление и фиксация.

Энергия Р-излучения радиоактивного фосфора достаточно велика, чтобы его авторадиографию можно было вести прямо с влажной пластины геля. Гель, покрытый пленкой, оставляют на одной из стеклянных пластин, заворачивают в тонкий полиэтилен и экспонируют, как было описано выше, в течение нескольких часов - лучше на холоде (-20°), с тем, чтобы помешать расплыванию полос в геле во время экспозиции за счет диффузии. Р-электроны радиоактивного фосфора могут проходить в материале рентгеновской пленки до глубины в 6 мм. Это означает, что большая часть их "прошивает" пленку, не передав всю свою энергию молекулам бромистого серебра и, следовательно, не самым лучшим образом регистрируются. Иногда, если интенсивность Р-излучения невелика (за малостью содержания), эти "пропадающие зря" электроны улавливают с помощью фосфоресцирующего экрана, который устанавливают по другую сторону пленки. Попавшие на экран Р-электроны вызывают его свечение и пленка регистрирует (не без некоторого размытия изображения) еще и светящуюся полосу на экране. Зато яркость почернения в этом случае может увеличиться в 5-8 раз.

Поскольку при использовании флюоресценции экрана возможна релаксация кристаллов бромистого серебра, распавшихся под действием света, экспозицию пленки лучше проводить в этом случае при - 70°. Для правильного совмещения пленки после проявления с исходным гелем, на нем до авторадиографии делают две пометки по углам радиоактивными чернилами.

.1 Преимущества и недостатки авторадиографии

Авторадиография весьма популярный метод детекции различных нуклеотидов. Но как и у любого метода у неё тоже существуют свои преимущества и недостатки.

Главное преимущество авторадиографии - простота и доступность. Выдержите (проэкспонируйте) образец с рентгеновской пленкой, затем проявите пленку в стандартных условиях - и получите картину распределения радионуклида по поверхности образца: геля, тонкослойной хроматограммы и т.д. Если полученная "картинка" вас не устраивает - можно повторить экспозицию с новой пленкой, увеличивая (или уменьшая) время по своему желанию. Обычно время экспозиции меняют в 2÷3 раза, так как изменение времени экспозиции на 20÷30% существенных изменений в картину не вносит. Весь сиквенс ДНК и РНК с радиоактивным фосфором использовал исключительно авторадиографию. Флюоресцентная метка практически полностью вытеснила радиоактивные изотопы из секвенирования, однако авторадиография остается широко применяемым методом детекции.

Главный недостаток авторадиографии - сложности с количественной оценкой. При визуальном определении даже интуитивно ясно, что интенсивность "почернения" пленки пропорциональна количеству радиоактивных атомов в этом месте. Но вопрос об этой "пропорциональности" нуждается в пояснении. Существует несколько типов сканеров, позволяющих довольно точно определять интенсивность "зачернения" пленки и, следовательно, сравнивать пятна инструментально, а не "на глаз". Оказалось, что диапазон активности препарата, в котором интенсивность "зачернения" пленки прямо пропорциональна количеству радиоактивных атомов, очень невелик и зависит от времени экспозиции образца с пленкой, типа пленки, природы радионуклида (тип распада и энергия излучения) и даже от режима обработки пленки. Например, для фосфора-32 за ночь экспозиции линейная зависимость "зачернения" пленки от активности образца находится в диапазоне 0,5÷25 Бк на мм2 (примерно 30÷1500 имп/мин). Дальнейшее увеличение активности образца, например, до 100 Бк на мм2 не приводит к большей интенсивности "зачернения" - всё уже "зашкалило".

Поэтому, простой совет для начинающих работать с количественной авторадиографией. Сделайте несколько калибровок - нанесите ряд пятен диаметром 1÷1,5 мм с активностью 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проэкспонируйте их с рентгеновской пленкой различное время и после обработки пленки просканируйте её на своем приборе. Вы сразу определите диапазон, в котором ваши последующие количественные измерения радиоавтографов будут корректными. Для разных радионуклидов такой диапазон различается очень существенно, но учитывать его надо в любом случае.

Для увеличения чувствительности авторадиографии (точнее, для уменьшения времени экспозиции) можно воспользоваться усиливающими экранами. Это весьма эффективно для фосфора-32 или йода-125, однако практически бесполезно для мягких (слабоэнергетических) β-излучателей. Использование экрана для фосфора-32 позволяет снизить время экспозиции в 2÷3 раза, но за это приходится "платить" ухудшением разрешения, которое происходит за счет "размывания зон".

3. Сцинтилляционные счетчики

Эффект сцинтилляции для количественного определения радионуклидов начинали использовать еще во времена Резерфорда, который визуально считал сцинтилляционные вспышки под микроскопом. За сто лет принципиальных изменений не произошло. Рядом с источником излучения помещают сцинтиллятор и ФЭУ (фотоэлектронный умножитель), который считает вспышки. Сцинтиллятор может быть твердым, а может быть и жидким (чаще, растворенным в жидкости). Во флакон (vial) с жидким сцинтиллятором добавляют тестируемый образец, и в этом случае можно эффективно измерять даже самое "слабое", низкоэнергетическое излучение.

Радиоактивный распад является классическим примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение активности как регистрацию случайных событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:

/2/n x 100%

где n - число "событий" (в нашем случае распадов).

Например, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 4001/2 / 400 х 100% = 5%, т.е. ошибка 5%. Это означает, что чем больше число измерений (собственно счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Более того, вопреки устоявшейся традиции, для снижения математической ошибки измерения надо считать не число зарегистрированных прибором распадов (импульсов) за единицу времени, а время, необходимое для "накопления нужного" числа импульсов - например, 10000 имп. Тем не менее, во всем мире активность с помощью счетчиков измеряют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минуте).

Все счетчики имеют верхний предел измерения, после которого их точность падает, так как счетчик не успевает регистрировать - "захлебывается". Для сцинтилляционных счетчиков - это активность на уровне 106÷107 расп./мин. Некоторые типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отказываются считать образцы, активность которых превышает установленную для данной модели. Оптимальная активность образца для точного измерения 104÷106 расп./мин.

Проводя количественные измерения, например, определяя концентрацию радионуклида в растворе, всегда делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независимых аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 - 3 измерений. Затраты времени на "лишние" процедуры будут с лихвой компенсированы отсечением случайных "выбросов". Разброс в измерениях, особенно у начинающих исследователей, может достигать 200% и более, хотя в норме не должен превышать обычную ошибку рутинного отбора аликвот.

Ни один измерительный прибор не регистрирует 100% всех "распадов" (decompositions) в измеряемом образце. Эффективность счета - это коэффициент, который связывает зарегистрированные прибором импульсы (counts) и реальные распады (decompositions). Поэтому для любого измерения распады/мин. (dpm - decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm - counts per min.). Правда, для большинства радионуклидов, применяемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет более 90%. Однако, тритий удается измерять с эффективность не более 50÷60%. Обычно эффективность счета для каждого радионуклида указывается в технической документации к прибору, и долгое время негласное соревнование между фирмами за более высокую эффективность счета трития было чуть ли не главным двигателем технического прогресса в этой области.

Все измерительные приборы имеют собственный "фон" - регистрируют какое-то количество импульсов без источника ионизирующего излучения (радиоактивного препарата). Природа фона различна: космическое излучение, электронный шум, содержание природных радионуклидов в помещении, где установлена измерительная аппаратура и т.д. Поэтому минимально достоверная величина активности, измеряемая прибором, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного прибора. Если в вашем "эпохальном" эксперименте активность "главного" образца едва-едва превышает фон, попытайтесь увеличить время измерения (можно до 20 мин.) - тогда достоверность измерения возрастёт.

В большинстве случаев в life science абсолютные измерения активности не нужны, и гораздо важнее получить информацию об относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке или по элюированным с колонки продуктам; доля субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; доля лиганда, связанного с рецептором; детекция продуктов метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и другие аналогичные задачи. Поэтому очень важно, чтобы условия приготовления и измерения образцов в конкретном эксперименте были одинаковыми, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного влияния на биологические результаты.

Наиболее ярко эту относительность измерений иллюстрирует широкое использование минимониторов - приборов, предназначенных для определения загрязнения поверхностей рабочих столов, одежды и т.д. Небольшие карманные приборы, имеющие ионизационный счетчик (обычно это ионизационная камера или счетчик Гейгера), оказались очень удобными для детекции меченного фосфором-32 фрагмента ДНК в агарозном геле или меченного йодом-125 белка в ПААГ и т.п. Некоторые ухитряются по показаниям такого прибора оценивать включение меченых предшественников биосинтеза в биополимеры после разделения продуктов реакции, используют мониторы для измерения активности образцов на фильтрах, кусках фильтровальной или хроматографической бумаги и даже в пробирках. Это удобно и полезно для качественных и полуколичественных оценок, но следует помнить, что приборные ошибки в таких измерениях могут быть очень значительными и достигать 200-300%.

Жидкостные сцинтилляционные счетчики уже многие годы остаются главным инструментом для количественного измерения радионуклидов. Несмотря на разнообразие конструкций, с точки зрения пользователя, все они измеряют активность образцов, помещенных в специальный стеклянный или пластиковый флакон и заполненный жидким сцинтиллятором. Поскольку измерение активности сводится к подсчету вспышек света, жидкость во флаконе должна быть прозрачная для счета и гомогенная по составу. Все отклонения от этого требования снижают эффективность счета, причем иногда существенно. Образование осадка или двухфазной несмешивающейся жидкой системы, наличие образцов биологических тканей или фильтровальных материалов - все эти факторы снижают эффективность счета. То же самое касается добавок многих химических веществ: кислот, щелочей, концентрированных растворов сахаров, солей, мочевины и многое другое. Особенно это касается измерений трития, где разница в эффективности счета для гомогенного, почти идеального, образца и образца, нанесенного на хроматографический сорбент, может быть в 10÷30 раз и даже больше. Это необходимо учитывать, если при составлении баланса по активности вдруг куда-то исчезнет часть радиоактивного материала или откуда-то внезапно появится "лишнее".

Составы сцинтилляторов весьма разнообразны и фирмы, производящие сцинтилляционные коктейли, часто не раскрывают их состав. Классический (едва ли не самым первый) жидкий сцинтиллятор - это толуольный раствор 2,5-дифенилоксазола (РРО) с добавкой 1,4-ди-[2-фенил-(5-окзазолил)]-бензола (РОРОР). Состав: 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л толуола. Не вдаваясь в подробности, следует подчеркнуть, что это - неводная система, а водные растворы считать в таком сцинтилляторе не принято. Для измерения водных проб к такому сцинтиллятору добавляют тритон Х-100 до 30% по объему.

Другим вариантом "водолюбивого" сцинтиллятора является диоксановый: 60 г нафталина, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирта и до 1 л диоксан марки "сцинтиляционный". Впрочем, большинство исследователей сегодня успешно пользуются готовыми фирменными коктейлями, справедливо не задумываясь над их составом.

Важными источниками ошибок для жидкостного сцинтилляционного счета являются "засветка" сцинтилляционной жидкости и электризация счетных флаконов. Оба эффекта легко нейтрализуются во времени (не спешите сразу считать, дайте пробам постоять в темном пространстве прибора несколько минут), кроме того, электризация почему-то чаще проявляется на стеклянных флаконах, и реже - на одноразовых пластиковых.

Внедрение в технологию биоскрининга радиометрических методов анализа подвигло разработчиков на создание высокопроизводительных сцинтилляционных счетчиков для измерения активности в планшетах. Для радиоактивных изотопов фосфора прибор используется в модификации с внешним твердым сцинтиллятором, который и является детектором. Для трития твердый сцинтиллятор добавляют прямо в лунку планшета в виде специальных бусинок и, так как эти бусинки являются одновременно компонентом биохимической реакции, то связанный с "бусами" меченый тритием лиганд считается сцинтиллятором, а не связанный, находящийся в растворе, - не считается. С радиохимической точки зрения эффективность счета в таких измерениях очень низкая, но для биоскрининга важно относительное распределение меченых соединений в системе "связанный-несвязанный", а высокая производительность и простота операций оправдывают колоссальные затраты на реализацию таких методов.

.1 Сцинтилляции и сцинтилляторы

Основными характеристиками сцинтилляторов являются: световой выход, спектральный состав излучения и длительность сцинтилляций. При прохождении заряженной частицы через сцинтиллятор в нем возникает некоторое число фотонов с той или иной энергией. Часть этих фотонов будет поглощена в объеме самого сцинтиллятора, и вместо них будут испущены другие фотоны с несколько меньшей энергией. В результате процессов реабсорбции наружу будут выходить фотоны, спектр которых характерен для данного сцинтиллятора. Световым выходом или конверсионной эффективностью сцинтиллятора называется отношение энергии световой вспышки, выходящей наружу, к величине энергии Е заряженной частицы, потерянной в сцинтилляторе. Каждый сцинтиллятор испускает не моноэнергетические кванты, а сплошной спектр, характерный для данного сцинтиллятора. Очень важно, чтобы спектр фотонов, выходящих из сцинтиллятора, совпадал или хотя бы частично перекрывался со спектральной характеристикой ФЭУ. Степень перекрытия внешнего спектра сцинтилляции со спектральной характеристикой ε(ν) данного ФЭУ определяется коэффициентом согласования

На практике при сравнении сцинтилляторов, сочетаемых с данными ФЭУ, вводят понятие сцинтилляционной эффективности. Сцинтилляционная эффективность учитывает как число фотонов, испускаемых сцинтиллятором на единицу поглощенной энергии, так и чувствительность данного ФЭУ к этим фотонам. Обычно сцинтилляционную эффективность данного сцинтиллятора определяют путем сравнения со сцинтилляционной эффективностью сцинтиллятора, принятого за эталон.

Процессы люминесценции (высвечивания) фосфора делят на два вида: флуоресценции и фосфоресценции. Если высвечивание происходит непосредственно во время возбуждения или в течение промежутка времени порядка 10 -8 сек, то процесс называется флуоресценцией. Интервал 10 -8 сек выбран потому, что он по порядку величины равен времени жизни атома в возбужденном состоянии для так называемых разрешенных переходов. Хотя спектры и длительность флуоресценции не зависят от вида возбуждения, выход же флуоресценции существенно зависит от него. Так при возбуждении кристалла α-частицами выход флуоресценции почти на порядок меньше, чем при фотовозбуждении. Под фосфоресценцией понимают люминесценцию, которая продолжается значительное время после прекращения возбуждения. Но основное различие между флуоресценцией и фосфоресценцией заключается не в длительности послесвечения. Фосфоресценция кристаллофосфоров возникает при рекомбинации электронов и дырок, возникших при возбуждении. В некоторых кристаллах возможно затягивание послесвечения за счет того, что электроны и дырки захватываются «ловушками», из которых они могут освободиться, лишь получив дополнительную необходимую энергию. Отсюда очевидна зависимость длительностифосфоресценции от температуры. В случае сложных органических молекул фосфоресценция связана с пребыванием их в метастабильном состоянии, вероятность перехода из которого в основное состояние может быть малой. И в этом случае будет наблюдаться зависимость скорости затухания фосфоресценции от температуры. Сцинтилляционные детекторы основаны на регистрации люминесценции, вызываемой действием излучения на люминофоры, в которых энергия излучения преобразуется в световые вспышки(сцинтилляции). Люминофоры, используемые для этих целей, обычно называются сцинтилляторами. В качестве сцинтилляторов используются различные вещества (твёрдые, жидкие, газообразные).

Сцинтиллятор может быть органическим (кристаллы, пластики или жидкости) или неорганическим (кристаллы или стекла). Используются также газообразные сцинтилляторы. Неорганические сцинтилляторы. Неорганические сцинтилляторы представляют собой кристаллы неорганических солей. Практическое применение в сцинтилляционной технике имеют главным образом галоидные соединения некоторых щелочных металлов. Для увеличения светового выхода таких сцинтилляторов вводятся специальные примеси других элементов, называемых активаторами (например, таллий). Сцинтиллятор, построенный на основе кристалла NaJ(Tl), обладает большим световым выходом. В качестве твёрдотельных неорганических сцинтилляторов используются, NaCl(AgCl), NaI (активированный Tl), LiI(Eu), LiF(Eu), CsI(Tl), KI(Tl), Bi4Ge3O12 (BGO) и др. Все они позволяют выращивать крупные кристаллы, которые затем соответствующим образом обрабатываются. Эти сцинтилляторы применяются для регистрации γ-излучения, так как обладают большим средним порядковым номером Z и высокой плотностью. Малой гигроскопичностью обладают кристаллы CsI, которые могут использоваться в сцинтилляционных счётчиках даже в атмосферных условиях. Перечисленные сцинтилляторы обладают, относительно близкими временами высвечивания порядка 10 -6 сек, что в основном определяет порядок разрешающего времени счётчика на их основе. Сравнительно новыми являются сцинтилляторы на основе кристаллов ортогерманата висмута (Bismuth Germanate Oxide)- BGO. Имея большую плотность, по сравнению с NaI, BGO-детекторы обладают значительно большей эффективностью регистрации γ-излучения, особенно в высокоэнергетической области. Так, для достижения одинаковой точности измерений спектрометров на базе BGO и NaI, последнему необходимо увеличить время экспозиции в 3,3 раза. К недостаткам BGO можно отнести малую светосилу и довольно невысокое разрешение, по сравнению с традиционными сцинтилляторами. Ожидается внедрение в радиометрию кристаллов вольфрамата кадмия - CdWO4 (CWO), по ряду характеристик превосходящих BGO. Также имея высокую эффективность регистрации, CWO-сцинтилляторы обладают лучшим разрешением, большим световыходом и его низкой температурной зависимостью от окружающей температуры. Cцинтилляционные кристаллы бромида лантана, легированные церием, LaBr3(Ce) обладают более высоким энергетическим разрешением и коротким временем высвечивания, чем традиционные кристаллы NaI(Tl), Энергетическое разрешение для энергии гамма-излучения 662 кэВ составляет 2,9 % (19 кэВ) (для кристалла NaI(Tl) аналогичного размера при тех же условиях, разрешение равно 6%), а также более высокой эффективностью регистрации и хорошей температурной стабильностью. Потому устройство детектирования на основе LaBr3(Ce) позволят уверенно анализировать образцы со сложными спектрами гамма-излучателей. Высокое разрешение напрямую ведет к улучшению качества идентификации радионуклидов в исследуемых образцах; значения минимально измеряемой активности, за идентичные интервалы времени, уменьшаются и как следствие уменьшаются времена измерения образцов для достижения требуемого результата; высокая температурная стабильность устройств детектирования позволяет эффективно применять их при тяжелых температурных воздействиях внешней среды. Существует большое количество сцинтилляторов, весьма эффективных, но из них не удаётся вырастить большие кристаллы для детекторов. Например, ZnS(Tl) - обладает малой гигроскопичностью, высокой конверсионной эффективностью, достигающей 20-25% и практически независимой от энергии регистрируемых частиц. В этой связи следует также упомянуть ZnS(Ag) используемый для регистрации α- излучения. Сульфид цинка широко применяется при изготовлении детекторов как мелкокристаллический порошок, в виде тонного слоя, нанесённого на прозрачную основу, например, оргстекло. Такие детекторы имеют невысокое разрешающее время 10 -3 сек, но с успехом используются при регистрации тяжёлых заряженных частиц. Если к такому порошку подмешать боросодержащий компонент, например В2О3 - получим хороший детектор для регистрации медленных и тепловых нейтронов (по ядерной реакции 3 2 10 5 В n α Li , к тому же малочувствительной к сопутствующему γ- излучению. Для регистрации медленных и тепловых нейтронов пригодны также детекторы на основе LiI и LiF, допированные 6 Li: нейтроны вызывают реакцию 6 Li(n, α)T с образованием частиц высокой энергии. Но они одновременно регистрируют и γ-фон, который может быть далее дискриминирован в аппаратуре. Процесс возникновения сцинтилляций можно представить при помощи зонной теории твердого тела. В отдельном атоме, не взаимодействующем с другими, электроны находятся на вполне определенных дискретных энергетических уровнях. В твердом теле атомы находятся на близких расстояниях, и их взаимодействие достаточно сильно. Благодаря этому взаимодействию уровни внешних электронных оболочек расщепляются и образуют зоны, отделенные друг от друга запрещенными зонами. Самой внешней разрешенной зоной, заполненной электронами, является валентная зона. Выше ее располагается свободная зона - зона проводимости. Между валентной зоной и зоной проводимости находится запрещенная зона, энергетическая ширина которой составляет несколько электронвольт. Если в кристалле имеются какие-либо дефекты, нарушения решетки или примесные атомы, то в этом случае возможно появление энергетических электронных уровней, расположенных в запрещенной зоне. При внешнем воздействии, например при прохождении через кристалл быстрой заряженной частицы, электроны могут переходить из валентной зоны в зону проводимости. В валентной зоне останутся свободные места, обладающие свойствами положительно заряженных частиц с единичным зарядом и называемые дырками. Описанный процесс и является процессом возбуждения кристалла. Возбуждение снимается путем обратного перехода электронов из зоны проводимости в валентную зону, происходит рекомендация электронов и дырок. Во многих кристаллах переход электрона из зоны проводимости в валентную происходит через промежуточные люминесцентные центры, уровни которых находятся в запрещенной зоне. Указанные центры обусловливаются наличием в кристалле дефектов или примесных атомов. При переходе электронов в две стадии испускаются фотоны с энергией, меньшей ширины запрещенной зоны. Для таких фотонов вероятность поглощения в самом кристалле мала и поэтому световой выход для него много больше, чем для чистого, беспримесного кристалла. Органические кристаллические сцинтилляторы. Молекулярные силы связи в органических кристаллах малы по сравнению с силами, действующими в неорганических кристаллах.

Поэтому взаимодействующие молекулы практически не возмущают энергетические электронные уровни друг у друга и процесс люминесценции органического кристалла является процессом, характерным для отдельных молекул. В основном электронном состоянии молекула имеет несколько колебательных уровней. Под воздействием регистрируемого излучения молекула переходит в возбужденное электронное состояние, которому также соответствует несколько колебательных уровней. Возможны также ионизация и диссоциация молекул. В результате рекомбинации ионизованной молекулы, она, как правило, образуется в возбужденном состоянии. Первоначально возбужденная молекула может находиться на высоких уровнях возбуждения и через короткое время (~10 -11 сек) испускает фотон высокой энергии. Этот фотон поглощается другой молекулой, причем часть энергии возбуждения этой молекулы может быть израсходована на тепловое движение и испущенный впоследствии фотон будет обладать уже меньшей энергией по сравнению с предыдущим. После нескольких циклов испускания и поглощения образуются молекулы, находящиеся на первом возбужденном уровне; они испускают фотоны, энергия которых может оказаться уже недостаточной для возбуждения других молекул и, таким образом, кристалл будет прозрачным для возникающего излучения. Благодаря тому, что большая часть энергии возбуждения расходуется на тепловое движение, световой выход (конверсионная эффективность) кристалла сравнительно невелик и составляет несколько процентов. Рис. 3. Упаковка кристалла: 1 - алюминиевая крышка ; 2 -дюралевый корпус; 3 - отражатель из оксида магния; 4 - стекло. В качестве твёрдых органических сцинтилляторов часто используются монокристаллы антрацена (C14H10), стильбена (C14H12), нафталина (C10H8) с антраценом (5%), толан (дифенилацетилен) и др. Все органические сцинтилляторы обладают по сравнению с неорганическими, меньшими временами высвечивания и меньшей плотностью. Детекторы на их основе отличаются хорошей разрешающей способностью, обычно 10 -6 - 10 -8 сек, но меньшей эффективностью к γ- излучению. Обычно они, в различном конструктивном оформлении используются для регистрации и спектрометрии α- и β-частиц. Монокристаллы стильбена и толана, например, легко выращиваются до больших размеров и имеют самые короткие времена высвечивания. Стильбен хотя и обладает несколько меньшим световым выходом, чем антрацен, но зато длительность сцинтилляции у него значительно меньше (710 -9 сек), чем у антрацена, что позволяет использовать его в тех экспериментах, где требуется регистрация очень интенсивного излучения. Рис. 4. Схема контейнера типа А. Кристаллические сцинтилляторы выпускаются для счёта и спектрометрии. Иногда в них делается колодец, для обеспечения 4π- геометрии.

Пластмассовые сцинтилляторы. Пластмассовые сцинтилляторы представляют собой твердые растворы флуоресцирующих органических соединений (n-Терфенил, 2,5-Дифенилоксазол, 1-Фенил-2-[4-бифенил]- этилен и др.) в подходящем прозрачном веществе. Например, растворы антрацена или стильбена в полистироле, или плексигласе. Концентрации растворенного флуоресцирующего вещества обычно малы и составляют несколько десятых долей процента или несколько процентов. Рис. 5. Контейнер типа Ж с колодцем. Так как растворителя много больше, чем растворенного сцинтиллятора, то, естественно, регистрируемая частица производит в основном возбуждение молекул растворителя. Энергия возбуждения в дальнейшем передается молекулам сцинтиллятора. Очевидно, что спектр испускания растворителя должен быть более жестким, чем спектр поглощения растворенного вещества, или по крайней мере совпадать с ним. Экспериментальные факты показывают, что энергия возбуждения растворителя передается молекулам сцинтиллятора за счет фотонного механизма, т. е. молекулы растворителя испускают фотоны, которые затем поглощаются молекулами растворенного вещества. Возможен и другой механизм передачи энергии. Так как концентрация сцинтиллятора мала, то раствор оказывается практически прозрачным для возникшего излучения сцинтиллятора. Пластмассовые сцинтилляторы характеризуются: малым временем высвечивания порядка 10 -8 - 10 -9 сек, удовлетворительной устойчивостью к воздействию облучений, пропорциональной зависимостью высот импульсов сцинтилляций от энергии излучения. Сцинтилляционная эффективности лучших пластмассовых сцинтилляторов достигает 70% эффективности монокристаллов стильбена. Ценным свойством пластмассовых сцинтилляторов является их прозрачность к собственному излучению. Сцинтиллирующие пластмассы легко изготовляются, механически обрабатываются и дают интенсивное свечение. В качестве примера можно назвать твёрдые растворы терфенила или антрацена в полистироле. Фосфоры-пластики могут быть изготовлены больших объёмов и любой формы (блочные детекторы, плёнки, капилляры и т.п.). Пластмассовые сцинтиллирующие детекторы имеют эффективности ниже введённого вещества-сцинтиллятора из-за меньшей его концентрации на единицу объёма детектора. Зато такие детекторы не боятся механических воздействий, влаги и могут эксплуатироваться в диапазоне температур (-190 - +70 о С). Их применяют для регистрации заряженных частиц. Они чувствительны также и к γ-излучению. Органические сцинтилляторы в кристаллическом и заполимеризованном виде используются для регистрации быстрых нейтронов благодаря эффекту упругого их рассеяния в материале детектора и возникающим при этом ядрам отдачи. Однако в каждом случае следует оценить степень влияния на результат сопровождающего нейтронный поток γ-излучения. Жидкие органические сцинтилляторы представляют собой растворы флуоресцирующих веществ в прозрачных растворителях, мало поглощающих энергию излучения в фиолетовой и ультрафиолетовой частях спектра. Растворители являются очищенные м-ксилол, толуол, фенилциклогексан, сцинтиллирующими добавками n-Терфенил, 2,5-Дифенилоксазол (ППО), 1,4-Ди-[2-(5-фенилоксазолил)]-бензол (ПОПОП), 2,5-Ди- (1-нафтил)-1,3,4-оксадиазол, 1-Фенил-2(4-бифенил)-этилен, Кватерфенил и др. Наибольшим световым выходом обладает сцинтиллятор, изготовленный при растворении р-терфенила в ксилоле при концентрации растворенного вещества 5 г/л. Ценным свойством жидкостных сцинтилляторов является малое время высвечивания (10 -8 - 10 -9 сек), хорошая прозрачность для собственного излучения и возможность изготовлять их в любых объёмах и сосудах. Механизм флуоресценции в жидких сцинтилляторах аналогичен механизму, происходящему в твердых растворах - сцинтилляторах. Использование жидкостей позволяет получать неограниченные объёмы фосфоров. Жидкостной детектор обычно представляет собой стеклянный сосуд, по диаметру катода ФЭУ, наполненный сцинтиллирующим раствором и установленный непосредственно на фотокатод ФЭУ. Измеряемый радиоактивный образец помещается внутрь жидкого объёма или смешивается с жидким сцинтиллятором. Для повышения эффективности такого жидкостного счётчика - максимум спектра излучения паратерфенила сдвигают к максимуму чувствительности фотокатода используемого ФЭУ путём добавок в раствор сцинтиллятора, в рекомендованных пропорциях, так называемых «сдвигающих добавок». В качестве таких добавок часто используют стандартные препараты РОРОР, РРО и др. Жидкостные сцинтилляционные детекторы широко применяются в радиометрии образцов, содержащих низкоэнергетические β-частицы. Ихприменяют и для регистрации γ-излучения, а также нейтронов. В последнем случае в органических жидкостях растворяют вещество, в котором нейтроны вызывают ядерную реакцию с образованием заряженной частицы. Однако в больших потоках нейтронов (более 10 12 нейтрон/см 2 /сек) практически детекторы на основе традиционных органических растворителях выходят из строя. Для работы с большими нейтронными потоками используется проточный сцинтилляционный детектор нейтронов, использующий в качестве индикатора известную ядерную реакцию 6 Li + n → α + T. Детектор состоит из пленки 6 Li (3х3 мм) толщиной 10 мкм, заключенной в майларовую оболочку толщиной 1 мкм, которая служит для изоляции лития от окружающей среды и создания (помещенной в алюминиевую рамку) конструкции, которая омывается с двух сторон потоком жидкого фторсодержащего сцинтиллятора. Свет сцинтилляции с каждой стороны через свой световод попадает на фотокатод своего фотоумножителя. Направления потоков сцинтиллятора, нейтронного потока и снимаемого светового потока на фотоумножитель взаимоперпендикулярны, что позволяет, в принципе, защитить ФЭУ от нейтронного облучения. В результате ядерной реакции на 6 Li α-частица и тритий регистрируются по разные стороны пленки 6 Li (в различных объемах сцинтиллятора) каждый своим ФЭУ, которые включены на совпадение, что позволяет существенно снизить фон.

Проточный жидкосцинтилляционный детектор для регистрации высоких потоков нейтронов. Концентрация флуоресцирующего вещества обычно мала и регистрируемая частица возбуждает в основном молекулы растворителя. В дальнейшем энергия возбуждения передается молекулам флуоресцирующего вещества. Широко развивается техника жидкостно-сцинтилляционных измерений, при которых препараты радиоактивных веществ вводятся (растворяются, эмульгируются и т.п.) непосредственно в жидкостно- сцинтилляционную смесь, что обеспечивает простоту приготовления препаратов, выгодные геометрические условия измерений, исключает потери, связанные с ослаблением излучения. Так как в органических сцинтилляторах возбуждаются молекулярные уровни, которые излучают в ультрафиолетовой области для согласования со спектральной чувствительностью регистрирующих светустройств (ФЭУ и фотодиодов) используются светопреобразователи, которые поглощают ультрафиолетовое излучение и переизлучают видимый свет в области 400 нм. Газовые сцинтилляторы. При прохождении заряженных частиц через различные газы в них наблюдалось появление сцинтилляций. Наибольшим световым - выходом обладают тяжелые благородные газы (ксенон и криптон). Большим световым выходом обладает также смесь ксенона и гелия. Присутствие в гелии 10% ксенона обеспечивает световой выход, даже больший, чем у чистого ксенона. Ничтожно малые примеси других газов резко уменьшают интенсивность сцинтилляций в благородных газах. Для исследования заряженных частиц малых энергий (< 0,1 Мэв) и осколков деления ядер в качестве сцинтилляторов применяются газы (Табл. ), в основном - инертные газы (Xe, Kr, Ar, He), из которых основным является ксенон. В этом случае катод фотоумножителя помещается в соответствующий светоизолированный газонаполненный объём. Измеряемый радиоактивный объект помещается также в этот газонаполненный объём. Спектры излучения этих благородных газов находятся в фиолетовой области спектра. Экспериментально было показано, что длительность вспышек в благородных газах мала (10 -9 -10 -8 сек), а интенсивность вспышек в широком диапазоне пропорциональна потерянной энергии регистрируемых частиц и не зависит от их массы и заряда. Газовые сцинтилляторы обладают малой чувствительностью к γ- излучению. Газы обладают линейной зависимостью величины сигнала от энергии частицы в широком диапазоне энергий, быстродействием и возможностью менять тормозную способность изменением давления. Кроме того, источник может быть введён в объём газового сцинтиллятора. Однако газовые сцинтилляторы требуют высокой чистоты газа и специального ФЭУ с кварцевыми окнами (значительная часть излучаемого свет лежит в ультрафиолетовой области).

. Введение радиоактивной метки в биологический препарат: in vitro и in vivo

Если синтез белка или нуклеиновой кислоты ведут в полной ферментативной системе in vitro (в пробирке) с использованием радиоактивно меченых низкомолекулярных предшественников, то оценить включение радиоактивности в биополимер можно с использованием счета радиоактивности конечного продукта на фильтре. Для задержания белков или нуклеиновых кислот после осаждения их из реакционной смеси трихлоруксусной кислотой (ТХУ) или этанолом можно использовать фильтры из толстой фильтровальной бумаги или стекловолокна с размером пор 0,45-1,2 ц. Второй вариант предполагает использование имеющихся в продаже мембранных фильтров из нитроцеллюлозы (без осаждения). В этом случае задержание продукта реакции на фильтре обусловлено его сорбцией. Нитроцеллюлоза прочно сорбирует щелочные белки, рибосомы и однонитевые (денатурированные) молекулы ДНК. Следует отметить, что в случае использования бумажных или стекловолокнистых фильтров часть радиоактивного продукта проникает в глубь фильтра, а на мембранном - весь он тонкой пленкой распределяется по поверхности. С точки зрения надежного контакта со сцинтиллятором второй вариант предпочтительнее. Но мембранные фильтры намного дороже бумажных или стекловолокнистых. Для данной цели удобны фильтры диаметром 24 мм, что позволяет легко вносить их во флаконы сцинтилляционного счетчика.

В колбу Бунзена вставляют на резиновой пробке кольцевую подложку для фильтра из нержавеющей стали в виде решетки с кольцевым шлифованным фланцем. На нее кладут фильтр , а на фильтр ставят резервуар, выточенный из такой же стали и тоже со шлифованным фланцем. Фланцы сжимают пружинными зажимами. Такая легко разборная конструкция удобна для манипуляций с фильтром.

В резервуар заливают реакционную смесь со взвешенным в ней осадком исследуемого продукта (в первом варианте) или без осадка (во втором варианте) и при небольшом разрежении отсасывают жидкость. Радиоактивные предшественники вымывают 5-6 раз сменяя в резервуаре промывную жидкость, не способную растворить осадок. (Например, ту же, в которой велось осаждение полимера)

Если фильтров много, то, пронумеровав их предварительно по краю карандашом, можно промывку вести "в объеме", большими партиями, сменяя промывную жидкость каждые 15 минут и периодически встряхивая ее. Последние промывки в любом случае ведут этанолом, затем эфиром для полного удаления воды во время последующей сушки фильтров. Это особенно важно для "объемных": бумажных и стекловолокнистых фильтров, где вода должна быть полностью удалена из внутренних пор, так как просчет радиоактивности осадка на фильтре ведут во флаконе с чистым толуоловым сцинтиллятором. Остатки воды в порах могут преградить сцинтиллятору доступ к радиоактивному веществу. Хорошо высушенный фильтр в толуоловом сцинтилляторе выглядит однородно полупрозрачным. Сушку ведут на воздухе при комнатной температуре 15-20 минут (до исчезновения запаха эфира). Положение "объемного" фильтра во флаконе, - лежа на дне или стоя на ребре, - не играет существенной роли. Вспышки света при испускании (3-электронов все равно "засвечивают" всю жидкость во флаконе и будут замечены обоими ФЭУ. Впрочем, мембранный фильтр, все-таки, лучше положить на дно пленкой вещества вверх.

В случае малых объемов инкубационной смеси даже в первом варианте использования фильтров не обязательно проводить реакцию и осаждение полимера в объеме для последующего сбора осадка фильтрованием. До 50 мкл реакционной смеси можно просто нанести на бумажный фильтр и дать жидкости впитаться. Эту операцию можно провести за один прием для нескольких десятков пронумерованных фильтров, ряд за рядом наколотых булавками на слой резины, так чтобы они ее не касались. Затем резину с фильтрами помещают во влажную камеру, термостатированную при температуре ферментативной реакции. По ее окончании фильтры вместе с булавками снимают и помещают в большой стакан, заполненный 5%-ным раствором ТХУ или этанолом. Осаждение полимера будет происходить внутри фильтров. (С булавок фильтры снимать не следует, так как булавки предохраняют их от слипания) Там же, в стакане производят и все промывки. Затем фильтры снова накалывают на резину, сушат и помещают во флаконы со сцинтиллятором в порядке их номеров.

Разумеется, при использовании фильтров эффективность счета снижается по сравнению с просчетом препарата, растворенного в сцинтилляторе. Некоторая часть энергии (3-электронов теряется на соударения с материалом осадка и пространственной сеткой фильтра. Однако Р-электрон, потерявший часть энергии, вовсе не обязательно уже неспособен вызвать световую вспышку в сцинтилляторе. А для счета важно только число импульсов в минуту, а не их амплитуда (за исключением счета двойной метки). Тем не менее, следует контролировать тормозящие факторы - толщину и плотность осадка, а также и самого фильтра, с тем, чтобы по возможности уменьшить число импульсов, оказавшихся не просчитанными из-за слишком большой потери энергии по дороге к сцинтиллятору.vivo.

Проще всего предоставить непростую, а иногда и небезопасную операцию введения метки самой природе. Для этого в питательную среду вносят радиоактивно меченый предшественник синтеза интересующего нас вещества в организме. Проще всего это сделать для бактерий. Меченый по тимидин за 1 час легко включается в ее ДНК до уровня, составляющего около 10% внесенной в среду радиоактивности. Точно так же метят ДНК в животных клетках, растущих в культуре ткани.

Импульсную метку в иРНК бактерий осуществляют путем введения в питательную среду С-урацила или того же Р-ортофосфата - после исчерпания или отмывки нерадиоактивного фосфора. Ввиду быстроты протекания процессов метаболизма у бактерий продолжительность такого импульса должна быть небольшой (10-30 сек.). После чего жизнедеятельность бактерий надо немедленно прекратить, например, вылить их суспензию на мелко раздробленный лед, содержащий азид натрия.

Метку в бактериальные белки, как и в белки высших организмов в культуре клеток, удобнее всего вносить с помощью меченого по С или S метионина. Напомню, что метионин является незаменимой аминокислотой (т.е. не синтезируется в самом организме) для клеток всех высших животных и некоторых бактерий. Кроме того, с него начинается синтез любого белка, что позволяет следить за началом этого процесса.

Введение метки через диету животных практически не используется, так как радиоактивные изотопы по путям метаболизма включаются во многие биологические молекулы. Кроме того разбавление радиоактивной метки происходит за счет собственных запасов организма, например, незаменимых аминокислот, полученных в результате катаболизма (расщепления) собственных белков. Все это требует большого расхода дорогостоящих радиоактивных препаратов и связано с повышенной степенью радиационной опасности.

Здесь уместно заметить, что радиоактивная метка вводится, точнее сказать, создается в аминокислотах, нуклеотидах и других биологических значимых молекулах путем специального облучения в атомных реакторах. Каталоги специализированных зарубежных фирм содержат многие сотни наименований радиоактивно меченых молекул. Чего, к сожалению, нельзя сказать об отечественной продукции

Заключение

Метод меченых атомов широко используется в современном мире. Его применяют для решения как фундаментальных, так и прикладных биологических проблем, изучение которых другими методами затруднено или невозможно. Существенное для биологии преимущество метода меченых атомов <#"justify">Трудно переоценить его значение. Он применяется в разных областях науки и техники и позволяет глубже и полней познать законы природы, облегчить труд человека и спасти сотни тысяч людей от преждевременной смерти.

Список использованных источников

1.Авдонин П.В., Ткачук В. А, Рецепторы и внутриклеточный кальций. 1994. - Наука, Москва. - С.29-42.

2.Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементы человека, Медицина. М. - 1991.

.Гааль, Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982.

.Гекселер К., Экштайн Э. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994.

.Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989.

.. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.

.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981.

.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.:МЦНМО, 2002.

.Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е.Северина и Г.А.Соловьёвой. М.: Издательство МГУ, 1989

10.<http://www.bibliotekar.ru/spravochnik-181-3/23.htm>

.<http://mikroorganizmy.ru/azot-v-udobrenii/metod-mechenyx-atomov.html>