Антиоксидантные свойства новых селеносодержащих веществ в зависимости от их спектральных и структурных характеристик
Оглавление
Введение
1. Активированные кислородные метаболиты. Антиоксиданты. Селен как составляющая антиоксидантной системы
1.1 Активированные кислородные метаболиты
1.2 Характеристика основных форм АКМ
1.3 Антиоксиданты и ингибиторы
2. Селен в антиоксидантной системе
Список используемой литературы
Введение
Кислород является самым распространённым химическим элементом биосферы, его соединения в состав всех живых организмов на планете. Наиболее широко представлена восстановленная форма кислорода, или вода (H2O); для высших форм жизни необычайно важен молекулярный кислород (O2), реакция восстановления которого до H2O составляет основу биоэнергетики организма человека и животных [1].
Около 90% потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): O¯2, 1O2, H2O2, HO, OCl¯, RO2 и др. Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Связанные радикалы, такие как компоненты цепи транспорта электронов в митохондриях, также широко представлены в клетках, однако их локализация в определённых структурах ограничивает "свободное" взаимодействие с другими молекулами [2]. По оценке Гельмута Эстербауэра, человек за 70 лет жизни потребляет 17 000 кг кислорода; за это время в организме нарабатывается 800-1700 кг кислородных радикалов. АКМ, образующиеся в процессе нормальной жизнедеятельности животной клетки, индуцируют в ДНК около 10 000 повреждений за сутки [3]. При этом генерация АКМ, очевидно, есть не эволюционная ошибка (неудача), а, напротив, - характерный физиологический процесс, результат революционного отбора [4].
Образование АКМ, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, и организма в целом, в кислородосодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляет ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса, который является составным элементом целого ряда патологических процессов и заболеваний, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхолёгочные заболевания, старение, канцерогенез и др. [5] [6].
Важную роль в антиоксидантной системе играет селен. Хотя сам по себе селен и не является "прямым" антиоксидантом, он принимает активнейшее участие в процессе синтеза фермента глутатионпероксидазы - мощнейшего антиоксидантного вещества, предохраняющего клеточные мембраны от разрушительного воздействия свободных радикалов. Без достаточного содержания селена этот важнейший фермент просто не будет образовываться. В качестве антиоксиданта и детоксикатора ядовитых веществ селен защищает организм от сердечных заболеваний, усиливает иммунитет, увеличивает продолжительность жизни. Действуя совместно с другими антиоксидантами - витаминами Е и С, селен помогает улучшить мыслительные способности, снижает депрессию, прогоняет усталость.
1. Активированные кислородные метаболиты. Антиоксиданты. Селен как составляющая антиоксидантной системы
1.1 Активированные кислородные метаболиты
Общие сведения
АКМ - высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменении спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях.
Применительно к биологическим системам понятия "свободные радикалы" и "АКМ" не совпадают - неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота; так, для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Sи N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалогениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие "активные формы кислорода" или "активные метаболиты кислорода", которым обозначают ферментативные продукты активации кислорода. По аналогии с активными формами кислорода иногда говорят об активных формах азота, обозначая так продукты преобразования NO-радикалов (NO, NO+, NO¯, NO2, ONOOH), активных формах галогенов (HOCl, OCl¯,HOBr, HOI), активных формах липидов (L, LO, LO2, LOOH) [5]. В биологическом плане наиболее удачно понятие "активированные кислородные метаболиты", под которым подразумевается широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы.
В живых организмах существуют два принципиально разных источника АКМ: радикальные окислительные реакции и металлопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов, а появление АКМ является результатом неполного восстановления молекулы O2.
1.2 Характеристика основных форм АКМ
Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закреплённые и участвующие в цепях переноса электронов. Такое деление достаточно условно, в частности, непонятно, к свободным или связанным относятся в таком случаем убисемихинонные радикалы, которые достаточно легко перемещаются в липидных мембранах. Введённые в последующем понятия "активные формы кислорода и азота" ("reactiveoxygenandnitrogenspecies"), "активные формы хлора", "активные формы липидов" отражали желание исследователей строго определить и классифицировать весьма разнородный класс соединений, объединённых нами под общим названием активированных кислородных метаболитов (АКМ). Сегодня наиболее удачная классификация таких соединений предложена Ю.А. Владимировым, согласно которой все образующиеся в организме АКМ в зависимости от происхождения могут быть разделены на первичные, вторичные и третичные; среди причин появления чужеродных форм АКМ также можно выделить 3 основных фактора: радиация, оптические излучения и ксенобиотики [3]. Деление АКМ на природные и чужеродные оправдано с позиций их биологической значимости.
Действительно, основной функцией природных форм АКМ является регуляторная, затем защитная, в определённых ситуациях, как правило, патологических, они могут становиться токсичными и индуцировать развитие деструктивных процессов, однако такие ситуации являются исключением, а не правилом. Образующиеся при действии радиации или в процессе фотодинамической терапии чужеродные формы АКМ, также как радикалы, возникающие в процессе метаболизма ксенобиотиков, обладают выраженным цитотоксическим и деструктивным действием.
Таблица 1
Классификация АКМ, образующихся в клетках человека и животных
ПриродныеПервичные Вторичные ТретичныеO2¯, H2O2, NO, CoQo¯ или CoQ10¯ OH, RO, RO2, 1O2, HOCl, HOBr Радикалы антиоксидантовЧужеродныеРадиация УФ-излучение КсенобиотикиOH, H, R R, RO, RO2, 1O2 Радикалытоксинов
Иногда в целях регуляторного воздействия применяются доноры NO; попытки усилить защитные функции организма посредством индукции образования АКМ сегодня носят достаточно экзотический характер. Первичные формы АКМ или радикалов образуются с участием специализированных молекулярных механизмов, таких как мембранные НАДФН-оксидазы (восстанавливают O2 в O2¯), NO-синтазы (продуцируют NO) или фотосенсибилизированные процессы, являющиеся основными источниками 1O2. Как правило, эти продукты ферментативного восстановления O2 или его активации, количество весьма ограничено: O2¯, H2O2, ОH, NO, 1O2. Строение и заполнение молекулярных орбиталей O2 подчиняются квантовым законам, что существенно ограничивает количество образующихся продуктов. Первичные АКМ инициируют образование в реакциях свободнорадикального окисления большего числа вторичных радикалов липидов, белков, сахаров, нуклеиновых кислот, многие из которых более токсичны [7]. Деление на первичные и вторичные АКМ или радикалы вполне оправдано, так как позволяет при патологических процессах выделить главные молекулярные механизмы генерации АКМ. Однако, как и в случае с многими другими понятиями свободнорадикальной биологии, дать строгие определения первичных, вторичных и третичных радикалов сложно, так же как сложно точно определить понятие антиоксиданта.
Биологическая роль АКМ
Общая особенность АКМ - высокая реакционная способность и малые значения времён жизни в биологических субстратах, что делает их эффективным инструментом локального действия [8]. Так, действие OH-радикала (радиус диффузии 23 Å) [9] ограничено размером средней ограниченной молекулы (например, величина молекулы пепсина - молекулярная масса 35 кДа - составляет 37 × 74 Å). Анион-радикал O2¯ и синглетный кислород обладают большим радиусом действия, сравнимым с размером клетки, однако уже на клеточном уровне их эффект строго локализован наличием высокоэффективного ферментативного антиоксиданта - супероксиддисмутаза (СОД), а также других антиоксидантов - таких, как витаминE, который инактивирует 1O2посредством физического взаимодействия на расстоянии ~ 50 Å. Сфера влияния радикалов NOраспространяется уже на определённые клеточные структуры, такие как мышечные клетки сосудов, что вызывает их релаксацию, при этом оксид азота принципиально не отличается от гормональных мессенджеров и имеет свой "рецептор" - растворимую гуанилатциклазу. Наибольшим дальнодействием, проявляющимся на тканевом и организменном уровнях, обладают продукты радикальных реакций; так, процессы ПОЛ приводят к образованию альдегидов, эпоксидов, липидных перекисей, которые ингибируют синтез ДНК и деление клеток и в то же время индуцируют развитие опухоли. По-видимому, ПОЛ и его продукты, выступая в роли "первичного медиатора" стресса или "SOS-ответа", представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов, который в процессе эволюции трансформировался в ферментативную эйкозаноидную регуляцию. Окисленные фосфолипиды по свойствам сходны с фактором активации тромбоцитов и могут имитировать действие цикотина на клетки непосредственно через специфический для него рецептор.
Высокая реакционная способность АКМ делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях - от молекулярно-клеточного до организменного. В конце 40-х годов толчком для широкого изучения токсических эффектов АКМ послужили исследования действия радиации на живые организмы. В настоящее время можно утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения; деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции, и связанного с хроническим воспалением опухолеобразования; постишемических, реперфузионных и гипероксических повреждений; а также целого ряда бронхолёгочных, сердечно-сосудистых и других заболеваний. Вместе с тем механизм патофизиологического действия АКМ во многих случаях не ясен, так как утверждение о патофизиологической роли АКМ обычно строится на двух косвенных аргументах: а) интенсивность продукции АКМ коррелируют с развитием патологического процесса; б) ингибиторы АКМ обладают защитным действием.
Открытие явления дыхательного "взрыва" в фагоцитах послужило началом широкого изучения микробицидного действия АКМ, их роли в защите организма. При этом ярко выявилось, что генетически обусловленные нарушения механизмов генерации АКМ (больные с хронических гранулематозом или дефицитом миелопероксидазы) или их ингибирование лекарственным препаратами приводит к снижению неспецифического иммунитета и является причиной либо гибели организма от инфекций, либо развития хронических патологий.
В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффектов АКМ, к которым прежде всего относятся регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определённых генов. Показано функционирование АКМ в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров. Так, АКМ непосредственно участвуют в активации онкогенов c-focи с-myc, а также гена c-jun, кодирующего главную форму фактора транскрипции AP-1, в ответ на ионизирующую радиацию. O2¯и H2O2 активируют фактор транскрипции NF-кB, который вызывает экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, а NOподавляет активацию NF-кB, индуцируя экспрессию ингибитора фактора транскрипции IкBαи стабилизируя его. Стимуляция НАДФН-оксидазы нейтрофилов сопровождается активацией тирозинкиназ, при этом повышение накопления фосфотирозина обусловлено не только активацией АКМ фосфорилирования тирозина, но и ингибированием дефосфорилирования. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжёлых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси водорода. Выделяемая из облучённых фоторецепторов H2O2 увеличивают длину и количество микроворсинок клеток пигментированного эпителия, что способствует более тесному контакту этих двух типов клеток и реализации антиоксидантных функций эпителия. NOи COсвязываются с гемовой частью гуанилатцитклазы и обратимо изменяют синтез цГМФ, являясь важным компонентом внутри - и внеклеточной коммуникации. NOучаствует в посттранскрипционном контроле метаболизма железа.
Таким образом, образование АКМ в организме нельзя рассматривать, как существующий, но не обязательный элемент процесса жизнедеятельности. Окислительные процессы с участием АКМ является неотъемлемым звеном существования высших форм живых организмов, негэнтропийное состояние которых поддерживается посредством снижения электронной упорядоченности молекулярного кислорода в результате его восстановления. Однако многие вопросы регуляторной функции АКМ, их взаимодействия с антиоксидантами, физиологической и патофизиологической роли сегодня всё ещё остаются спорными.
1.3 Антиоксиданты и ингибиторы
Антиоксидант - это любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление [10].
По химической природе биоантиокислители представляю собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза ГПО), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол, конидендрин, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны (лецитин, кефалин) и многие другие соединения. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамины E, A, K, стерины, убихинон) и водорастворимые (витамины С, B6, PP, серотонин, SH-содержащие соединения) биоантиокислители [9], по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, аскорбат, β-каротин, α-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных, не способных проникать через биологические барьеры (ферритин, каталаза, пероксидазы и др.).
По принципу антиокислительного действия в биологических системах все антиоксиданты могут быть разделены на антиоксиданты косвенного (опосредованного) действия и антиоксиданты прямого (направленного) действия. Такое деление удобно при рассмотрении патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса, в этом случае все соединения, повышающие синтез эндогенных антиоксидантов, нормализующие метаболические процессы и стабилизирующие клеточные структуры, могут быть отнесены к антиоксидантам косвенного действия. Естественно, что эффективность антиоксидантов косвенного действия проявляется только в живых системах. Соединения, непосредственного подавляющие окислительные процессы с участием АКМ invitroиinvivo можно рассматривать как антиоксиданты прямого действия. В зависимости от точки приложения действие антиоксиданта может осуществляться посредством одного или нескольких механизмов, при этом соединения, реализующие свой антиоксидантный эффект посредством механизмов II, III, V, VI, иногда называются превентивными антиоксидантами, в то время как пути Iи IV характерны для ингибиторов АКМ, действие которых в достаточной степени специфично.
По мере развития наших знаний об окислительных процессах с участием АКМ изменяется и представление об антиоксидантных механизмах защиты. До недавнего времени рассматривалась преимущественно патогенная функция АКМ, реализующаяся посредством активации процессов ПОЛ в биомембранах; при этом считалось, что как в норме, так и при патологических процессах необходимо ингибировать наработку АКМ и снижать активность ПОЛ. Исследования последних лет выявили участие АКМ в регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтеза простагландинов, в микробицидном действии фагоцитов, в регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мессенджеров. При этом поднимается вопрос о целесообразности в определённых ситуациях ингибирования наработки АКМ, что имеет важное практическое значение, так как с позиций существующих представлений сложно объяснить лечебный эффект введения перекиси водорода в низких концентрациях или аутотрансфузии УФ-облучённой крови. Применение антиоксидантных витаминов (Е, С) и β-каротина в целях профилактики заболеваний в последние годы также ставится под сомнение.
Необходимо отметить, что понятия "антиоксидант" и "антиоксидантная защита" имеют очень размытый характер; перефразируя Германа Мелвилла, подробная систематизация антиоксидантных соединений равносильна попытке классифицировать составляющие мирового хаоса. Так, антиоксидантами можно назвать все вещества, снижающие активность ферментативных реакций наработки АКМ (например, аллопуринол), а также многие противовоспалительные препараты, ингибирующие развитие метаболического "взрыва" в фагоцитирующих клетках. Иногда вводится понятие "вторичная антиоксидантная система", которым обозначают специализированные ферментативные механизмы устранения окислительных повреждений в клетках, такие протеиназы, фосфолипазы, экзо- и эндонуклеазы и др. Своевременное удаление повреждённых молекул повышает устойчивость клеток к токсическому действию АКМ, и поэтому с позиций биологической системы и биологической значимости радикальных окислительных процессов такие ферментативные системы могут рассматриваться как антиоксиданты.
2. Селен в антиоксидантной системе
Общие сведения
Элементарный селен - это гомоцепной неорганический полимер с винтообразными макромолекулами, уложенными параллельно. В цепях атомы связаны ковалентно, а молекулы-цепи объединены молекулярными силами и частично - металлической связью. Селен и его соединения используются в различных областях деятельности, в том числе в медицине и в производстве БАД. В частности, селен признан одним из важнейших антиоксидантов; этот элемент способствует детоксикации производных кислорода в организме (свободных радикалов) и играет немаловажную роль в борьбе с раком.
Селен не может синтезироваться, а должен поступать с пищей извне. Следовательно, нет селена - нет глутатионпероксидазы. Нет глутатионпероксидазы - нет химической защиты от АКМ и организм быстро стареет, возникают мутации, повреждения белков и клеточных стенок.
Селен представляет собой компонент глутатионпероксидазы и является выраженным синергистом витаминов антиоксидантной группы. Этот микроэлемент - важная составная часть сбалансированного питания (в почвах Украины имеется его дефицит). Необходимые суточные добавки к пище селена составляют около 70 мкг для мужчин и 50 - для женщин (0,87 мкг/кг). В крови часть селена связывается с белками, концентрация его в тканях органов значительно различается. Об уровне селена в организме можно судить по активности глутатионпероксидазы, особенно это касается лиц с низким потреблением селена. Из организма селен удаляется в основном путем экскреции с мочой. Токсичность селена весьма низкая: клинические проявления наблюдаются при длительном приеме 1 мг/сут и более. Молекулярные механизмы развития токсичности неизвестны. От содержания селена в организме зависит функционирование цитохрома Р-450 в эндоплазматической сети клеток печени, а также транспорт электронов в митохондриях. Дефицит его в организме сопровождается развитием алиментарной мышечной дистрофии, эндемической селенодефицитной кардиомиопатии. Сниженное содержание этого микроэлемента обнаруживают у больных инфарктом миокарда, миокардиодистрофиями, дилатационной кардиомиопатией. Применение селена положительно влияет на процессы регенерации в сердечной мышце после перенесенного инфаркта миокарда. Он стимулирует иммуногенез и, в частности, продукцию антител, участвует как антиоксидант в окислительно-восстановительных процессах, дыхании клетки, синтезе специфических белков. Дефицит его у животных сопровождается фиброзом, дистрофическими процессами в поджелудочной железе, некрозами в печени, эозинофильным энтеритом, который протекает на фоне недостаточности витамина Е. У животных наблюдается задержка роста, развития, нарушается репродуктивная функция. Имеется отрицательная обратная корреляция между потреблением селена, его уровнем и смертностью от злокачественных заболеваний легких, молочной железы, кишечника, яичников. Он оказывает и непосредственное повреждающее действие на злокачественные клетки. Кроме антиканцерогенного действия селен имеет и антимутагенный эффект, противодействует токсическому влиянию тяжелых металлов (возможно за счет образования нерастворимых комплексов, восстановления дисульфидных связей в белках в SH-группы). Важнейшей ролью селена является его вхождение в состав глутатионпероксидазы - фермента предохраняющего клетки от токсического действия перекисных радикалов. Имеется связь между селеном и витамином Е - они влияют на разные этапы образования органических перекисей: токоферолы подавляют (предупреждают) перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, а содержащая селен глутатионпероксидаза разрушает уже образовавшиеся перекиси липидов, перекись водорода. Глутатионпероксидаза, не содержащая селен, - глутатион-S-трансфераза - разрушает только перекись водорода (как и каталаза). При достаточном поступлении в организм витамина Е проявления дефицита селена значительно нивелируются. Наибольшее количество селена содержится в белках с высоким содержанием цистина: образуются трисульфиды, которые подобно сульфгидрильным группам мембранных белков, регулируют стабильность и проницаемость мембран. При дефиците селена и снижении активности глутатионпероксидазы повышается гемолиз эритроцитов вследствие действия перекиси водорода и липоперекисей. На активность глутатионпероксидазы влияет уровень содержания витаминов С и А, которые способствуют усвоению селена, его транспорту и утилизации. Селен также принимает участие в фотохимических реакциях, связанных с функцией зрения. Витамин Е предупреждает окисление селена, способствует его сохранению. Добавка селена при Е-дефицитном рационе тормозит накопление липоперекисей, ликвидирует или предупреждает симптомы Е-витаминной недостаточности. Восстановленныйглутатион и глутатионпероксидаза превращают липоперекиси в менее токсичные оксикислоты и этим предупреждают повреждение биоструктур. Пополнение фонда глутатиона происходит за счет аминокислот, которые содержат серу.
Глутатионпероксидаза
Для инактивации перекиси водорода в клетках высших животных существует одно важное семейство ферментов - глутатионпероксидаз (систематическое название "глутатион: перекись-водорода-оксидоредуктаза"), существование которого показано Гордоном Милзом в 1957 г. В 1973 г. Джон.Т. Ротрак с соавт. установили, что в состав ГПО входит селен, и каждая молекула фермента содержала 4 атома Se. Помимо это клеточной изоформы, получившей при дальнейшей классификации порядковый номер 1 (ГПО1), глутатионпероксидаза представлена селеновыми изоферментами - "желудочно-кишечным" (ГПО2, выделен из цитозоля клеток печени и кишечника), внеклеточным (ГПО3, выявляется в плазме и молоке), ГПО гидроперекисей фосфолипидов (ГПО4) и не содержащими Seизозимами-"секреторным" (ГПО5, обнаруживаемая в придатках яичек) и ГПО7, а также экзотический ГПО6, в состав которой селен либо входит (человек, свинья), либо не входит (мышь, крыса).
Рассмотрим селеносодержащие ГПО.
"Классическая" (или "цитозольная", "клеточная") ГПО1 представляет собой тетрамер, состоящий из четырёх идентичных сферических субъединиц; гидрофильность затрудняет её проникновение в липидный слой мембран; поэтому основная часть фермента (~70%) локализована в цитозоле, и около 20-30 % - в митохондриях всех клеток млекопитающих. Каждая субъединица содержит по 1 атому селена, входящему в состав селеноцистеиновых остатков; на тетрамере имеется 2 активных GSH-связывающих центра. Селеноцистеин обладает необычным свойством: кодирующий его кодон UGAимеет и вторую функцию - терминации синтеза белка, что зачастую приводит к ошибочным истолкованиям данного кодона; так, при расшифровке генома человека не был правильно предсказан ни один из 25 селенопротеинов. Уэукариот кодон UGAраспознаётся как сигнал для внедрения в белок селеноцистеина в том случае, если в 3-нетранслируемом участке соответствующей ДНК содержится особая структура, называемая "Sec-внедряющая последовательность" (SECIS, Secinsertionsequence).
При недостатке селена в рационе питания уменьшается уровень ГПО, что снижает устойчивость организмов к окислительному стрессу и может приводить к развитию свободнорадикальной патологии, аналогичной авитаминозу Е и характеризующейся разрушением эритроцитов, некрозом и ожирением печени (беломышечная болезнь животных). У человека снижение активности ГПО1 в результате дефицита селена выявлено при сердечно-сосудистых заболеваниях, в том числе болезнях Кешана и Кашин-Бека; при раке; у детей с фенилкетонурией, из рациона питания которых исключён феналаланин, а также у больных фиброзом мочевого пузыря, длительное время находящихся на парентеральном питании. Данные эпидемиологических исследований демонстрируют наличие обратной корреляции между содержанием Seв питьевой воде и смертностью от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Токсичность селена для человека проявляется при суточных дозах потребления >1 мг, при этом его концентрация в крови достигает 40 мкМ.
"Желудочно-кишечная" ГПО2 - тетрамерный цитоплазматический фермент, индетичный классической ГПО1 приблизительно на 65 % по аминокислотной последовательности и на 60 % - по нуклеотидной последовательности и имеющий такую же субстратную специфичность, то есть способен восстанавливать перекись водорода и гидроперекиси жирных кислот, но не гидроперекиси фосфолипидов. У крыс данная изоформа локализована главным образом в желудочно-кишечном тракте, в то время как у людей - в печени и толстом кишечнике.
Внеклеточная ("плазматическая") селен-содержащая ГПО3 представляет собой тетрамерный гликопротеин. ДНК изозима выявлена и секвенирована для многих видов животных, в том числе человека, крыс, мышей и быков; эти исследования показали, что по нуклеотидной последовательности внеклеточная ГПО3 на 40-50% идентична классической ГПО1. Изофермент содержится главным образом в почках, а именно - в проксимальных канальцах, однако синтезируется и другими клетками (мРНК ГПО3 экспрессируется в сердце, плаценте, лёгких, желудочно-кишечном тракте); наличие энзима в грудном молоке позволяет предположить, что он также синтезируется клетками молочных желез. До недавнего времени ГПО3 плазмы считались аномальным ферментом, так как её Kmдля GSHсоставляет несколько ммоль, в то время как физиологическая концентрация глутатиона в плазме человека не превышает 10мМ. Однако недавно было показано, что эффективными донорами электронов для внеклеточной ГПО является тиоредоксинредуктаза и тиоредоксин, в присутствии нано - и миллимолярных концентраций которых и НАДФН фермент эффективно восстанавливал гидроперекись трет-бутила; аналогичным действием обладал глутаредоксин в миллимолярных концентрациях, в то время как глутатион был неэффективен в концентрациях вплоть до физиологически достижимых. Внеклеточная ГПО3 играет важную роль в создании антиоксидантного барьера лёгких; более половины активности ГПО бронхоальвеолярной жидкости приходится на внеклеточный изофермент, секретируемый главным образом эпителиоцитами бронхов, альвеолярными макрофагами и интерстициальными клетками.
В 2003-м г. Георгием В. Крюковым с соавт. на основе компьютерного анализа генома идентифицирована ГПО6, имеющая на тесную гомологию с ГПО3; вычисленный белок имеет глобулярную структуру, содержит остаток селеноцистеина в положении 73 и обнаруживается только в эмбрионах и эпителии органов обоняния взрослых мышей. ГПО6 крыс ранее была клонирована как белок, метаболизирующийодоранты; ортологи фермента у крыс и мышей вместо остатка селеноцистеина содержат цистеин, в то время как изозим свиней представляет собой селенопротеин. Проведённым Г.В. Крюковым с соавт. анализ показал, что содержащийся в 3-нетранслируемом участке гена, кодирующего ГПО6 мышей, элемент SECISявляется нефункциональным вследствие мутацийавторы заключили, что селеноцистеин, первоначально присутствующий в белках семейства глутатионпероксидаз у млекопитающих, у грызунов в ходе эволюции был заменён на цистеин. Все ГПО в большей или меньшей степени катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения - оксикислоты:
GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O
В результате взаимодействия с гидропероксидом ROOH селеноцистеиновый остаток фермента переходит из селенола в селененовую кислоту, с которой затем связывается GSHс образованием селененилсульфида:
ГПО-SeH + ROOH→ROH + ГПО-SeOH
ГПО-SeOH + GSH → H2O + ГПО-Se-SG
Прореагировав со второй молекулой глутатиона, ГПО возвращается в исходное состояние:
ГПО-Se-SG + GSH → ГПО-SeH + GSSG
Подобно каталазе, ГПО способны также утилизировать H2O2:
GSH + H2O2→GSSG + 2H2O
Кроме того, недавно обнаружено, что селеносодержащие ГПО проявляют пероксинитритредуктазную активность, восстанавливая ONOO¯до нитрит-анионаNO2¯и тем самым предотвращая опасные реакции окисления и нитрования, в которые активно вступает пероксинитрит. Стехиометрия пероксинитритредуктазной реакции аналогична классической глутатионпероксидазной реакции с участием гидропероксидов: взаимодействуя с ONOO¯, фермент окисляется до селеновой кислоты и затем восстанавливается до исходного состояния двумя молекулами глутатиона; скорость реакции составляет 8 × 106M-1c-1.
Также селеновые ГПО играют важную роль в регуляции биосинтеза эйкозаноидов, контролируя содержание органических перекисей и поддерживая так называемый "перекисный тонус". Так, циклооксигеназа, переводящаяарахидоновую кислоту в циклоэндогидроперекисьPGH2, активируется гидроперекисью, высокое содержание которой приводит к самоинактивации фермента. Обычная физиологическая концентрация гидроперекисей в клетках млекопитающих составляет около 10-10 М, и её повышение до 10-6 М вызывает активацию циклооксигеназы. Предпологается, что липоксигеназа, отвечающая за синтез лейкотриенов, простациклиновые и тромбоксановыесинтетазы, также являются объектами перекисной регуляции. С этой точки зрения становится ясно, насколько важна функция ГПО в патогенезе воспалительных процессов.
Представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах in vitro, включающих более сложный объект - природные биологические мембраны.
Материалы и методы
. Исследование интенсивности индуцированного ПОЛ
. Определение концентрации белка по методу Бредфорда
В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс - выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ - моно - и полиненасыщенными жирными кислотами; в ее составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т.е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта. Полученные результаты приведены в таблице 2. Постановка эксперимента была общепринятой [25] и заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (соль Мора). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т.д.). После инкубации в течение 20 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида. По уровню его накопления судили об антиоксидантной активности добавляемых в реакционную среду исследуемых веществ. Для сравнения использовали ионол. Контролем служили образцы без активных веществ, но с добавлением растворителя (ДМСО), который сам обладает некоторым антиоксидантным эффектом.
Как видно из приведенных данных, преимущественное большинство соединений, показавших в предыдущем опыте антиоксидантный эффект обнаруживало подобную активность и в более сложной системе. Однако были и исключения. В общем, подобное поведение антиоксидантов не является неожиданным. Известно, что усложнение системы, в которой проводятся испытания антиоксидантных свойств приводит иногда к снижению эффективности препарата [24]. (Именно этим фактом мы руководствовались, применяя в опыте концентрации веществ несколько более высокие, чем полученные для них величины IC50.) Более того, в исключительных случаях может изменяться сама направленность эффекта - с антиоксидантной до прооксидантной. Это связано с синергическим эффектом при взаимодействии нескольких слабых факторов в живом объекте, приводящим к их резкому усилению. Например, в клетке в определенных условиях может значительно возрастать энергия слабых радикальных соединений, их превращение в активаторов ПОЛ, тогда как в норме сами по себе они являются ингибиторами ПОЛ именно из-за своих радикальных свойств и не представляют опасности из-за низкой энергетичности. Это показано, в частности, в опытах с применением витамина Е [1]. Разумеется, в каждом подобном случае причины изменения эффектов одного и того же соединения в разных условиях опыта могут быть совершенно различны, но все они, безусловно, связаны с взаимодействием того или иного соединения с какими-то структурами в изучаемой системе.
Как и в первой серии опытов, соединения KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26 проявили антиоксидантную активность, причем, в данном случае - в присутствии микросом. Это говорит о том, что, как минимум, эти вещества могут быть ловушками свободнорадикальных форм кислорода. Следовательно, их можно отнести к истинным антиоксидантам. Остальные вещества не обнаружили антиоксидантного эффекта на микросомах, что, вероятно, можно объяснить следующим образом.
В нашем случае вещество Л-8 (№12) проявило при инкубировании с микросомами отчетливый прооксидантный эффект, т.е. активировало ПОЛ (более чем на 40 %), тогда как в опытах с лецитином это вещество ингибировало липопереокисление, по-видимому, за счет улавливания и инактивации свободнорадикальных форм кислорода. Принимая во внимание структуру данного соединения, можно сделать вывод, что Л-8 действительно может связывать свободнорадикальные формы кислорода. В растворе лецитина это вызывает их инактивацию, поэтому процесс ПОЛ ингибируется, причем с примерно одинаковой эффективностью при разных концентрациях вещества, т.е. лимитирующим фактором, вероятно, является концентрация радикалов в среде. Однако при наличии мембранного липидного бислоя гидрофобная и довольно громоздкая молекула Л-8 проникает вглубь мембраны, задерживаясь там вместе со связанными кислородными радикалами. При встраивании молекулы Л-8 структура мембраны становится более рыхлая, радикалы кислорода получают свободный доступ к ненасыщенным жирным кислотам мембранных фосфолипидов, т.е. к субстратам ПОЛ. Проще говоря, мы считаем, что Л-8 может не только связывать, но и транспортировать радикальные формы кислорода в липидный бислой, встраиваясь в него и механически дестабилизируя его. Однако, для доказательства этого предположения целесообразно было бы сравнить влияние Л-8 на ПОЛ в лецитиновых липосомах. В подобной постановке лецитин находился бы не просто в растворе, а в составе липидного бислоя, состоящего исключительно из молекул лецитина.
Аналогичные выводы можно сделать, анализируя поведения соединения DVD-0749. Следует отметить лишь, что его молекула по величине почти в 2 раза меньше Л-8, но также не является компактной молекулой. Вместе с тем, очень похожее визуально на DVD-0749 соединение DVD-4702 проявляет умеренно антиоксидантные свойства в обоих случаях - и в простой безмембранной системе с субстратом ПОЛ лецитином, и при наличии этого же компонента (наряду с другими) в составе мембран микросом. Очевидно, что структурные отличия являются причиной разного поведения этих соединений, однако на данном этапе исследований не представляется возможным объяснить, каким образом.
Влияние новых синтетических гетероциклических соединений на индукцию аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс, X±Sx; n=6
Названия препаратовКонцентрация препаратов (мкМ) Концентрация МДА (нмоль на 1 мг белка за 1 мин) Ингибирование относительно контроля (%) DVD-2521 22,51,05±0,00952101,74±0,01120KDA-150 102,51,82±0,01017101,67±0,00826KDA-132 112,51,23±0,01144101,31±0,01540BO-20 142,51,92±0,02012101,46±0,01133DVD-8843 1101,38±0,00937-DVD-2808 3101,23±0,01144-DVD-26 6101,54±0,01529-NAA-23 16102,13±0,0172-NAA-84 18102,00±0,0178-NAA-85 19101,54±0,01029-DVD-4702 8102,15±0,0211252,26±0,0150DVD-0749 9103,46±0,0240253,08±0,0200Л-8 12103,08±0,0290252,46±0,0210BO-35 15102,31±0,0200252,61±0,0120DVD-3779 4252,22±0,0110-DVD-69 5252,00±0,0158-Л-15 13251,90±0,01113-NAA-177 17252,23±0,0190-Контроль (с раство-рителем) -2,18±0,0150Ионол0,18±0,01292
Соединения DVD-3779 и ВО-35 также, как и три вышеописанных, вероятно, являясь ловушками свободнорадикальных форм кислорода, вероятно, могут переносить их в липидный мембранный бислой с разной степенью эффективности и в зависимости от типа этого бислоя.
Отдельно следует сказать о соединениях, которые были растворимы в воде - NAA-23 и NAA-177. Они показали слабую антиоксидантную активность. Причем в случае с NAA-177 она не зависела от концентрации вещества в растворе с лецитином. В системе с микросомами препараты не функционировали как антиоксиданты. Вероятно, это связано с непроницаемостью для них липидного мембранного бислоя за счет их заряженности. Возможно, эти соединения могут проявить себя в другом биологическом качестве, например, они вполне могут действовать как нуклеофилы, участвуя в разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях. Мы планируем проверить это предположение в следующих опытах.
Таким образом, из 18 исследуемых соединений 8 продемонстрировали выраженные антиоксидантные свойства, их IC50 оказался в области 2 мкМ. При концентрации 10 мкМ эти соединения показывали антиоксидантный эффект не только в модельной системе с субстратом ПОЛ лецитином, но и в среде с микросомами - биологическими липидными бислойными мембранами. Кроме того, возможно проявление и иных биологически свойств этих соединений - способности связываться с липидами мембранного бислоя, выступая в качестве мембранных зондов; влиять на процессы переноса электронов в дыхательных цепях микросом и митохондрий; влиять на активность антиоксидантных ферментов. Однако, все эти предположения требуют отдельных исследований.
селен антиоксидант ингибитор метаболит
Список используемой литературы
1.Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма "Слово", 2006. - 556 с.
2.Green M.J., Hill H.A.O. Chemistry of dioxygen // Mehtods of Enzymology. - Vol.105. - N. Y.: Acad. Press, 1984. P.3-22.
.Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art // Am. J. Med. - 1991. - Vol.91, Suppl.3C. - P.2S-13S.
.Sinha B.K., Mimnough E.G. Free radicals and anticancer drug resistance oxygen free radicals in the mechanisms of drug cytotoxicity and resistance by certain tumours // Free Radic. Biol. Med. - 1990. - Vol.8. - P.567-581.
5.Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М.: Медицина, 1989. - 356 с.
6.Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. - 1991. - Vol.43. - P.109-142.
.Harris M.L., Schiller H.J., Reilly P.M. P. et al. Free radicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease: Cause, consequence or epiphenomenon // Pharmacol. Ther. - 1992. - Vol.53. - P.375-408.
8.Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. - 1998. - Т.63, вып.7. - С.1007-1019.
.Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989.344 с.
10.Cornwell D.G., Morisaki N. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: Prostaglandins, lipid peroxides, and cooxidation reactions // Free Radicals in Biology. - Vol.6. - 1984. - P.96-149.
11.Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. - Киев: Наукова думка, 1989. - 218 с.
12.Weitzman S.A., Gordon L.I. Inflammation and cancer; Role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis // Blood. - 1990. Vol.76. - P.655-663.
.Harman D. Free radical theory of aging // Mutat. Res. - 1992. - Vol.275. P.257-266.
.Landar A., Darley-Usmar V.M. Nitric oxide and cell signaling; modulation of redox tone and protein modification // Amino Acids. - 2003. - Vol.25. - P.313-321.
.Poli G., Leonarduzzi G., Chiarpotto E. Oxidative stress and cell signaling // Current Med. Chem. - 2004. - Vol.11. - P.1163-1182.
16.Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Сорос. образоват. журн. - 2001. - №6. - С.910-912.
17.Simon H.-U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation // Immunol. Rev. - 2003. Vol. 193. - P.101-110.
18.Brookes P.S. Yoom Y., Robotham J.L. et al. Calcium, ATP, and ROS; a mitochondrial love-hate triangle // Am. J. Physiol. Cell. - 2004. - Vol.287. - P.817-833.
.Boonstra J.,Post J.A. Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells // Gene. 2004. Vol.337. P.1-13.
.Gregg D., de Carvalho D.D. Kovacic H. Integrins and coagulation: a role for the ROS/redox signaling? // Antioxid. Redox. Signal. - 2004. - Vol.6. - P.757-764.
.Esposito F., Ammendola R., Faraonio R. et al. Redox control of signal transduction, gene expression and cellular senescence // Neurochem. Res. 2004. - Vol.29. - P.617-628.
22.Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикаля в живых системах // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т.29. - С.1-249.
.Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиоксидантной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. - 1988. - №5. - С.59-62.
.