Метод изотахофореза

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ГБОУ ВПО КГМУ МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ)

Кафедра общей и биоорганической химии <#"660871.files/image001.gif">

Этапы разделения двух образцов при помощи изотахофореза: Белый цвет - ведущий электролит, серый - замыкающий электролит, заштрихованы - анализируемые образцы

2. Принцип изотахофореза

При «классическом» электрофорезе разделяемые ионы находятся в однородном электрофоретическом буфере и движутся в электрическом поле с разными скоростями. В условиях изотахофореза все ионы перемещаются с одной и той же скоростью, но располагаются друг за другом в соответствии с их подвижностями. Рассмотрим зоны, содержащие отрицательно заряженные ионы А и В с подвижностями тА~>тв" и общим противоионом Р. При наложении электрического поля ионы будут двигаться с одинаковой скоростью в последовательно расположенных зонах.

Уравнение вывел Роутс. Оно представляет собой расширенную форму регулирующей функции Кольрауша. Согласно этому уравнению, концентрация вещества В в зоне 2 определяется концентрацией вещества А в зоне 1.

Помимо баланса электрического тока, подробно описанного выше, существуют еще три других важных принципа, которые необходимо иметь в виду.

Баланс масс. Концентрация противоионов в зоне должна оставаться постоянной после достижения состояния равновесия, т. е. необходимо, чтобы количества противоионов, входящих в зону и покидающих ее, были равны между собой.

Электронейтральность. Число положительно и отрицательно заряженных ионов в данной зоне одинаково.

Химическое равновесие. Содержание диссоциированных и недисооциированных молекул определяется константами кислотно-щелочного равновесия.

При изотахофорезе разделение ионов происходит в соответствии с их подвижностями, а концентрация ионов в каждой зоне зависит от концентрации предшествующего иона. Это означает, что концентрация ионов в любой зоне определяется первым, или ведущим, ионом. Необходимо, чтобы исследуемый ион находился между ведущим и замыкающим ионами. Последний должен обладать самой низкой подвижностью по сравнению со всеми находящимися в системе ионами. В этом случае ионы располагаются в такой последовательности, что ион с более высокой подвижностью будет двигаться впереди иона с меньшей подвижностью. Поскольку в условиях изотахофореза скорости всех ионов, как и сила тока во всех зонах, одинаковы, согласно закону Ома, градиент напряжения в каждой зоне будет. Чем меньше подвижность иона, тем больше перепад напряжения в этой зоне. Поэтому все ионы приобретают одинаковую скорость, несмотря на различия в их подвижностях.

Как уже отмечалось, концентрации ионов в зонах не могут отличаться от той, которая задана концентрацией ведущего иона и подвижностями ведущего и исследуемого ионов. Если же концентрация какого-либо иона, содержащегося в пробе, не подчиняется этому правилу, вытекающему из регулирующей функции Кольрауша, то он непременно подвергнется разведению или сконцентрируется до предписанного уровня. Вследствие этого изотахофореграмма отличается от всех других видов фореграмм и хроматограмм. На ней высота ступенек, образуемых сигналами, является характеристикой каждого вида иона, а расстояние между сигналами дает информацию о числе ионов.

При изотахофорезе наряду с эффектом концентрирования наблюдается также явление автоматического повышения резкости границ между зонами. Рассмотрим состояние равновесия, при котором все ионы движутся с одинаковой скоростью, и предположим, что ион О диффундировал в зону где градиент напряжения ниже, чем в зоне А. При более низком градиенте напряжения скорость иона снизится и он не сможет двигаться наравне с другими ионами в зоне N. Поэтому он отстанет и снова попадет в свою зону. Если же ион О диффундирует, наоборот, в зону R с более высоким градиентом напряжения, то приобретет там более высокую скорость, благодаря которой этот ион опять-таки вернется в свою зону.

Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10%. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона. Ее можно изменять, варьируя растворители или рН, определяющий соотношение между диссоциированными и недиосоциированными молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле. Подвижность белков сильно зависит от рН, поэтому рН играет решающую роль при изотахофорезе белков. Все зоны имеют разные величины рН. В анионной системе величина рН обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях рН (ниже рН=3 и выше рН=10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и ОН сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких рН также оказывает неблагоприятное действие. Если в анионной системе величина рН более чем на одну единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины рК соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения, который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования рН ограничена также буферной емкостью противоиона.

. Приборы, применяемые при изотахофорезе

Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A2%D0%B5%D1%84%D0%BB%D0%BE%D0%BD> капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм.

Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D1%84%D0%BE%D1%80%D0%B5%D0%B7_%D0%B2_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%B0%D0%BA%D1%80%D0%B8%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B8%D0%B4%D0%BD%D0%BE%D0%BC_%D0%B3%D0%B5%D0%BB%D0%B5>.

Для получения воспроизводимых результатов очень важно выполнять следующие условия. Изотахофорез следует проводить в трубке с совершенно одинаковым по всей ее длине внутренним диаметром, при постоянном составе ведущего электролита; необходимо соответствующим образом предотвратить появление электроэндосмоса и гидродинамического тока жидкости, а также обеспечить равномерное охлаждение трубки; буферная емкость ведущего электролита должна быть достаточно большой, чтобы препятствовать смещению зон рН в обратном направлении по сравнению с движением зон исследуемых веществ.

Аналитический изотахофорез осуществляют в стеклянных или пластмассовых трубках с внутренним диаметром 0,4- 0,6 мм и длиной 50-100 см. Длина трубки определяется той парой ионов, которые труднее всего разделить, и зависит от величины пространства, занимаемого этой парой ионов, и отношения их подвижностей. Иногда эта длина оказывается слишком большой, поэтому был предложен способ противотока, заключающийся в основном в создании тока ведущего электролита, направленного навстречу нормальной миграции ионов, благодаря чему эффективная длина трубки возрастает. Для регулирования температуры в трубке используют алюминиевый или любой другой термостат. Если систему закрыть с одной стороны полупроницаемой мембраной, то эндосмотический ток снизится до такой степени, что при разделении небольших ионов отпадает необходимость в применении полимера.

Описана конструкция аппарата для изотахофореза, представляющего собой единый термостатируемый блок, включающий отсеки для электродов, входное отверстие для пробы, неэластичные прямоугольные капилляры с поперечным сечением 0,2X1 мм и длиной 25 см и детекторную ячейку.

Изотахофорез можно также проводить на полосках из ацетата целлюлозы и сочетать с «классическим» электрофорезом в опытах по двухмерному разделению.

Детекторы. Поскольку во всех зонах создаются различные градиенты напряжения, в них выделяется и разное количество джоулева тепла. Этот факт удается использовать для выявления зон с помощью термометра. Применяют также детекторы проводимости и градиенты потенциала, позволяющие регистрировать как интегральные, так и дифференциальные кривые. Для веществ, поглощающих в ультрафиолетовом свете, созданы высокочувствительные УФ-детекторы.

Следует отметить, что минимальное количество изучаемого соединения, поддающееся выявлению, зависит от концентрации ведущего иона. Уменьшение этой концентрации, например, на порядок позволяет в такой же степени снизить наименьшее регистрируемое количество данного вещества, поскольку возможность его выявления в конечном счете определяется длиной соответствующей зоны. Однако слишком сильное снижение концентрации нецелесообразно, так как в этом случае зоны могут двигаться с разумной скоростью только ,при таком градиенте напряжения, который невозможно создать с помощью существующих в настоящее время источников питания. Следует избегать и чрезмерно высоких концентраций, приводящих к затруднениям, связанным с отводом выделяющегося тепла.

Таблица 1. Детекторы, используемые при аналитическом изотахофорезе