Клинико-лабораторная диагностика вируса Эпштейна-Барр

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра инфекционных болезней

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

КЛИНИКО - ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА âèðóñà Ýïøòåéí - Áàðð

Исполнитель: Сопина С. В.

Научные руководители: Красавцев Е. Л., Кугаев О.Л.

Рецензент: Мицура В.М.

ГОМЕЛЬ, 2009

РЕФЕРАТ

Ключевые слова: вирус Эпштейн - Барр, ВЭБ - инфекция, инфекционный мононуклеоз, атипичные мононуклеары, ДНК диагностика, ДНК ВЭБ, ПЦР, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, специфический иммуноглобулин.

Цель работы: освоение методики выявления ДНК ВЭБ у больных с различной инфекционной патологией, определение чувствительности и специфичности выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

Практическая значимость: Определены чувствительность и специфичность выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом, даны рекомендации по срокам обследования больных на ДНК ВЭБ.

Область применения: инфекционные болезни.

Экономическая эффективность: приведены показания для обследования на ДНК ВЭБ, рекомендованы рациональные сроки обследования на ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

.1 Строение вируса Эпштейн - Барр

.3 Лабораторная диагностика ВЭБ - инфекции

.3.1 Стандарт диагностики ВЭБ - инфекции

.3.2 Алгоритм диагностики ВЭБ - инфекции

.3.3 Клинический анализ крови

.3.4 Серологическая диагностика

.3.5 Принцип ПЦР - диагностики

.3.6 Иммунологическое обследование

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

.1 Методика проведения ПЦР - анализа на выявление ДНК ВЭБ в лаборатории Гомельской областной инфекционной клинической больницы

.2 Учёт результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

.1 Выявление ДНК ВЭБ у лиц с различной инфекционной патологией

.2 Возрастная структура больных ИМ

.3 Сроки забора материала на ДНК ВЭБ

.4 Клинические проявления при ИМ

.5 Картина крови у больных ИМ

.6 Чувствительность и специфичность метода ПЦР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

EA - Early Antigen- Epstein-Barr Nuclear Antigen- иммуноглобулин- Membrane Antigen- Viral Capsid Antigen

Аг - антиген

Ат - антитело

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВЭБ - Вирус Эпштейн - Барр

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИДС - иммунодефицитное состояние

ИМ - инфекционный мононуклеоз

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы: Среди врачей бытует устойчивое представление о вирусе Эпштейн-Барр как возбудителе инфекционного мононуклеоза - заболевания, характеризующегося самопроизвольным выздоровлением и, в соответствии с классической литературой, не требующего этиотропного или патогенетического лечения, что порождает подчас легкомысленное отношение к инфекции в целом. Однако этиологическая роль ВЭБ при инфекционном мононуклеозе была описана уже после того, как в 1964 г. вирус впервые был обнаружен в лимфоме Беркита. А накопленные за истекший период знания свидетельствуют просто о колоссальной роли ВЭБ в инфекционной, онкологической и иммунологической патологии человека.

Первая встреча с вирусом зависит от социальных условий, в которых проживает человек. Большинство детей в развивающихся странах или в социально - неблагополучных семьях инфицируется ВЭБ в возрасте до 3-х лет. В развитых странах инфицирование ВЭБ может происходить позже.

Контагиозность при ВЭБ - инфекции умеренная, что, вероятно, связано с низкой концентрацией вируса в слюне. На активацию инфекции влияют факторы, снижающие общий и местный иммунитет [1,2]. Вирус Эпштейн - Барр вызывает активную форму заболевания, а также может длительное время персистировать в клетках человека в латентном виде. Особенностью гуморального иммунного ответа на инфекцию, вызванную ВЭБ, является дифференцированная во времени выработка иммуноглобулинов классов G и M на различные белки вируса. Это позволяет с высокой точностью диагностировать различные стадии ВЭБ - инфекции у пациента. Дополнительным подтверждением течения острых стадий инфекционного процесса может служить тест по выявлению ДНК ВЭБ в крови и/или слюне методом ПЦР.

Этот тест весьма эффективен для выявления ВЭБ - инфекции у новорожденных, когда выявление серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях[1,4].

Цель: освоение методики выявления ДНК ВЭБ у больных с различной инфекционной патологией, определение чувствительности и специфичности выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

Задачи:

1.            Определить частоту выявления ДНК ВЭБ у лиц с различными клиническими диагнозами;

.  Определить чувствительность и специфичность выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом;

ГЛАВА 1. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

1.1          Строение вируса Эпштейн - Барр

Вирус Эпштейн - Барр представляет собой В-лимфотропный вирус человека, который относится к семейству Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesviridae, рода Lymphocryptovirus и является вирусом герпеса человека 4 типа. Для него характерна сферическая форма и наличие 4 структурных компонентов: сердцевина, капсид, внутренние оболочки, внешние оболочки. Сердцевина содержит линейную двунитчатую вирусную ДНК длиной 172 тысячи пар оснований, состоит из 80 генов. Диаметр вируса равен 180 нм. В составе вирионов обнаружено более 30 гликопротеидов, которые находятся на поверхности и вызывают образование вируснейтрализующих антител [2,4].

Вирус чувствителен к воздействию эфира, весьма специфичен в отношении роста: размножается в культурах лимфобластов опухоли Беркитта, крови больных ИМ, лейкемических клетках и в культуре клеток мозга здорового человека. Устойчивость ВЭБ во внешней среде низкая. Он быстро погибает при высыхании, высокой температуре, обработке всеми дезинфицирующими средствами [3].

ВЭБ отличается от других вирусов семейства герпеса способностью реплецироваться только в В - лимфоцитах приматов, не вызывая при этом лизиса поражённых клеток. Другой важной особенностью ВЭБ является его способность персестировать в культуре клеток, оставаясь в репрессированном состоянии, и интеграция в определённых условиях с ДНК клетки хозяина [4].

Содержит специфические антигены, которые выявляются с помощью РСК, ИФА, иммунодиффузии:

v   капсидный антиген (VCA)

v   ранний антиген (EA)

v   ядерный антиген (EBNA)

v   мембранный антиген (MA)

Проникновение ВЭБ в клетку хозяина является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя прикрепление вирионов к клеточным рецепторам, эндоцитоз и слияние мембран вирионов и клетки. В результате этого капсид освобождается от белков внешней оболочки, а комплекс ДНК-белок вируса проникает в ядро [5]. Вирионная ДНК выходит в нуклеоплазму и транскрибируется клеточной РНК - полимеразой, затем проходит процессинг мРНК, синтез кодируемых продуктов и частичный обратный транспорт их в ядро, репликация ДНК и формирование дочерних молекул [6]. Образовавшиеся в ядрах клеток незрелые капсиды попадают в цитоплазму, где заканчивается формирование зрелых капсидов и внешней оболочки вируса с последующим транспортом к поверхности и выходом их из клетки [7]. При проникновении в организм человека первоначально ВЭБ поражает эпителиальные клетки носо - и ротоглотки, а затем инфицирует В-лимфоциты, участвующие в диссеминации возбудителя по организму [8].Схематично жизненный цикл вируса Эпштейн - Барр представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Жизненный цикл вируса Эпштейн - Барр

Эпителиальные клетки могут быть инфицированы вирусом через ВЭБ -специфичный С2 - рецептор. При этом процессы деления, дифференцировки и созревания клеток эпителиального слоя протекают параллельно с процессом активного вирусного воспроизводства [9,10]. Таким образом, "эпителиальная ВЭБ - инфекция" - играет решающую роль в воспроизводстве и пожизненной персистенции вируса в организме человека [11].

1.2          Течение ВЭБ - инфекции

Установлено, что ВЭБ имеет глобальное распространение и обнаруживается у населения всего земного шара. Он является «вездесущим» (убиквитарным) человеческим патогеном, поражающим эпителиальные клетки слизистых оболочек (дыхательных путей, пищеварительного тракта, половых органов), а также клетки иммунной системы, в том числе В-лимфоциты, в которых происходит репликация вирусных частиц [12].

Существует 2 типа EBV - тип 1 и тип 2, также называемые типами А и В. Генетические отличия между типами вируса составляют 25-30%. Оба они циркулируют во всем мире, однако тип 1 имеет большее географическое распространение, тогда как тип 2 чаще встречается в Африке и реже - в странах Северной Америки. Как правило, наличие в организме одного типа ВЭБ предотвращает инфицирование другим, однако описаны случаи инфицирования пациентов обоими типами вируса. Тип 1 ВЭБ способен более активно вызывать трансформацию В-лимфоцитов in vitro, нежели тип 2, однако отличия между типами вирусов в отношении вызываемых симптомов отсутствуют.

В настоящее время доказано, что ВЭБ является этиологическим агентом таких заболеваний, как инфекционный мононуклеоз, назофарингеальная карцинома (НФК), лимфома Беркитта, Т - клеточная лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, хроническая активная ВЭБ - инфекция, лейомиосаркома, лимфоидная интерстициальная пневмония, "волосатая" лейкоплакия, врожденная ВЭБ - инфекция [13]. В организме ослабленных людей ВЭБ часто может вызывать лимфопролиферативные изменения. Так, у ВИЧ - инфицированных и больных, перенесших курс иммунодепрессивной терапии, проводимый при пересадке органов, нередко наблюдается развитие тяжёлых диссеминированных форм новообразований в лимфоузлах, а также поражение слизистой оболочки рта волосатой лейкоплакией.

У людей без выраженных дефектов иммунной системы инфекция ВЭБ протекает субклинически и сопровождается положительными серологическими реакциями. Однако при массированном поступлении вируса в организм или недостаточности иммунитета может наблюдаться вирусемия. Вирус проникает в лимфоузлы и органы, богатые ретикуло-эндотелиальными клетками, развивается лимфоаденопатия, заметно увеличиваются печень и селезёнка. Симптомы интоксикации и лихорадка обусловлены воздействием токсинов, а катар верхних дыхательных путей, полости рта и глотки - непосредственным воздействием вируса [14,15,16].

Антитела к ВЭБ обнаруживают у 60% детей первых 2 лет жизни и у 80-90% взрослых. Широкому эпидемическому распространению ВЭБ способствуют большое количество больных и лиц, выделяющих вирус, также многообразие путей передачи вируса.

Резервуар и источник инфекции:

o человек с манифестной или стёртой формой болезни;

Инфицированные лица выделяют вирус с последних дней инкубации и на протяжении 6-18 месяцев после первичной инфекции. В смывах из ротоглотки у 15-25% серопозитивных здоровых людей также обнаруживают вирус. Эпидемический процесс поддерживают лица, ранее перенёсшие инфекцию и на протяжении долгого времени выделяющие возбудитель со слюной.

Механизм передачи - аэрозольный.

Пути передачи:

· контактно - бытовой (со слюной во время поцелуев матерью своего ребенка);

· парентеральный;

· вертикальный;

· половой путь;

· распространение вируса через предметы обихода или воздушно-капельным путем маловероятно, но в некоторых руководствах указывается на то, что инфекция всё же может передаваться воздушно-капельным путем.

Естественная восприимчивость людей высокая, однако, преобладают лёгкие и стёртые формы болезни. О наличии врождённого пассивного иммунитета может свидетельствовать крайне низкая заболеваемость детей первого года жизни. Иммунодефицитные состояния способствуют генерализации инфекции [17,18,19].

Основные эпидемиологические признаки.

Заболевание распространено повсеместно; в основном регистрируют спорадические случаи, иногда - небольшие вспышки. Наиболее часто заболевают подростки. Лица старше 40 лет болеют редко, но у ВИЧ - инфицированных реактивация латентной инфекции возможна в любом возрасте. При заражении в раннем детском возрасте первичная инфекция протекает в виде респираторного заболевания, в более старших возрастах - бессимптомно. К 30-35 годам у большинства людей в крови выявляют антитела к вирусу инфекционного мононуклеоза, поэтому клинически выраженные формы редко встречают среди взрослых. Заболевания регистрируют на протяжении всего года, несколько реже - в летние месяцы. Заражению способствуют скученность, пользование общим бельём, посудой, тесные бытовые контакты [20].

Общепринятая классификация заболевания отсутствует.

Клинические формы ВЭБ - инфекции: 1) инфекционный мононуклеоз; 2) хроническая активная ВЭБ - инфекция; 3) X-сцепленная лимфопролиферативная болезнь: •летальный инфекционный мононуклеоз, •приобретенная гипогаммаглобулинемия, •злокачественныелимфомы; 4) назофарингеальная карцинома; 5) лимфома Беркита; 6) болезнь Ходжкина; 7) лимфопролиферативная болезнь: •плазматическая гиперплазия, •В-клеточная гиперплазия, •В-клеточная лимфома,