Иммуно- и гепатотоксические эффекты гербицида и их коррекция тактивином и токоферолом

Иммуно- и гепатотоксические эффекты гербицида и их коррекция тактивином и токоферолом

Иммуно- и гепатотоксические эффекты гербицида и их коррекция тактивином и токоферолом

Циркуляция ксенобиотиков техногенного происхождения и их воздействие на организм возросли до уровня, угрожающего здоровью населения [12]. Среди ксенотоксикантов значительное место занимают хлорорганические пестициды (ХОП) [4]. Эти соединения обладают выраженными кумулятивными свойствами, последствия которых проявляются в изменении иммунологического статуса организма, мутагенном и тератогенном действии [6, 13]. Среди ХОП наиболее широко используются производные 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 - Д). В целом по России ежегодно применяется более 70 000 тонн хлорфеноксисоединений, в РБ около 40% пахотных земель загрязнено гербицидами этой группы [11].

Рис. 1. Печень крысы при воздействии гербицида 2,4 - ДА, 36 сутки наблюдения. Полнокровие центральных вен и синусоидных капилляров. Гиперемия сосудов портальных трактов. Сглаженность балочного рисунка. Нерезкая белковая дистрофия (мутное набухание) гепатоцитов

Среди механизмов повреждающего действия экотоксикантов ведущее место занимает активация свободнорадикального окисления липидов биологических мембран, что неизбежно приводит к развитию синдрома пероксидации; повреждение иммунокомпетентных клеток, ускорение процессов апоптоза, а также токсическое поражение печени [9, 16]. Особую важность представляет изучение повреждающего влияния на иммунную и гепатобилиарную системы - в наибольшей мере ответственные за сохранение гомеостаза и адаптацию организма [6] и, вместе с тем, являются наиболее уязвимыми к влиянию экотоксикантов.

Рис. 2. Печень крысы при воздействии гербицида 2,4 , 36 сутки наблюдения. ЭМФ х 5000 1 - ядро гепатоцита, 2 - глыбки гетерохроматина, 3 - фрагментация ГРЭС, 4 - набухшие митохондрии, 5 - микробы, 6 - бесструктурные зоны

Несмотря на многочисленные исследования, механизмы повреждающего воздействия феноксигербицидов на иммуную и гепатобилиарную системы и особенно разработка методов их коррекции продолжают оставаться не полностью раскрытыми.

Рис. 3. Повышение активности катионных белков ПМФ при использовании комбинации «Тактивин+витамин Е» в условиях подострой интоксикации 2,4 - ДА, 7 сутки наблюдения

В ранее проведенных исследованиях нами уточнены механизмы повреждающего воздействия гербицида аминной соли 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 - ДА) на иммунную и гепатобилиарную системы [8], что дополняет результаты других авторов. Учитывая механизмы токсического воздействия гербицида 2,4 - ДА для коррекции могут быть использованы препараты, обладающие сочетано иммуномодулирующим, гепатопротекторным и антиоксидантным действием. В связи с этим в качестве средств корригирующей терапии нами выбран иммуномодулятор Тактивин [3, 14] и токоферол, оказывающий выраженное антиоксидантное, иммуномодулирующее, мембраностабилизирующее и гепатопротекторное действие [1, 2, 5].

Целью исследований явилось изучение эффективности применения Тактивина и токоферола для коррекции иммуно- и гепатотоксических эффектов гербицида 2,4 - ДА.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

. оценить эффективность индивидуального и сочетанного применения Тактивина и токоферола для коррекции кислородзависимых и кислороднезависимых микробицидных систем полиморфноядерных лейкоцитов и перитонеальных макрофагов при воздействии гербицида 2,4 - ДА;

. изучить эффективность применения Тактивина и витамина Е для коррекции морфофункционального состояния печени при воздействии гербицида 2,4 - ДА.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 150 белых крысах массой 150-180 г. Подострое отравление 2,4 - ДА моделировали ежедневным внутрижелудочным введением гербицида в течение 28 дней в дозе 42 мг/кг, что соответствует суммарной дозе 1200 мг/кг, равной ЛД₅₀. Токоферол (в дозе 50 мг/кг, внутрижелудочно) и Тактивин (в дозе 0,25 мг/кг, внутримышечно) вводили ежедневно с 1 по 6 дни, считая день окончания введения токсиканта нулевым днем.

Определяли количество лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови, антимикробную активность полиморфноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ) и перитонеальных макрофагов (ПМФ) в отношении грибов Candida albicans, активность миелопероксидазы, кислой и щелочной фосфатазы и содержание катионных белков в фагоцитах [15].

Морфологическое состояние печени оценивали путем микроскопии срезов ткани печени, окрашенных гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Проводили гистохимические окраски на гликоген - по Шабадашу, на жир - суданом III. Электронномикроскопические исследования выполнены на электронном микроскопе JEM-100S. Для исследования активности АЛТ, АСТ и билирубина использовали стандартные тест-наборы.

Результаты регистрировали на следующий день после окончания введения препаратов коррекции (7 сутки). Эксперименты повторяли от 2 до 5 раз. Результаты исследования обрабатывали на ПЭВМ с помощью методов вариационной статистики [7], разработанных на базе пакета программ Microsoft Office. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05. Данные представлены в процентах к контролю.

В результате проведенных исследований установлено, что на 7 сутки после окончания введения токсиканта наблюдалась лейкопения (количество лейкоцитов составило 63,0% по отношению к контролю), формирование которой было обусловлено двукратным снижением числа лимфоцитов (57,02%). Это сопровождалось снижением активности кислородзависимых и кислороднезависимых микробицидных систем ПМЯЛ (индекс инактивации (ИИ) составил 80,54% и 82,89% соответственно).

Клетки моноцитарно-макрофагального звена оказались более чувствительны к повреждающему воздействию гербицида, что согласуется с ранее полученными данными: наблюдалось угнетение микробицидной активности ПМФ (ИИ - 81,43%), более выраженное в условиях блокады кислородзависимого киллинга (ИИ - 39,53%), что подтверждается снижением уровня катионных белков в ПМФ: процент активных (ПА) клеток составил 61,04%, а средний цитохимический коэффициент (СЦК) - 53,37%.

Гепатотоксические эффекты 2,4 - ДА проявились повышением проницаемости клеточных и субклеточных мембран гепатоцитов (увеличение содержания трансаминаз), нарушением процессов конъюгации билирубина и морфологическими изменениями. Светооптические исследования выявили отчетливые нарушения гемодинамики, дистрофические и некротические процессы в гепатоцитах с замещением их грубоволокнистой соединительной тканью. Наблюдалось преимущественное повреждением «светлых» гепатоцитов, которым присуща дезинтоксикационная функция (рис. 1). При электронномикроскопическом исследовании выявлено значительное количество некротизированных гепатоцитов с замещением их грубоволокнистой соединительной тканью. Наблюдалась вакуолизация цитоплазмы, фрагментация гранулярной эндоплазматической сети (ГРЭС), бесструктурные зоны, набухание митохондрий и уменьшение количества крист, что свидетельствует о снижении их функциональной активности (рис. 2).

Применение Тактивина и токоферола, как индивидуально, так и в комбинации, устраняло депрессивное влияние гербицида на активность оксидантных механизмов киллинга ПМЯЛ (ИИ составил 104,39%, 111,26% и 99,48% соответственно). Цитохимически это подтверждалось повышением активности миелопероксидазы в нейтрофилах как при изолированном использовании токоферола, так и в комбинации с Тактивином (СЦК составил 138,36% и 147,97% соответственно).

Рис. 4. Печень крысы при воздействии 2,4 - ДА и коррекции комбинацией «Тактивин +витамин Е». Незначительная лимфоцитарная инфильтрация вблизи междольковой вены и междолькового желчного протока. Окраска гематоксилином и эозином

ксенобиотик крыса тактивин токоферол

Рис. 5. Печень крысы при воздействии 2,4 - ДА и коррекции комбинацией «Тактивин + витамин Е». Увеличение количества митохондрий, ГРЭС, двухъядерных гепатоцитов. ЭМФ х 6500

Также Тактивин, токоферол и комбинация «Тактивин + витамин Е» восстанавливали активность кислороднезависимых микробицидных систем ПМЯЛ (ИИ - 106,89%, 103,08% и 107,63%). Это сопровождалось повышением/ восстановлением уровня катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах (СЦК составил 126,33%, 125,33% и 92,13% соответственно).

Использование Тактивина и витамина Е устраняло депрессию гербицидом оксидантных механизмов киллинга ПМФ (ИИ - 107,43%, 103,92% и 102,86% соответственно).

В тоже время Тактивин нормализовал (ИИ - 96,75%), а токоферол как самостоятельно, так и в комбинации с Тактивином, стимулировал неоксидантные микробицидные системы ПМФ (ИИ - 152,10% и 130,81%), что согласуется с повышением уровня катионных белков в этих клетках (рис. 3).

Применение токоферола существенно ослабляло повреждающее действие гербицида: нормализовалось содержание трансаминаз и прямого билирубина.

Морфологически определялось уменьшение жировой дистрофии, числа некротизированных клеток и увеличение двухъядерных гепатоцитов. Отмечалась сохранность клеточных и субклеточных мембран гепатоцитов, увеличение количества митохондрий, ГРЭС, агранулярного эндоплазматического ретикулума. При введении токоферола усиливались процессы регенерации и митотической активности печеночных клеток.

Тактивин нормализовал содержание АЛТ и устранял индуцированную гербицидом гипербилирубинемию. На светооптическом уровне выявлено уменьшение некротизированных клеток, увеличение количества клеток Купфера и двухъядерных гепатоцитов, что свидетельствует об усилении репаративных процессов. Отмечено увеличение числа митохондрий, рибосом и цистерн ГРЭС в гепатоцитах.

Сочетанное применение токоферола и Тактивина оказывало большее нормализующее влияние на морфофункциональное состояние гепатобилиарной системы: отмечено устранение гиперферментемии и гипербилирубинемии. Наблюдалось увеличение числа митозов, уменьшение белковой и жировой дистрофии гепатоцитов (рис. 4). Ультраструктурный анализ выявил увеличение количества удлиненных митохондрий с многочисленными кристами, ГРЭС, тесное взаимодействие между ГРЭС и митохондриями, что отражает активность окислительно-восстановительных процессов и свидетельствует об активации регенераторных и белковосинтетических процессов в гепатоцитах (рис. 5).

Выводы

1.       Показана эффективность применения Тактивина и токоферола для нивелирования негативного влияния гербицида 2,4 - ДА на оксидантные и неоксидантные микробицидные системы нейтрофильных гранулоцитов и перитонеальных макрофагов.

2.       Установлено корригирующее воздействие Тактивина и токоферола на морфофункциональное состояние печени в постинтоксикационном периоде при подострой интоксикации гербицидом 2,4 - ДА.

Литература

2.      Влияние комплексного применения натрия гипохлорита и a-токоферола на состояние про- и антиоксидантной систем крови при экспериментально желчном перитоните / Э.А. Петросян, В.И. Сергиенко, А.А. Сухинин, И.С. Захарченко, С.С. Оганесян // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2005. - Т. 139, №4. - С. 391 - 393.

.        Влияние Тактивина на активность естественных клеток-киллеров после острой интоксикации токсичными химическими веществами / П.Ф. Забродский, В.Г. Германчук, В.Ф. Киричук, А.О. Молотков, Г.М. Мальцева, О.В. Осипов, М.Л. Нодель // Эксперим. и клин. фармакология. - 2003. - Т. 66, №3. - С. 47 - 49.

.        Гигиенические подходы к оценке риска воздействия диоксинов на здоровье населения/ А.И. Потапов, Ю.В. Новиков, Т.Д. Минин, М.М. Сайфутдинов // Здравоохранение Рос. Федерации. - 1999. - №4. - С. 15-18.

.        Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при глубоком локальном охлаждении / Б.С. Утешев, И.Л. Бровкина, Н.А. Быстрова, А.Р. Авакян // Эксперим. и клин. фармакология. - 2001. - Т. 64, №3. - С. 56 - 60.

.        Камилов Ф.Х. Механизмы токсического действия гербицида аминной соли 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 - ДА) // Мат. конф. биохимиков Урала и Зап. Сибири «Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии». - Уфа, 1998. - с. 45.

.        Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 351 с.

.        Муфазалова Н.А. Фармакологическая коррекция иммуно- и гепатотоксических эффектов ксенобиотиков. - Уфа, 2002. - 48 с.

.        Мышкин В.А. Коррекция перекисного окисления липидов при экспериментальных интоксикациях различными химическими веществами: Автореф. дис.… д-ра мед. наук. - Челябинск, 1998. - 47 с.

.        Снижение активности естественных клеток-киллеров после острой интоксикации спиртами и холинотропными препаратами и ее восстановление Т-активином / П.Ф. Забродский, В.Ф. Киричук, В.Г. Германчук, М.Л. Нодель // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2003. - Т. 135, №1. - С. 71-74.

.        Хазиев Ф.Х. Содержание гербицида 2,4 - Д в почвах сельскохозяйственных районов/ Ф.Х. Хазиев, Ф.Ф. Хизбуллин, Ф.Я. Багаутдинов // Диоксины: экологические проблемы и методы анализа: Матер. конф. - Уфа: ИППЭП, 1995. - С. 32-38.

.        Хизбуллин Ф.Ф. Диоксины в жизненном цикле хлорорганических химических продуктов. - Уфа, 2005. - 179 с.

.        Хрипач Л.В. Роль свободнорадикального окисления в повреждении генома факторами окружающей среды / Л.В. Хрипач, Ю.А. Ревазова, Ю.А. Рахманин // Вестник РАМН. - 2004. - №3. - С. 16 - 18.

.        Юшков Б.Г. Влияние иммуномодуляторов на регенерацию печени / Б.Г. Юшков, И.Г. Данилова, Ю.С. Храмцова // Эксперим. и клин. фармакология. - 2006. - Т. 69, №1. - С. 53 - 55.