Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ
Для Республики Башкортостан весьма актуальной
является проблема геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Возбудителем
данного заболевания в Башкирии является хантавирус серотипа Puumala
(PUU), который
переносится преимущественно рыжей полевкой Clethrionomysglariolus.
Ежегодно в республике фиксируется до нескольких
тысяч случаев заболеваний ГЛПС, нередки летальные исходы (Фазлыева Р. и др.,
1995). К сожалению, на сегодняшний день не получены эффективные лекарственные
препараты для профилактики и лечения ГЛПС. Поэтому, особенно важным для нашего
региона является проблема разработки соответствующих профилактических и
лечебных средств, адаптированных к российским штаммам возбудителям этого
заболевания.
ДНК-вакцины представляют собой сравнительно новый
тип вакцин, принцип применения которых состоит в том, что в организм пациента
вводят ДНК, содержащую ген, кодирующий белок патогена, к которому необходимо
получить иммунный ответ. Данный метод уже позволил получить полноценный
(гуморальный и клеточный) иммунный ответ к огромному количеству патогенных
микроорганизмов (Ivoryetal.,
2004).
Целью нашей работы являлось создание на основе
эукариотического вектора pcDNA-3
плазмидной конструкции, содержащей ген нуклеокапсидного (N)
белка вируса ГЛПС и исследование возможного иммунного ответа, индуцированного
инъекцией ДНК данной конструкции в мышечную ткань мышей.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования был избран
клонированный фрагмент генома хантавируса серотипа PUU,
кодирующий полноразмерный N
белок, выделенный из больных, погибших от ГЛПС во время вспышки 1997-1988 г.г.
в г. Уфа. В опытах по ДНК-иммунизации использовали нелинейных белых мышей весом
18-20 г в возрасте 8-10 недель.
Для создания генетической конструкции,
использованной для иммунизации мышей, применяли стандартные методики (Sambrooketal.,
1989). Генную иммунизацию проводили по следующей схеме. Плазмидную ДНК,
выделенную и очищенную по стандартной методике, вводили мышам в физиологическом
растворе по 100 мкл в концентрации 2 мкг/мл в квадратичную мышцу 3 раза с
интервалом в три недели, кровь брали на 0, 3, 6, и 9 неделях опыта. На 10
неделе из мышечной ткани из места инъекции выделили геномную ДНК по методике
описанной Д. Мерфи и Дж. Хэнсоном (Гловер и др., 1989). Амплификацию геномной
ДНК проводили на многоканальном амплификаторе МС-2 (АО
"ДНК-Технология", Москва) в течение 40 циклов при температуре отжига
42°C. Иммуноферментный
анализ (ИФА) проводили по методике, изложенной в лабораторном руководстве
Гловера с соавт. (Гловер и др., 1989).
Результаты
Фрагмент генома вируса PUU
длиной 1302 п.н., кодирующий полноразмерный N
вирусный белок, мы переклонировали из созданной нами ранее плазмиды pGEM-TEasyS
в вектор для транзиентной экспрессии pcDNA-3
по сайтам для рестриктазы EcoRI.
После рестриктазного картирования и секвенирования был отобран клон pcDNA-3S
с правильной ориентацией вставки относительно CMV
промотора. Полученная конструкция pcDNA-3S
отвечает требованиям, предъявляемым для успешной ДНК-вакцинации (Smookeretal.,
2004). Вектор pcDNA-3 содержит
промотор цитомегаловируса, который обеспечивает высокий уровень экспрессии
клонированного гена в эукариотических клетках, а также сигнал
полиаденилирования. Для наработки плазмиды в E.
сoli в вектор включен
прокариотический origin
репликации. Кроме того, клонированная последовательность S-сегмента
содержит инициирующий ATG
и терминирующий TGA
триплеты. Плазмидная ДНК данного клона далее была использована нами для
иммунизации лабораторных мышей. В качестве контроля использовали вектор pcDNA-3,
который вводили по той же схеме, что и pcDNA-3S.
Сыворотка всех иммунизированных животных, собранная до начала эксперимента, а
также через одну неделю после каждой инъекции была тестирована с помощью
непрямого ИФА на присутствие антител к белку N
хантавируса.
эукариотический вектор
вирус лихорадка
Таблица 1. Гуморальный ответ мышей,
иммунизированных плазмидами pcDNA-3
(контроль) и pcDNA-3S,
содержащей последовательность, кодирующую N
белок вируса PUU
№
животного
|
Введенная
плазмида
|
Оптическая
плотность, О.Е.
|
|
|
Сыворотка
д. и.*
|
Сыворотка
3 неделя п.п.и.
|
Сыворотка
6 неделя п.п.и.
|
Сыворотка
9 неделя п.п.и
|
1
|
pcDNA-3
|
0,484
|
0,364
|
0,298
|
2
|
pcDNA-3S
|
0,382
|
1,481
|
1,820
|
0,296
|
3
|
pcDNA-3S
|
0,275
|
2,127
|
1,593
|
0,751
|
4
|
pcDNA-3S
|
0,251
|
2,068
|
1,173
|
5
|
pcDNA-3S
|
0,370
|
2,116
|
0,883
|
1,944
|
6
|
pcDNA-3S
|
0,121
|
0,863
|
1,645
|
0,247
|
7
|
pcDNA-3S
|
0,685
|
1,08
|
0,752
|
0,718
|
8
|
pcDNA-3S
|
2,01
|
0,156
|
0,862
|
9
|
pcDNA-3S
|
0,413
|
1,483
|
1,503
|
1,616
|
Данные ИФА показали, что внутримышечное введение
экспрессирующего вектора pcDNA-3S,
кодирующего ген белка N,
вызывало у большинства иммунизированных животных повышение уровня
иммуноглобулинов, что, видимо, связано с синтезом N-антител
(табл.1). Наибольший уровень антител, по сравнению с контролем, был
зафиксирован нами в сыворотке опытных животных, взятой на 3 и 6 неделях
эксперимента. В дальнейшем происходило некоторое снижение уровня антител, но, у
большинства мышей конечный уровень N-антител
после третьей инъекции значительно превышал исходный. У контрольного животного,
иммунизированного исходным плазмидным вектором pcDNA-3,
подобная динамика не наблюдалась. К сожалению, причина отсутствия вышеуказанной
динамики у части иммунизированных животных не ясна.
Методом ПЦР было показано присутствие плазмиды pcDNA-3S
в мышечной ткани иммунизированных мышей. Амплификация геномной ДНК, выделенной
из сайта инъекции с праймером, соответствующем участку с 39 по 59 н.
"+" цепи кДНК S-сегмента
штамма CG-1820/Уфа-83
(ориентация "+") и праймером, комплементарным участку с 552 по 576 н.
"+" цепи кДНК S-сегмента
штамма CG-1820/Уфа-83,
(ориентация "-") выявила фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым
и составил 537 п.н. (рис.1)
Рис.1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР:
1-маркерные фрагменты ДНК фага λ, расщепленные
рестриктазой StyI; 2-амплификация геномной ДНК мыши, иммунизированной pcDNA 3;
3, 4, 5, 6-амплификация геномной ДНК мышей, иммунизированных pcDNA 3S
Таким образом, мы предполагаем, что иммунизация
мышей плазмидной конструкцией pcDNA-3S,
содержащей последовательность, кодирующую белок N
вируса серотипа PUU,
под контролем CMV промотора,
индуцирует эндогенный синтез антител против данного антигена. Различия в
динамике N-антител связаны,
вероятнее всего, с индивидуальными особенностями иммунной системы мышей, поскольку
нами использовались нелинейные мыши. Также полученные нами результаты
свидетельствуют, что плазмида pcDNA-3S
присутствовала в мышечной ткани иммунизированных животных, по крайней мере, в
течение месяца после последней инъекции.
Роль белка N
в индукции защитного иммунитета против хантавирусов, вызывающих ГЛПС, остается
плохо изученной. Ранее проведенные исследования показали, что N-антитела
не обладают нейтрализующей активностью (Hooperetal.,
1999). Однако в ряде работ сообщалось, что иммунизация мышей рекомбинантным
хантавирусным N белком, а также
ДНК-вакцинация животных экспрессирующими векторами, несущими ген белка N
патогенных хантавирусов защищало мышей в некоторых случаях от дальнейшего
заражения ГЛПС (Ulrich etal.,
1998; Buchtetal.,
2001; Bharadwajetal.,
2002). Поэтому, возможно, что белок N
играет важную роль в индукции клеточного иммунитета против инфекции, вызываемой
хантавирусами.
Таким образом, в дальнейшем необходимо провести
новые долгосрочные эксперименты с целью определить, способна ли полученная нами
конструкция вызвать долговременный иммунный ответ в животных, а также защитить
их от инфицирования хантавирусом серотипа PUU.
Список
литературы
.Ivory
C., Chadee K. DNA vaccines: designing strategies against parasitic infections
// Gen.vaccines and therapy. - 2004. - V. 2 - P.17-45.
.Sambrook
J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning
A laboratory manual, 2nd edn. - 1989. - Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, Gold Spring Harbor.
3.Гловер.
Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир, 1989. С. 346.
.Smooker
P., Rainczuk A., Kennedy N., Spithill T. DNA vaccines and their application
against parasites-promise, limitations and potential solutions. 2004. - V.10. -
P.189-236.
.Ulrich
R., Lundkvist A., Meisel H., Koletzki D., Brus-Sjolander K., Gelderblom H.,
Borisova G., Schnitzler P., Darai G., Kruger D. Chimaeric HBC core particles
carrying a defined segment of Puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke
protective immunity in an animal model // Vaccine. - 1998. -V. 16. - P.
272-280.
.Bucht
G., Sjolander K., Eriksson S., Lindgren L., Eigh F. Modifying the cellular
transport of DNA-based vaccines alters the immune response to hantavirus
nucleocapsid protein // Vaccine. -2001. -V.19. - P. 3820-3829.
.Bharadwaj
M., Mirowsky K., Ye C., Botten J., Masten B., Yee J., Lyons C., Hjelle B.
Genetic vaccines protect against Sin Nombre hantavirus challenge in the deer
mouse (Peromyscus maniculatus) // J. of Gen. Virol. - 2002. - V. 83. - P.
1745-1751.