Скрининг микроделеций AZF локуса y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза
СКРИНИНГ
МИКРОДЕЛЕЦИЙ AZF ЛОКУСА Y ХРОМОСОМЫ У МУЖЧИН С НАРУШЕНИЕМ СПЕРМАТОГЕНЕЗА
А.А.
Исламова, Р.И. Хусаинова, Р.Ф. Ахметов, О.С. Шитков, Э.К. Хуснутдинова
Проблема бесплодия встречается примерно у 15%
супружеских пар, причем примерно половина случаев обусловлена нарушением
сперматогенеза у мужчин. Генетические факторы в этиологии бесплодия занимают
ведущее место в структуре нарушений репродуктивной функции, как у мужчин, так и
женщин. Причиной генетически обусловленного мужского бесплодия, связанного с
нарушением сперматогенеза, в10-15% случаев являются структурные нарушения
Y-хромосомы.
Ранее полагали, что функция Y-хромосомы у
млекопитающих ограничивается контролем за дифференцировкой пола, но в 1976 г.
были представлены доказательства значения Y-хромосомы человека для
сперматогенеза. Y-хромосома- одна из самых маленьких хромосом в геноме
человека- имеет размер около 60Mb, 30 из которых приходится на эухроматиновые
домены, а остальное- на гетерохроматиновый блок в дистальном участке длинного
плеча, который может сильно варьировать по размеру у разных индивидов. В целом,
хромосома делится на три участка: эухроматиновое короткое плечо (Yp11),
эухроматиновая проксимальная часть длинного плеча (Yq11) и гетерохроматиновый
дистальный участок (Yq12). Эухроматиновые районы невариабельны в размерах [1].
Анализируя терминальную делецию Y-хромосомы у 6
стерильных мужчин с нормальным фенотипом и азооспермией, Tiepolo и Zuffardi в
1976 году предположили существование генного комплекса мужской фертильности в
дистальном участке эухроматиновой части длинного плеча Y-хромосомы (Yq11). Этот
локус назвали фактором азооспермии (AZF) [13].
Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили
построить детальную карту Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала.
В настоящее время цитогенетическими и
молекулярно-генетическими методами можно диагностировать макро- и микроделеции
Y-хромосомы, захватывающие локус AZF, которые удается обнаружить у 10-15%
больных с азооспермией и у 5-10% с олигозооспермией тяжелой степени [3,
6, 9, 11, 16].
В 1996 г Vogt и соавторы на основании полученных
данных о локализации и размере делеций предложили выделить в локусе
Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона, получившие названия AZFa, AZFb
и AZFc [16].
AZFа субрегион располагается в дистальной части Yq11, AZFb и AZFc картированы
проксимальнее первого. У пациентов с микроделециями этих субрегионов выявлено
нарушение сперматогенеза на различных стадиях, в зависимости от потери
определенного участка AZF.
Впоследствии для каждого субрегиона были
выделены кандидатные гены, ответственные за нарушение сперматогенеза: для AZFa
- USP9Y(DFFRY) и DBY, для AZFb - RBMY, для AZFc-региона - DAZ. Определены
нуклеотидная последовательность и размер каждого субрегиона: AZFa около 800
тыс. п. н., AZFb - 3,2 млн. п. н. и AZFc-3,5 млн. пар нуклеотидов.
В отличие от генов-кандидатов субрегионов AZFb и
AZFc, гены AZFa-субрегиона представлены на хромосоме единственной копией,
поэтому, даже точковые мутации могут вызвать нарушение сперматогенеза и
приводить к бесплодию у мужчин. Вероятно, делеции или мутации гена DBY,
кодирующего тестис-специфичную РНК-геликазу, нарушают процесс метаболизма мРНК
в дифференцирующихся мужских половых клетках, приводя к усилению его апоптической
активности.
Гены RBMY и DAZ, являющиеся «кандидатными»
генами для субрегионов AZFb и AZFc, представлены на Y-хромосоме в нескольких
копиях, кодируют белки с РНК-связывающей активностью, которые участвуют в
метаболизме новосинтезированных РНК-транскриптов. Вероятно, гены семейства RBMY
играют важную роль на стадиях пролиферации сперматогониев и при прохождении
сперматоцитов через стадии профазы I мейоза, а их отсутствие или нарушение
функции может привести к блоку сперматогенеза на стадии сперматоцитов и, как
следствие, к азооспермии. Продукты, кодируемые генами DAZ, участвуют в
метаболизме мРНК тестис-специфичных генов, регулируя их экспрессию в
дифференцирующихся половых клетках после мейоза на этапах сплайсинга,
транспорта, хранения и селективной трансляции мРНК вплоть до образования зрелых
сперматозоидов. Делеции генов DAZ могут приводить к различной степени нарушения
сперматогенеза - от снижения числа сперматозоидов вплоть до СКС (синдром клеток
Сертоли) - либо блокированию сперматогенеза на уровне сперматид (делений
созревания) [4]. Вследствие
многокопийности генов RBMY и DAZ поиск мутационных нарушений в них значительно
затруднен. Ряд генов локуса AZF имеет гомологи, расположенные как на
X-хромосоме, так и на аутосомах. Механизмы их межгенного взаимодействия,
возможности функциональной компенсации еще не известны и требуют дальнейшего
изучения.
У пациентов с делециями локуса AZF, помимо
снижения количества сперматозоидов, отмечено ухудшение их подвижности и
морфологических характеристик - олигоастенотератозооспермия. Специфичных форм
нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с делециями локуса AZF не
описано. Помимо генов DAZ субрегион AZFc содержит копии гена CDY I (хромодомен
хромосомы Y), функция которого связана с модификацией хроматина в дифференцирующихся
мужских половых клетках. Поэтому нельзя исключить, что потеря или дефекты
функции генов CDY I могут быть в определенной степени ответственны за нарушение
сперматогенеза.
Строгой зависимости степени и стадии нарушения
сперматогенеза от локализации и размера делеции локуса AZF не получено, однако
был выявлен ряд общих гено-фенотипических корреляций. В настоящее время
установлено, что более крупные делеции, захватывающие два или три субрегиона, а
также AZFa-микроделеции ассоциированы с более тяжелым нарушением сперматогенеза
(синдром клеток Сертоли). Наиболее частые делеции субрегионов AZFc и AZFb+с
приводят к снижению сперматогенной активности или блокированию сперматогенеза
до СКС [2,7].
Определение зависимости степени нарушения
сперматогенеза от размера и локализации делеций имеет прогностическое значение
в плане получения сперматозоидов, пригодных для проведения ИКСИ
(Introcitoplasmic Sperm Injection).Так, наличие делеций, захватывающих
субрегионы AZFa и/или AZFb, указывает на невозможность получения зрелых половых
клеток, а у пациентов с делециями AZFc примерно в 50-70% случаев удается
получить зрелые сперматозоиды [7].
Материалы и методы
С февраля 2005 года лабораторией молекулярной
генетики человека ИБГ УНЦ РАН совместно с Центром планирования семьи и
репродукции с медико-генетическим консультированием при Республиканском
перинатальном центре было обследовано 45 пациентов с первичным бесплодием.
Возраст инфертильных мужчин варьировал от 24 до 48 лет (в среднем 33±4.8
года).
Обследование включало следующие исследования:
клиническое, андрологическое (общее и специальное), спермиологическое и
молекулярно-генетическое (анализ микроделеций Y-хромосомы). На основании
результатов спермиологического исследования все мужчины с нарушением
сперматогенеза были разделены на 3 группы. В первую группу отобрали 32 пациента
с азооспермией, во вторую - 13 мужчин с олигозооспермией тяжелой степени (менее
5 млн/мл эякулята), в третью - 4 пациента с астенотератозооспермией (количество
сперматозоидов превышало 5 млн/мл эякулята). Контрольная группа состояла из 50
здоровых (фертильных) мужчин, имеющих потомство. Спермиологический анализ
эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1992;
1999) [15].
ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови последовательным методом
фенольно-хлороформной экстракции по Mathew [11].
Полимеразную цепную реакцию приводили на
программируемом термоциклере «Терцик » производства фирмы « ДНК-технология »
(Россия).
Для обнаружения делеций применяли мультиплексную
амплификацию согласно руководству, предложенному Simoni и соавт. [12]
с использованием диагностического набора «AZF» («Центр Молекулярной Генетики
Лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН»).
В ходе анализа выполняли детектирование делеций
в трех субрегионах AZF. Набор праймеров, использованных в данной работе,
позволял исследовать 9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локуса:
для субрегиона AZFa:
sY 86, sY 84, sY 615.
для субрегиона AZFc: sY 254 (DAZ), sY 255 (DAZ).
Кроме того, в качестве “внутреннего” контроля на
присутствие в геномной ДНК фрагментов короткого плеча Y -хромосомы использовали
два маркера SRY и ZFY - что позволяло выявить наличие даных локусов и
определить сответствие фенотипического пола генотипическому. В качестве
“внешнего положительного” контроля использовали ДНК фертильного мужчины.
Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 7%-ном
полиакриламидном геле с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия.
Результаты и обсуждение.
Среди 45 обследованных мужчин с бесплодием
делеции локуса AZF были обнаружены у 4 (в 8,9 % случаев). Микроделеции были
выявлены в двух случаях у пациентов с азооспермией, что составляет 6,25%
случаев для данной группы. В группе больных с олигозооспермией тяжелой степени
микроделеции были обнаружены у двух больных, частота встречаемости оказалась
равной 22,2%. В контрольной группе фертильных мужчин микроделеции Y - хромосомы
не были определены. Во всех случаях выявлены микроделеции AZFc-локуса, что
доказано дублирующими независимыми исследованиями (рис. 1).
Частота микроделеций Y-хромосомы среди мужчин с
бесплодием значительно варьирует в исследованиях разных авторов (от 1% до 35%) [9,
10, 12, 14]. Столь широкий разброс частот делеций
обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют
критерии отбора пациентов для проведения микроделеционного анализа и количество
исследуемых локусов STS [6, 8, 10, 12].
По литературным данным, у мужчин с бесплодием частота микроделеций в AZF-локусе
Y хросомы составляет в среднем 7,5% в различных популяциях мира. У пациентов с
идиопатической азооспермией микроделеции обнаружены в 18% случаев, с тяжелой
олигозооспермией неясного генеза - в 14,3% случаев [9].
Результаты, полученные в ходе нашего исследования, не противоречат этим данным,
хотя оказались несколько выше среднемирового уровня.
бесплодие генотипирование делеция
хромосома
Рис. 1- Генотипирование делеций в Y хромосоме (1
дорожка - делеция sY255 и sY254, 2-10 дорожки - норма, 11 - маркер
молекулярного веса λ/PstI)
Специфичного лечения нарушения сперматогенеза у
мужчин с делециями локуса AZF в настоящее время не разработано. Обнаружение у
пациента делеции позволяет избежать необоснованного гормонального или
хирургического лечения. Но в то же время, у мужчин с микроделециями субрегиона
AZFc Y-хромосомы не стоит отказываться от проведения сперматогенезстимулирующей
терапии и лечения сопутствующей патологии репродуктивной системы, так как
велика вероятность получения от них сперматозоидов, которые могли бы быть
успешно использованы при ИКСИ [7].
Полученные результаты еще раз подтверждают
необходимость генетического обследования, включая цитогенетическое исследование
и микроделеционный анализ локусов AZF у пациентов с необструктивной
азооспермией и тяжелой олигозооспермией неясного генеза, с целью установления
причины бесплодия и оптимальной тактики лечения.
Учитывая высокую частоту микроделеций в AZF
локусе Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза из Республики
Башкортостан, молекулярно-генетический скрининг локусов AZF должен быть
проведен всем пациентам с бесплодием неясного генеза, которым рекомендовано
экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или ИКСИ.
ЛИТЕРАТУРА
1. В.Л.
Быков Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы).// Проблемы
репродукции.- 2000.- № 1.
2. Гоголевский
П.А., Гоголевская И.К. Y-хромосома и мужское бесплодие (обзор литературы)
//Пробл. репродукции 1999.-№ 5, Т.5.- с.26-34.
. П.А.
Гоголевский, А.С. Калугина, Д.А. Бондарев и др. AZF- микроделеции и мужское
бесплодие // Андрология и генитальная хирургия. - 2001.- №4. - с.73-77.
1. В.М.
Здановский, П.А. Гоголевский, И.К. Гоголевская Тестирование микроделеций на Y -
микроделеций у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза.// Проблемы
репродукции.- 2000. - Т.6, № 6.- с.56-59.
2. Ю.А.Логинова,
И.И. Нагорная, С.А. Шлыкова Цитогенетическое исследование и микроделеционный
анализ локусов AZF. //Проблемы репродукции. - 2000. - №5.
. В.Б.
Черных, Л.Ф. Курило, В.А. Поляков Y-хромосома, AZF-делеции и идиопатическое
бесплодие у мужчин (обзор литературы). //Проблемы репродукции.- 2001. - Т.7.-
№5.- с.47-58.
. В.Б.Черных,
Л.Ф.Курило, Л.В Шилейко и др. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с
бесплодием: совместный опыт исследований. //Мед. Генетика.-
2003.- №8.- с.367-379.
. Calogero
A.E., Garofalo M.R., D. Agata R. Factors imfluencing the variable incidence of
Y- chromosome microdeletions in infertile patients // Hum Reprod.- 1999. - Vol.
14, №2. - P. 275.
. Krausz
C., McElreavey K. Y chromosome and male infertility // Frontiers in Biosunce -
1999. Vol.2 - P. 943-949.
. Mathew
C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in
molecular biology / Ed. Walker J.M.N.Y.; Haman Press. - 1984. - P. 31-34.
. Simoni
M…, Bakker E., Eurling M. et al. Laboratory
guidelines for molecular diagnosis of Y- chromosomal microdeletion // Int. J.
Androl. - 1999. - Vol. 22.- P. 292-299.
10. Tiepolo
L., Zuffardi O. Localisation of factors controlling spermatogenesis in the non
fluorescent portion of the human Y- chromosome long arm // Hum. Genet.
- 1976.- Vol.34. - P.119-124.
11. Van
der Ven K., Montag M., Peschka B. et al. Combined
cytogenetic and Y-chromosome microdeletion screening in males undergoing
intracytoplazmic sperm injection. Mol Hum Reprod 1997; 3: 699-704.
. WHO
(1999). Руководство ВОЗ по лабораторному иследованию эякулята человека и
взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Четвертое издание.
Cambridge University Press,1999. Пер. с англ. Р.А. Нерсесяна. Научн. ред.
перевода проф. Курило Л.Ф.-М.- 2001.-143с.
13. Vogt
P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y- chromosome azoospermia factor
(AZF) mapped to different subregions in Yq11 // Hum. Mol. Genet. - 1996.
- Vol.- 5, №7. - P.933-943.