Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Министерство образования и науки российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кубанский государственный университет»

Кафедра биохимии и физиологии

Выпускная квалификационная работа Бакалавра

метод PCR real time в диагностике мутаций EGFR

Работу выполнил Л.А. Кондратова

Научный руководитель М.Л. Золотавина

Краснодар 2013

Реферат

Исследование выполнено на базе генетической лаборатории Краснодарского онкологического диспансера №1, период с 26.06.2012 по 26.05.2013г.

Цель работы: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

Объект исследования - опухолевая ткань больных раком легких, представленная гистологическими блоками эпителиальной ткани легких.

Методом в данной работе служила полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Этот метод служит для выявления мутаций в ДНК материале.

В результате данного исследования было выявлено наличие мутаций у 29,4% больных раком легких, а так же были выявлены некоторые закономерности в возникновении мутаций в гене EGFR.

Содержание

Введение

. Аналитический обзор

.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

.2 Проблемы диагностики рака легких

.2.1 Метод PCR Real Time

.2.2 Зависимость выбора тактики лечения от мутаций

. Материал и методы

.1 Материал исследования

.2 Методы исследования

.2.1 Выделение и оценка количества ДНК

.2.2 Количественная PCR в реальном времени с использованием технологии ARMS и Scorpions

.3 Методы статистической обработки данных

. Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Заключение

Библиографический список

Приложение

Обозначения и сокращения

РЛ - рак легких

ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция

ТК - тирозин киназы

Введение

В настоящее время лабораторная диагностика занимает важное место в пропедевтике заболеваний. Большинство анализов биохимических показателей крови и других биологических жидкостей, несомненно, очень популярны сегодня и не без основания: они могут характеризовать как состояние всего организма, так и отдельных органов. Но, к сожалению, они не дают быстрого, точного и достаточно информативного ответа в ряде случаев.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени − это метод диагностики, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. Кроме того, этот метод используется для получения копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого генетически обусловленного признака. Исследование образцов ткани, содержащих опухоль, проводят при помощи метод PCR в реальном времени. Порог чувствительности данного метода, при использовании нами набора Therascreen всего пять процентов мутантных клеток.

Ученые-практики все чаще отмечают возрастающее количество онкологических заболеваний. В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием активирующих мутаций в соответствующем гене.

Во всех странах мира отмечается резкое повышение частоты заболевания раком легкого. Из редкого заболевания, которым считался в прошлом столетии, рак легких превратился в одну из наиболее частых причин смерти онкологически больных людей. Ежегодно в Российской Федерации заболевают раком более 63000 человек, в том числе свыше 53000 мужчин. Более 20000, или 34,2%, выявляются в IV стадии заболевания. Несмотря на то, что уровень смертности от рака легкого в ряде стран снизился в последнее десятилетие, общее количество умерших от этого заболевания может сравниться с совокупным числом погибших от рака толстой кишки, поджелудочной и предстательной железы [Мерабишвили, Дятченко, 2000].

Уже в середине 90-х годов прошлого века стало очевидно, что химиотерапия на основе препаратов платины достигла «плато» своей эффективности. Одним из путей улучшения результатов терапии злокачественных новообразований является индивидуализация тактики лечения этих больных: с помощью определения генов-мишеней в опухолевой ткани. Наиболее изученной группой таких мишеней является семейство ростовых факторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [Имянитов, 2010].

Индивидуализация тактики лечения больных заключается в применении таргетных препаратов, подавляющих активность фермента эпидермального фактора роста. Эти препараты являются низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназ, которые блокируют АТФ-связывающий внутриклеточный домен EGFR и тем самым сигналы поступающие от этого рецептора не принимаются.

Цель исследования: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

. Определить частоту возникновения мутаций в гене EGFR.

. Определить наиболее распространенный гистологический тип рака легкого при выявлении мутаций в гене EGFR.

. Проследить влияние вдыхаемого табачного дыма на возникновения мутаций.

. Выявить зависимость возникновения мутаций в соответствии с половой принадлежностью.

1. Аналитический обзор

.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

Наследственные признаки живых организмов не являются неизменными, так как ни один механизм деления и созревания половых клеток не застрахован от ошибки, а ошибки приводят к генетическим изменениям - мутациям [mygenom.ru].

Способность мутировать - это универсальное свойство всех форм жизни от вирусов и микроорганизмов до высших растений, животных и человека. Различают два вида мутации:

. Мутации, возникающие в половых клетках или спорах (генеративные мутации), передаются по наследству.

. Мутации, возникающие в соматических клетках, приводят к генетическому мозаицизму, т.е. часть организма состоит из мутантных клеток, другая - из немутантных. В этих случаях мутации могут наследоваться только при вегетативном размножении с участием мутантных соматических частей организма (почек, черенков, клубней и т.п.), такие мутации могут вызывать опухолевые процессы [Жученко, 2004].

По характеру изменения генетического аппарата мутации делят на три типа:

. Геномные мутации заключаются в изменении числа хромосом в клетках организма.

. Хромосомные мутации. К таким мутациям относят: инверсии - участок хромосомы перевернут на 180°, так что содержащиеся в нем гены расположены в обратном порядке по сравнению с нормальным; транслокации - обмен участками двух или более негомологичных хромосом; делеции - выпадение значительного участка хромосомы; нехватки - выпадение небольшого участка хромосомы; дупликации - удвоение участка хромосомы; фрагментации - разрыв хромосомы на две части или более;

. Генные мутации представляют собой стойкие изменения химического строения отдельных генов и, как правило, не отражаются на наблюдаемой в микроскоп морфологии хромосом [Фогель, Мотульски, 1990].

Мутацию в организме человека вызывают радиационные факторы, химические и биологические, то есть состояние окружающей среды. В зависимости от силы воздействия фактора, происходят изменения на различных уровнях организации человека (генный, клеточный и т. д.). Последствиями мутаций являются: увеличение разнообразия наследственных признаков человека, а также рост врожденных пороков, ускорение процессов старения, появление большого количества волос на теле. Человек в течение своей жизни может подвергается нескольким мутациям[www. primeinfo.net.ru].

Большинство случаев злокачественных опухолей развиваются вследствие целой серии генетических мутаций, которые происходят на протяжении жизни отдельного человека. Такие мутации называют "приобретенными", так как они не являются врожденными. Большинство приобретенных мутаций вызываются факторами окружающей среды, такими как воздействие токсинов или вызывающих рак агентов. Развивающийся в этих случаях рак носит название "спорадического". Некоторые люди могут нести в своих клетках более высокое количество врожденных мутаций, чем другие и даже в равных условиях окружающей среды, при воздействии одинакового количества токсинов, некоторые люди имеют более высокий риск развития рака [Чудов, 2002].

.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

Рецептор EGF (EGFR) является продуктом одного из онкогенов семейства erb − c-erbB1, часто называемом по аналогии с названием кодируемого белка − геном EGFR. Рецептор имеет молекулярную массу 170 kD и состоит из длинного внеклеточного домена с двумя богатыми цистеином областями, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью. Эта активность рецептора EGF важна для осуществления большинства его функций, включая изменение подвижности клеток и инициацию синтеза ДНК. Число рецепторов EGF варьирует от одного клеточного типа к другому. Наибольшее число рецепторов выявлено в эмбриональной ткани и пролиферирующих клетках эпителия [Давыдов, Полоницкий 2003].

В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием активирующих мутаций в соответствующем гене. Такие мутации приводят к стабилизации диммерного состояния рецепторов, в результате которой они постоянно находятся в активированном состоянии, независимо от связывания с лигандом. В результате рост опухолевых клеток, несущих мутацию гена EGFR, в большей степени зависит от передачи сигнала по внутриклеточному сигнальному пути, активируемому EGF, чем рост клеток, не имеющих подобных отклонений [cancergenom.ru].

При связывании рецептора с лигандом происходит активация EGFR − диммеризация и аутофосфориллирование рецепторов, что индуцирует активацию нескольких сигнальных путей (а именно последовательное фосфориллирование сигнальных внутриклеточных киназ). Известно, что при активации EGFR запускаются внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к повышению пролиферации малигнизированных клеток; росту опухоли; стимуляции процессов инвазии, патологического ангиогенеза и метастазирования [www. humbio.ru/humbio/cytology/002fde31.htm].

Важно понимать, что под мутациями гена EGFR подразумеваются изменения в самой последовательности ДНК, а не изменения уровня экспрессии белка EGFR и количества копий гена EGFR.

Спектр мутаций, выявляемых на сегодняшний день в гене EGFR стандартными методами, и имеющих практическую значимость, ограничивается точечными заменами, делециями и инсерциями в участке ДНК, кодирующем тирозинкиназный домен рецептора. Опухоли, несущие подобные мутированные гены хорошо отвечают на воздействие низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназного домена EGFR.

Отдельно следует отметить, что генетические изменения в метастатических очагах опухоли не всегда аналогичны изменениям в первичном очаге, то есть отсутствие мутаций в клетках первичной опухоли не гарантирует, что их также не будем и в клетках метастазов. Также, важно помнить, что проведенное лечение может менять генотип опухолевых клеток [Конверсия неоперабельной стадии рака легкого … 2010; Рагулин, 2012; Тюлядин, 2003].

Таким образом, при диагностировании рака легких важно исследовать ДНК опухоли, чтобы установить этиологию развития заболевания и назначить соответствующее лечение.

генетический опухолевый мутация рак

В настоящее время в России заболевают раком легкого свыше 63000 человек, в том числе 53000 мужчин. Умирает ежегодно от РЛ свыше 60000 человек, что составляет более 20% от всех умерших от злокачественных новообразований. Практически у 2/3 первично выявленных больных диагностируется РЛ III и IV стадий. В течение первого года умирают 80%, лишь около 10% больных имеют шанс прожить более пяти лет, а при мелкоклеточном раке этот показатель составляет лишь 1,3%. РЛ имеет наихудший прогноз среди всех раковых заболеваний [www.pmarchive.ru <#"650229.files/image001.gif">

Рисунок 1 - Количество выявленных мутаций среди больных раком легких

Таким образом, причиной возникновения заболевания ракам легких на одну треть являлась мутация в гене EGFR.

Следующим шагом нашего исследования стало определение частоты возникновения рака легких по причине мутации в гене EGFR в трех субъектах Южного Федерального округа.

Таблица 1 - Возникновение мутации в гене EGFR у больных раком легких в Ростовской и Волгоградской областях и в Краснодарском крае

Из таблицы 1 мы можем проследить тенденцию к увеличению возникновения мутаций в гене EGFR больных, проживающих в Ростовской области - 24,8%, 32,5% - в Краснодарском крае и 36,7% - в Волгоградской области. Исходя из цели нашего исследования, мы оценивали возможность использования мутаций в гене EGFR как генетических маркеров при раке легких. Для этого мы сравнили группы больных раком легких, чтобы выявить, в каких случаях риск возникновения заболевания выше.

Следуя задачам нашего исследования, мы определили при каком типе рака легкого наиболее часто выявляется мутация в гене EGFR. В нашей выборке было представлено пять типов рака легкого. В таблице 2 представлены данные, указывающее количество больных, у которых выявлена мутация в гене EGFR с учетом гистологического типа рака легких.

Таблица 2 - Гистологические типы рака легких, представленные в нашей выборке

Из таблицы 2 видно, что все больные, у которых выявлена была мутация в гене EGFR, имели тип рака легкого «аденокарцинома», поэтому мы сравнили возникновение мутаций только у больных аденокарциномой.

Ниже представлены данные о влиянии табачной зависимости на возникновения мутаций в гене EGFR. В таблице 3 представлены данные, показывающие количество курящих и некурящих мужчин и женщин.

Таблица 3 - Количество больных раком легкого имеющих никотиновую зависимость

В таблицы 3 отмечено, что курящих мужчин намного больше, чем женщин. На сегодняшний день, по мнению ученых, курение является самой распространенной причиной возникновения рака легких [Мерабишвили, Дятченко, 2000]. Поэтому, мы решили сравнить данные возникновения мутации среди курящих и некурящих людей, но чтобы исключить влияние пола, было решено взять группы, состоящие только из мужчин. Данные таблицы 4 показывают, что точечная оценка данных говорит нам о том, что риск возникновения мутаций в гене EGFR у людей, не испытывающих пагубного влияния табачного дыма в 4,88 раза больше, чем у людей не подверженных данному риску.

Таблица 4 - Частота активирующих соматических мутаций в гене EGFR в зависимости от курения

Ниже представлены данные отображающие таблицу 4 в графическом виде.

Рисунок 2 - Влияние табачной зависимости на возникновение активирующих соматических мутаций в гене EGFR с учетом доверительных интервалов

Эти данные были статистически подсчитаны с помощью «точного теста Фишера» и выявили, что риск возникновения мутаций у некурящих выше с вероятностью р>0,028. Причины повышенного риска возникновения мутаций в гене EGFR именно при отсутствии курения являются не до конца изученными. Возможно, это связано с тем, что присутствующие в сигаретах канцерогены никак не влияют на возникновения мутаций в гене EGFR.

Таким образом, при анализе влияния табачного дыма нами было выявлено четыре типа людей, больных раком легких среди мужчин: курящие с мутацией в гене EGFR, курящие без мутации, некурящие с мутацией и некурящие без мутации в гене EGFR. Их общее количество было принято за 100%. Из таблицы 5 следует, что самую обширную группу занимают мужчины, больные раком легких, но у которых не было обнаружено мутаций в гене EGFR. Это свидетельствует о том, что влияние табачного дыма на возникновение мутации в гене EGFR не доказано, что подтверждает и низкий уровень возникновения активирующих соматических мутаций в гене EGFR в группе курящих мужчин.

Второй фактор, рассмотренный нами в данной работе - это влияние половой принадлежности на возникновение активирующих соматических мутаций в гене EGFR. Данные были рассчитаны строго по отдельному критерию половой принадлежности, и в таблице 6 представлены данные только некурящих людей.

Таблица 6 - Частота активирующих соматических мутаций в гене EGFR в зависимости от половой принадлежности пациентов

На рисунке 3 представлены эти же данные, но в виде диаграммы.

Рисунок 3 - Частота возникновения мутаций в гене EGFR в зависимости от половой принадлежности больных раком легких с учетом доверительных интервалов

«Точный тест Фишера» показал, что выборки статистически отличаются на уровне p>0,034.

Следует заметить, что возникновение мутаций у женщин наблюдается в два раза выше, чем у мужчин.

При исследовании влияния полового признака на возникновение мутации в гене EGFR нами так же было выделено четыре типа больных раком легких среди некурящих: женщины с мутацией в гене EGFR, женщины без мутации, мужчины с мутацией и мужчины без мутации в гене EGFR.

Таблица 7 - Частота возникновения мутаций в гене EGFR у больных раком легкого в зависимости от половой принадлежности.

В ходе исследования был проведен анализ ДНК методом PCR Real Time у 169 больных с диагнозом «рак легких» различного гистологического типа. Установлены закономерности возникновения мутации EGFR.

Во-первых, нами проанализировано при каком гистологическом типе рака легкого чаще всего встречаются мутации в гене EGFR. Оказалось, что выявленные мутации в гене EGFR обнаружены у больных аденокарциномой.

Во-вторых, нами было выяснено, что мутации могут возникать у некурящих людей. Некоторые случаи возникновения мутаций имели место, если пациент курил ранее, но не выявлено мутаций в гене EGFR у курящих людей. Но, при дальнейшем анализе данных факт прямой зависимости вдыхаемого табачного дыма на возникновение мутаций в гене EGFR не подтвержден.

В-третьих, нами было изучено влияние половой принадлежности на возникновение мутаций в гене EGFR. По нашим данным достоверно различие в том, что у женщин частота возникновения мутаций в гене EGFR в 2 раза выше, чем у мужчин. Причиной этому могут служить некоторые особенности женского организма.

Таким образом, использование мутаций в гене EGFR как маркер опухолевой ткани действительно позволяет оценить мутационный статус опухоли на раннем этапе ее формирования.

Заключение

Рак легкого отличается высокой частотой рецидивов и генерализации процесса, даже в случае если лечение начато достаточно рано. Однако существует проблема ранней диагностики рака легкого: зачастую больные попадают к врачу с запущенным распространенным раком, часто с метастазами. Все это обусловливает необходимость прогнозирования течения заболевания и разработки стратегии лечения рака легкого на основе более глубокого изучения процессов канцерогенеза и молекулярно-генетических особенностей конкретных опухолей.

Подходы к лечению опухоли легкого и его результативность в значительной степени зависят от морфологических и генотипических особенностей рака. То есть лечение должно быть адресное, и зависит оно от причин возникновения рака легких.

Проведенное нами исследование позволило оценить возможность использования мутации в гене EGFR как генетический маркер и сделать несколько выводов:

. Проведенный анализ PCR на наличие активирующих мутаций в гене EGFR показал, что мутации обнаруживаются в 29,4% случаев.

. Мутации в гене EGFR были обнаружены при гистологическом типе «аденокарцинома».

. Влияние табачного дыма на возникновение рака легких не доказано, хотя и у курящих людей относительный риск возникновения мутаций в 6,964 больше.

. Так же нами было выявлено, что у женщин в 3,129 больший относительный риск возникновения мутаций в гене EGFR.

Таким образом, метод PCR Real Time является перспективным методом в диагностике мутаций EGFR у больных раком легких.

Библиографический список

1. Актуальные вопросы комбинированного лечения рака легкого / Барчук А. С. [и др.] // Вопросы онкологии. 2012. №2. С. 253-259.

2. Баранов В.С. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия // Молекулярная биология. 2000. Т. 34, №4. С.19-22.

. Батурина O.A., Бреннер Е.В., Суслякова O.A. Определение нуклеотидных последовательностей − перспективный метод диагностики наследственных заболеваний // Сборник трудов конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск. - 2-5 сентября 2008. - С. 76-80.

. Власов П.В., Барышников А.С., Ионова В. Г. Клинико-рентгенологическая диагностика рака легкого // Медицинская газета. 2005. №17. С.15-18.

. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М., 2002. 589 с.

. Давыдов М. И., Полоцкий Б. Е. Детекция молекулярных нарушений, характерных для рака легкого. Возможности использования в клинической практике // Онкология. 2003. №5. С. 44-47.

. Демин А.С. Мутации человека. // Наука. 2009. №9. С. 35-37.

. Жучеко А.А. Генетика. М., 2004. 240 с.

. Иванцов А.О. Морфологические и иммуногистохимические особенности опухолей человека с мутацией рецептора эпидермального фактора роста: автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук. Спб, 2011. 32 с.

. Имянитов В.Н. Общие представления о таргетной терапии // Онкология. 2010. №3. С. 123-130.

. Левченко Е.В., Моисеенко В.М., Мацко Д.Е. Конверсия неоперабельной стадии рака легкого в операбельную у EGFR-позитивных пациентов на фоне лечения гефитинибом: два клинических случая // Современная онкология. 2010. №2. С.88-92.

. Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т. Статистика рака легкого (заболеваемость, смертность, выживаемость)// Онкология. 2000. №3. С. 3-5.

. Моисеенко В. М., Проценко С.А. Эффективность гефинитиба (Ирессы) в первой линии терапии // Вопросы онкологии. 2010. №1. С. 20-23.

. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) / А.Н. Екимов [и др.] // Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации. 2008.

. Подольская С.В. Методы молекулярной генетики в современной медицине //Журнал практического врача. 2002. №5. С. 48-50.

. Применение Ирессы (гефитиниба) в качестве терапии первой линии для лечения неоперабельных аденокарцином легкого, содержащих мутацию в гене EGFR / В.М. Моисеенко [и др.] // Современная онкология. 2010. №1. С.33-37.

. Рагулин Ю.А. Таргетные препараты и лучевая терапия в лечении местнораспространенного рака легкого // Современная онкология. 2012. №2. С. 156-160.

. Тюляндин С. А. Перспективные подходы лекарственной терапии немелкоклеточного рака легкого // Онкология. 2003. №5. С. 27-31.

. Чудов С.В. Устойчивость видов и популяционная генетика хромосомного видообразования: Монография. М., 2002. 97с.

. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: в 3-х т. Т. 2: Генетика человека. Пер с англ. М., 1990. 378 с.

23. Потанин А.В., Потанин В.П. Ранняя диагностика рака легкого (обзор по материалам электронных средств массовой информации) <http://pmarchive.ru/rannyaya-diagnostika-raka-legkogo-obzor-po-materialam-elektronnyx-sredstv-massovoj-informacii/> // PMARCHIVE.RU <http://pmarchive.ru/>. Режим доступа: <http://pmarchive.ru/rannyaya-diagnostika-raka-legkogo-obzor-po-materialam-elektronnyx-sredstv-massovoj-informacii/> (дата обращения 18.05.2013)

. Роль рецептора EGFR и мутаций гена EGFR в патогенезе рака легкого // CANCERGENOME.RU. Режим доступа: http: //www.cancergenome.ru/page39 <http://www.cancergenome.ru/page39> (дата обращения 20.11.2012)

. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) // HUMBIO.RU. Режим доступа: <http://humbio.ru/humbio/cytology/002fde31.htm> (дата обращения 20.11.2012)

26. Набор Real-Time-EGFR-L858R. Набор реагентов для выявления мутации L858R в гене EGFR методом ПЦР в режиме реального времени // BIOLINKLAB.RU. Режим доступа: http: //www.biolinklab.ru/system/files/manuals/real-timepcregfrl858r.pdf?download=1 <http://www.biolinklab.ru/system/files/manuals/real-timepcregfrl858r.pdf?download=1> (дата обращения 28.11.2012)

. Тарантул В. З. Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами // MYGENOME.RU. Режим доступа: http: //mygenome.ru/articles/89/ <http://mygenome.ru/articles/89/> (дата обращения 28.11.2012)

. Человек продолжает прогрессивно мутировать // PRIMEINFO.NET.RU. Режим доступа: http:// primeinfo.net.ru/ news1908.html?submit <http://primeinfo.net.ru/news1908.html?submit> (дата обращения 5.12.2012)

Приложение

Характеристика соматических мутаций в гене EGFR