Колиформные бактерии

Колиформные бактерии

1. Обзор литературных источников

.1 Систематика кишечной палочки

Научная классификация

Домен: Бактерии

Тип: Протеобактерии

Класс: Гамма-протеобактерии

Порядок: Enterobacteriales

Семейство: Энтеробактерии

Род: Escherichia

Вид: Coli (Кишечная палочка)

Международное научное название

Escherichia coli (Migula 1895)

1.2 Строение и химический состав бактериальной клетки

Внутренняя организация бактериальной клетки сложна. Каждая систематическая группа микроорганизмов имеет свои специфические особенности строения.

Клетка бактерий одета плотной оболочкой. Этот поверхностный слой, расположенный снаружи от цитоплазматической мембраны, называют клеточной стенкой. Стенка выполняет защитную и опорную функции, а также придает клетке постоянную, характерную для нее форму (например, форму палочки или кокка) и представляет собой наружный скелет клетки. Эта плотная оболочка роднит бактерии с растительными клетками, что отличает их от животных клеток, имеющих мягкие оболочки. Внутри бактериальной клетки осмотическое давление в несколько раз, а иногда и в десятки раз выше, чем во внешней среде. Поэтому клетка быстро разорвалась бы, если бы она не была защищена такой плотной, жесткой структурой, как клеточная стенка.

Толщина клеточной стенки 0,01-0,04 мкм. Она составляет от 10 до 50% сухой массы бактерий. Количество материала, из которого построена клеточная стенка, изменяется в течение роста бактерий и обычно увеличивается с возрастом.

Основным структурным компонентом стенок, основой их жесткой структуры почти у всех исследованных до настоящего времени бактерий является муреин (гликопептид, мукопептид). Это органическое соединение сложного строения, в состав которого входят сахара, несущие азот, - аминосахара и 4-5 аминокислот. Причем аминокислоты клеточных стенок имеют необычную форму (D-стереоизомеры), которая в природе редко встречается.

С помощью способа окраски, впервые предложенного в 1884 г. Кристианом Грамом, бактерии могут быть разделены на двегруппы: грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные организмы способны связывать некоторые анилиновые красители, такие, как кристаллический фиолетовый, и после обработки иодом, а затем спиртом (или ацетоном) сохранять комплекс иод-краситель. Те же бактерии, у которых под влиянием этилового спирта этот комплекс разрушается (клетки обесцвечиваются), относятся к грамотрицательным.

Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий различен. У грамположительных бактерий в состав клеточных стенок входят, кроме мукопептидов, полисахариды (сложные, высокомолекулярные сахара), тейхоевые кислоты (сложные по составу и структуре соединения, состоящие из сахаров, спиртов, аминокислот и фосфорной кислоты). Полисахариды и тейхоевые кислоты связаны с каркасом стенок - муреином. Какую структуру образуют эти составные части клеточной стенки грамположительных бактерий, мы пока еще не знаем. С помощью электронных фотографий тонких срезов (слоистости) в стенках грамположительных бактерий не обнаружено. Вероятно, все эти вещества очень плотно связаны между собой.

В стенках грамотрицательных содержится значительное количество липидов (жиров), связанных с белками и сахарами в сложные комплексы - липопротеиды и липополисахариды. Муреина в клеточных стенках грамотрицательных бактерий в целом меньше, чем у грамположительных бактерий. Структура стенки грамотрицательных бактерий также более сложная. С помощью электронного микроскопа было установлено, что стенки этих бактерий многослойные.

Внутренний слой состоит из муреина. Над ним находится более широкий слой из не плотно упакованных молекул белка. Этот слой в свою очередь покрыт слоем липополисахарида. Самый верхний слой состоит из липопротеидов.

Клеточная стенка проницаема: через нее питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена выходят в окружающую среду. Крупные молекулы с большим молекулярным весом не проходят через оболочку.

Клеточная стенка многих бактерий сверху окружена слоем слизистого материала - капсулой. Толщина капсулы может во много раз превосходить диаметр самой клетки, а иногда она настолько тонкая, что ее можно увидеть лишь через электронный микроскоп, - микрокапсула.

Капсула не является обязательной частью клетки, она образуется в зависимости от условий, в которые попадают бактерии. Она служит защитным покровом клетки и участвует в водном обмене, предохраняя клетку от высыхания.

По химическому составу капсулы чаще всего представляют собой полисахариды. Иногда они состоят изгликопротеидов (сложные комплексы сахаров и белков) и полипептидов (род Bacillus), в редких случаях - из клетчатки (род Acetobacter).

Слизистые вещества, выделяемые в субстрат некоторыми бактериями, обусловливают, например, слизисто-тягучую консистенцию испорченного молока и пива.

Все содержимое клетки, за исключением ядра и клеточной стенки, называется цитоплазмой. В жидкой, бесструктурной фазе цитоплазмы (матриксе) находятся рибосомы, мембранные системы, митохондрии, пластиды и другие структуры, а также запасные питательные вещества. Цитоплазма обладает чрезвычайно сложной, тонкой структурой (слоистая, гранулярная). С помощью электронного микроскопа раскрыты многие интересные детали строения клетки.

Внешний липопротвидный слой протопласта бактерий, обладающий особыми физическими и химическими свойствами, называется цитоплазматической мембраной.

Внутри цитоплазмы находятся все жизненно важные структуры и органеллы.

Цитоплазматическая мембрана выполняет очень важную роль - регулирует поступление веществ в клетку и выделение наружу продуктов обмена.

Через мембрану питательные вещества могут поступать в клетку в результате активного биохимического процесса с участием ферментов. Кроме того, в мембране происходит синтез некоторых составных частей клетки, в основном компонентов клеточной стенки и капсулы. Наконец, в цитоплазматической мембране находятся важнейшие ферменты (биологические катализаторы). Упорядоченное расположение ферментов на мембранах позволяет регулировать их активность и предотвращать разрушение одних ферментов другими. С мембраной связаны рибосомы - структурные частицы, на которых синтезируется белок. Мембрана состоит из липопротеидов. Она достаточно прочна и может обеспечить временное существование клетки без оболочки. Цитоплазматическая мембрана составляет до 20% сухой массы клетки.

На электронных фотографиях тонких срезов бактерий цитоплазматическая мембрана представляется в виде непрерывного тяжа толщиной около 75A, состоящего из светлого слоя (липиды), заключенного между двумя более темными (белки). Каждый слой имеет ширину 20-30А. Такая мембрана называется элементарной.

Между плазматической мембраной и клеточной стенкой имеется связь в виде десмозов - мостиков. Цитоплазматическая мембрана часто дает инвагинации - впячивания внутрь клетки. Эти впячивания образуют в цитоплазме особые мембранные структуры, названные мезосомами. Некоторые виды мезосом представляют собой тельца, отделенные от цитоплазмы собственной мембраной. Внутри таких мембранных мешочков упакованы многочисленные пузырьки и канальцы. Эти структуры выполняют у бактерий самые различные функции. Одни из этих структур - аналоги митохондрий. Другие выполняют функции зндоплазматической сети или аппарата Гольджи. Путем инвагинации цитоплазматической мембраны образуется также фотосинтезирующий аппарат бактерий. После впячивания цитоплазмы мембрана продолжает расти и образует стопки, которые по аналогии с гранулами хлоропластов растений называют стопками тилакоидов. В этих мембранах, часто заполняющих собой большую часть цитоплазмы бактериальной клетки, локализуются пигменты (бактериохлорофилл, каротиноиды) и ферменты (цитохромы), осуществляющие процесс фотосинтеза.

В цитоплазме бактерий содержатся рибосомы - белок-синтезирующие частицы диаметром 200А. В клетке их насчитывается больше тысячи. Состоят рибосомы из РНК и белка. У бактерий многие рибосомы расположены в цитоплазме свободно, некоторые из них могут быть связаны с мембранами.

В цитоплазме клеток бактерий часто содержатся гранулы различной формы и размеров. Однако их присутствие нельзя рассматривать как какой-то постоянный признак микроорганизма, обычно оно в значительной степени связано с физическими и химическими условиями среды. Многие цитоплазматические включения состоят из соединений, которые служат источником энергии и углерода. Эти запасные вещества образуются, когда организм снабжается достаточным количеством питательных веществ, и, наоборот, используются, когда организм попадает в условия, менее благоприятные в отношении питания.

У многих бактерий гранулы состоят из крахмала или других полисахаридов - гликогена и гранулезы. У некоторых бактерий при выращивании на богатой сахарами среде внутри клетки встречаются капельки жира. Другим широко распространенным типом гранулярных включений является волютин (метахроматиновые гранулы). Эти гранулы состоят из полиметафосфата (запасное вещество, включающее остатки фосфорной кислоты). Полиметафосфат служит источником фосфатных групп и энергии для организма. Бактерии чаще накапливают волютин в необычных условиях питания, например на среде, не содержащей серы. В цитоплазме некоторых серных бактерий находятся капельки серы.

Помимо различных структурных компонентов, цитоплазма состоит из жидкой части - растворимой фракции. В ней содержатся белки, различные ферменты, т-РНК, некоторые пигменты и низкомолекулярные соединения - сахара, аминокислоты.

В результате наличия в цитоплазме низкомолекулярных соединений возникает разность в осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной среды, причем у разных микроорганизмов это давление может быть различным. Наибольшее осмотическое давление отмечено у грамположительных бактерий - 30 атм, у грамотрицательных бактерий оно гораздо ниже 4-8 атм.

В центральной части клетки локализовано ядерное вещество - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

У бактерий нет такого ядра, как у высших организмов (эукариотов), а есть его аналог - «ядерный эквивалент» - нуклеоид, который является эволюционно более примитивной формой организации ядерного вещества. Микроорганизмы, не имеющие настоящего ядра, а обладающие его аналогом, относятся к прокариотам. Все бактерии - прокариоты. В клетках большинства бактерий основное количество ДНК сконцентрировано в одном или нескольких местах. У бактерий ДНК упакована менее плотно, в отличие от истинных ядер; нуклеоид не обладает мембраной, ядрышком и набором хромосом. Бактериальная ДНК не связана с основными белками - гистонами - и в нуклеоиде расположена в виде пучка фибрилл.

На поверхности некоторых бактерий имеются придаточные структуры; наиболее широко распространенными из них являются жгутики - органы движения бактерий.

Жгутик закрепляется под цитоплазматической мембраной с помощью двух пар дисков. У бактерий может быть один, два или много жгутиков. Расположение их различно: на одном конце клетки, на двух, по всей поверхности. Жгутики бактерий имеют диаметр 0,01-0,03 мкм, длина их может во много раз превосходить длину клетки. Бактериальные жгутики состоят из белка - флагеллина - и представляют собой скрученные винтообразные нити.

1.3 Морфология кишечной палочки и ее представителей

кишечный палочка микрофлора

Кишечная палочка - это полиморфная факультативная анаэробная короткая (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) грамотрицательная палочка с закругленным концом. Штаммы в мазках располагаются беспорядочно, не образуя спор и перитрих. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу и пили, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов. Большинство штаммов E. coli являются безвредными, однако серотип O157:H7 может вызывать тяжёлые пищевые отравления у людей.

Бактерии группы кишечных палочек хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes).

Обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С бактерии делят на лактозоотрицателъные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые формируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С..coli не всегда обитают только в желудочно-кишечном тракте, способность некоторое время выживать в окружающей среде делает их важным индикатором для исследования образцов на наличие фекальных загрязнений.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 +/- 1°C в течение 24 - 48 ч.

Колиформные бактерии (колиформы) - группа грамотрицательных палочек, в основном живущих и размножающихся в нижнем отделе пищеварительного тракта человека и большинства теплокровных животных (например, домашнего скота и водоплавающих птиц). Вводу попадают, как правило, с фекальными стоками и способны выживать в ней в течение нескольких недель, хотя при этом (в подавляющем большинстве) не размножаются.

Термотолерантные колиформные бактерии играют важную роль при оценке эффективности очистки воды от фекальных бактерий. Более точным индикатором служит именно E. coli (кишечная палочка), так как источником некоторых других термотолерантных колиформ могут служить не только фекальные воды. В тоже время общая концентрация термотолерантных колиформ в большинстве случаев прямо пропорциональна концентрации E. coli, а их вторичный рост в распределительной сети маловероятен (за исключением случаев наличия в воде достаточного количества питательных веществ, при температуре выше 13 °C.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) - входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44 +/ - 0,5 °C в течение 24 ч.

Включают род эшерихия и в меньшей степени отдельные штаммы цитробактер, энтеробактер и клебсиеллу. Из этих организмов только Е. соli специфично фекального происхождения, причем она всегда присутствует в больших количествах в экскрементах человека и животных и редко обнаруживается в воде и почве, не подвергшихся фекальному загрязнению. Считается, что обнаружение и идентификация Е. соli дает достаточную информацию для установления фекальной природы загрязнения.

Колиформы в большом количестве содержатся в бытовых сточных водах, а также в поверхностном стоке с территорий скотоводческих ферм. В водоисточниках, используемых для централизованного питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, допускается численность общих колиформ не более 1000 единиц (КОЕ/100 мл, КОЕ - колониеобразующие единицы), а термотолерантных колиформ - не более 100 единиц. В питьевой воде колиформыне должны обнаруживаться в пробе объемом 100 мл. Допускается случайное попадание колиформных организмов в распределительную систему, но не более чем в 5% проб, отобранных в течение любого 12-месячного периода при условии отсутствия E. coli.

Присутствие колиформных организмов в воде свидетельствует о ее недостаточной очистке, вторичном загрязнении или о наличии в воде избыточного количества питательных веществ.

2. Материалы и методы исследования

При исследовании относительно чистой в микробном отношении воды на наличие патогенных микроорганизмов необходимо концентрировать искомую микрофлору, содержащуюся в ничтожно малом количестве в воде. Обнаружение возбудителей кишечных инфекций в воде открытых водоемов и сточных водах на фоне преобладающей массы сапрофитной микрофлоры наиболее эффективно при концентрировании искомых бактерий в средах накопления, которые угнетают рост сопутствующей микрофлоры. Следовательно, при проведении анализа воды, имеющей различную степень общего микробного загрязнения, используют определенные методы выделения патогенной микрофлоры.

Открытые ведаемы обычно характеризуется значительным содержанием взвешенных веществ, т.е. мутностью, часто цветностью, малым содержанием солей, относительно малой жесткостью, наличием большого количества органических веществ, относительно высокой окисляемостью и значительным содержанием бактерий. Сезонные колебания качества речной воды нередко бывают весьма резкими. В период паводков сильно возрастает мутность и бактериальная загрязненность воды, но обычно снижается ее жесткость (щелочность и солесодержание). Сезонные изменения качества воды в значительной степени влияют на характер работы очистных сооружений водопровода в отдельные периоды года.

Количество микробов в 1 мл воды зависит от наличия в ней питательных веществ. Чем вода загрязненнее органическими остатками, тем больше в ней микробов. Особенно богаты микробами открытые водоемы и реки. Наибольшее количество микробов в них находится в поверхностных слоях (в слое 10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением глубины количество микробов уменьшается.

Речной ил богаче микробами, чем речная вода. В самом поверхностном слое ила бактерий так много, что образуется из них как бы пленка. В этой пленке содержится много нитчатых серобактерий, железобактерий, они окисляют сероводород до серной кислоты и этим препятствуют угнетающему действию сероводорода (предотвращается замор рыб).

Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3-4 десятка километров снова приближается к исходной величине. Это самоочищение воды зависит от ряда факторов: механическое осаждение микробных тел; уменьшение в воде питательных веществ, усвояемых микробами; действие прямых лучей солнца; пожирание бактерий простейшими и др.

Патогенны могут попадать в реки и водоемы со сточными водами. Бруцеллезная палочка, палочка туляремии, вирус полиомиелита, вирус ящура, а также возбудители кишечных инфекций - палочка брюшного тифа, палочка паратифа, дизентерийная палочка, холерный вибрион - могут сохраняться в воде длительное время, и вода может стать источником инфекционных заболеваний. Особенно опасно попадание болезнетворных микробов в водопроводную сеть, что случается при ее неисправности. Поэтому за состоянием водоемов и подаваемой из них водопроводной воды установлен санитарный биологический контроль.

2.1 Гидрометрический поплавковый метод измерения и определения скорости течения воды

Для измерения и определения скорости течения воды существует - поплавковый метод, который основан на отслеживании движения предмета, опущенного в поток (поплавка) с помощью приборов или невооруженным глазом. Поплавки сбрасываются в воду на малых реках с берега или с лодки. По секундомеру определяется время и прохождение поплавка между двумя соседними створами, расстояние между которыми известно. Поверхностная скорость течения приравнивается скорости движения поплавка. Поделив пройденное поплавком расстояние на время наблюдения, получают скорость потока.

2.2 Отбор воды, хранение и транспортировка проб

Пробы воды для бактериологического анализа отбирают с соблюдением правил стерильности: в стерильные бутылки или стерильными приборами - батометрами в количестве 1 л.

Для отбора воды из открытых водоемов, сточных вод, воды из бассейнов, колодцев удобен так называемый бутылочный батометр.

Методические указания по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной природы в воде.

При отборе проб воды из открытых водоемов следует предусмотреть следующие точки: в месте застоя и в месте наиболее быстрого течения (с поверхности и на глубине 50 - 100 см).

Бутылочный батометр. Батометры - приборы различной конструкции для взятия проб воды с разных глубин. В классическом виде это цилиндры, которые можно опустить на определенную глубину, там закрыть и извлечь. Самостоятельно изготовить классический батометр непросто. Но вместо него можно использовать простую стеклянную или пластиковую бутылку с узким горлышком, утяжеленную каким-либо грузом и заткнутую пробкой, идеально - корковой. К горлышку бутылки и к пробке привязываются веревки. Опустив бутылку на нужную глубину (главное, чтобы она тонула, для этого и нужен груз), необходимо выдернуть пробку - поэтому затыкать ее туго не следует. Дав бутылке время наполниться на нужной глубине (1-2 мин), ее вытаскивают на поверхность. Делать это следует как можно более энергично - при большой скорости подъема и узком горлышке вода из вышележащих слоев практически не попадет внутрь.
Пробы, поднятые на поверхность с помощью батометра, также следует «сгущать», используя планктонную сеть, а затем рассчитывать объем процеженной воды. Поскольку этот объем должен быть, по возможности, большим, батометр следует делать как можно большего размера, например использовать 2-литровую стеклянную или пластиковую бутылку или какой-либо еще сосуд большого размера с узким горлом. На веревке, к которой привязана бутылка, также следует сделать отметки через каждый метр - для определения глубины отбора проб.

Первая контрольная точка у дамбы (начало пляжа) - точка забора (ТЗ1).

Вторая контрольная точка у лодочной станции (конец пляжа) - точка забора (ТЗ2).

Т31-первая контрольная точка у дамбы (начало пляжа) Т32-вторая контрольная точка у лодочной станции (конец пляжа)

2.3 Хранение и транспортирование проб

К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора.

Анализ следует провести в течение 2-х часов после забора.

Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.

2.4 Подготовка посуды к анализу

Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.

Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть заткнуты силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и упакованы так, чтобы исключить загрязнение после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.

Новые резиновые пробки кипятят в 2%-м растворе натрия двууглекислого 30 минут и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки 30 минут кипятят в дистиллированной воде, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Чашки Петри в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Подготовленную посуду стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160-170°С 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60 °С.

После выполнения анализа все использованные чашки и пробирки обеззараживают в автоклаве при (126±2)°С 60 минут. Пипетки обеззараживают кипячением в 2%-м растворе NaHC03.

После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.

В чашки Петри заливают заранее приготовленный питательный агар ЭНДО и ставят для застывания.

2.5 Метод мембранных фильтров

Mетод определения количества клеток E.coli в единице объема жидкости (коли-индекс); суть метода заключается в фильтровании анализируемой жидкости через мембранные фильтры, задерживающие бактерии, после чего эти фильтры помещают на твердую питательную среду и подсчитывают выросшие на ней колонии бактерий.

Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями завода - изготовителя.

Подготовка фильтровального аппарата

Фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

При методе мембранных фильтров определенное количество воды пропускается через специальную мембрану с размером пор порядка 0.45 мкм.

В результате, на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. После чего мембрану с бактериями помещают на специальную питательную среду (ЭНДО). После чего чашки Петри переворачивали и помещали в термостат на определенное время и температуру. Общие колиформные бактерии (ОКБ) - инкубировали при температуре 37 +/- 1°C в течение 24-48 ч. Для определения термотолерантных бактерий посев производят в среду, предварительно прогретую до температуры 44°С, и инкубируют при этой же температуре в течение 24 часов.

Среда светочувствительна. Поэтому все засеянные чашки предохраняют от света.

Во время этого периода, называемого инкубационным, бактерии получают возможность размножиться и образовать хорошо различимые колонии, которые уже легко поддаются подсчету.

По окончании сроков инкубации производят просмотр посевов:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для бактерий кишечной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования (18-24 ч) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают и микроскопируют.

Если рост круглых колоний малинового цвета с металлическим блеском диаметром 2,0-3,0 мм - Escherichia coli 3912/41 (055:K59);

Если рост круглых колоний малинового цвета диаметром 1,5-2,5 мм с нечетким металлическим блеском - Escherichia coli 168/59 (O111:K58)

2.6 Учет результатов

После инкубационного периода 48 часов для общих колиформных бактерий и 24 часа для термоталерантных бактерий производят подсчет выросших на чашках колоний.

Колонии, выросшие на поверхности, а также в глубине агара, подсчитывали с помощью лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

не менее 3 - 4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Подсчитывают число колоний каждого типа.

Вычисление и представление результатов.

Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) общих колиформных бактерий в 100 мл воды. Для подсчета результата суммируют число колоний, подтвержденных как общие колиформные бактерии, выросших на всех фильтрах, и делят на 3.

Так как такой метод анализа воды предполагает только определение общего числа колонии - образующих бактерий разных типов, то по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микробов. Однако, высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и о высокой вероятности наличия патогенных организмов.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на принадлежность к Граму.

Окраска по Граму

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных Грам (+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Реактивы: карболовый раствор генцианвиолета или кристалвиолета, водный раствор Люголя, 96% этиловый спирт, водно-спиртовой раствор фуксина.

Методика окраски. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианвиолета от 1/2 до 1 минуты. Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя на 1 минуту. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 96% спирте в течение от 1/2 до 1 минуты, пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином от 1/2 до 1 минуты. Сливают краситель, промывают и высушивают препарат.

3. Результаты исследования

.1 Микробиологический анализ воды Печерского озера (на примере E.coli) в весенний период (май) исследования 2009-2013 гг.

В результате трехкратного забора воды в двух точках отбора проб (ТЗ1 - в начале пляжа, у дамбы, ТЗ2 - конец пляжа, лодочная станция) нами были высчитаны средние показатели ОКБ и ТКБ, результаты которых представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1. Средние показатели ОКБ и ТКБ в воде Печерского озера за май 2013 г.

Показатель содержания бактерий E.coli по ОКБ в начале и в конце мая в ТЗ1 (у дамбы) не различаются, составив 195 КОЕ/см³, что в 3,3 раза меньше по сравнению с пробой воды, отобранной в ТЗ2 (у лодочной станции) в начале мая и в 4,3 раза больше в конце мая.

Изучение динамики содержания кишечной палочки в воде Печерского озера за май 2013 года по данным СЭС подтвердил правильность проведения собственных исследований и показала, что показатель ОКБ в ТЗ2 в 3,4 раза выше чем в ТЗ1 (по собственным результатам в 3,3 раза больше).

Изучение изменения показателей ОКБ и ТКБ за месяц май с 2009 по 2013 гг. показало широкое варьирование показателей, что наглядно представлено на рисунках 3.1 - 3.2

Анализ данных учреждения здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за начало мая 2008-2013 гг.

По окончанию анализа данных за начало мая 2008-2013 гг., мы установили что в 2008,2012 годах в ТЗ1 ОКБ оказалось больше чем в ТЗ2.

Анализ данных учреждения здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за конец мая 2008-2013 гг.

Общие колиформные бактерии согласно СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл питьевой воды

Термотолерантные фекальные колиформы согласно СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл исследуемой питьевой воды.

Для открытых водоемов по ОКБ не более 500 КОЕ на 100 мл воды, по ТКБ не более 100 КОЕ на 100 мл воды.

Наличие в воде кишечных палочек подтверждает фекальную природу загрязнения.

По результатам измерений в летнюю межень колиформные бактерии присутствуют в небольших количествах, обычно от ста до нескольких сот единиц, и лишь в периоды паводков кратковременно повышаются до 1000 и более единиц.

Низкие значения летом могут быть связаны с несколькими факторами:

) интенсивной солнечной радиацией, которая губительна для бактерий;

) повышенными значениями рН в летний период (летом обычно рН > 8, зимой < 8) за счет развития фитопланктона;

) выделением в воду метаболитов фитопланктона, ингибирующих бактериальную флору.

С началом осенне-зимнего сезона перечисленные факторы существенно ослабляются, и численность бактерий повышается до уровня нескольких тысяч единиц. Наибольшие экстремумы попадают на периоды таяния снега, особенно в половодье, когда талые воды смывают бактерии с поверхности водосбора.

Общее число колонии образующих бактерий в середине лета как привело ниже, чем в весенне-осенний период, что связано с интенсивной солнечной радиацией, которая губительна для бактерий.

Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3-4 десятка километров снова приближается к исходной величине.

Наибольшее количество микробов в открытых водоемах находится в поверхностных слоях (в слое 10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением глубины количество микробов уменьшается.

Речной ил богаче микробами, чем речная вода. В самом поверхностном слое ила бактерий так много, что образуется из них как бы пленка. В этой пленке содержится много нитчатых серобактерий, железобактерий, они окисляют сероводород до серной кислоты и этим препятствуют угнетающему действию сероводорода (предотвращается замор рыб).

Заключение

кишечный палочка возбудитель бактерия

Для нахождения и идентификации кишечной палочки был произведен микробиологический анализ проб за начало мая 2013 г. Также осуществлен статистический анализ данных учреждения здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за начало мая 2008-2012 гг.

По окончанию анализа было установлено, что рассчитанное нами число бактерий группы кишечных палочек не превышает допустимой нормы.

По окончанию статистического анализа данных учреждения здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за 2008-2012 гг., было установлено, что в летнюю межень колиформные бактерии присутствуют в небольших количествах. Общее число колонии образующих бактерий в середине лета как привело ниже, чем в весенне-осенний период, так как интенсивной солнечной радиацией, которая губительна для бактерий, а с началом осенне-зимнего сезона численность бактерий повышается до уровня нескольких тысяч единиц. Наибольшие экстремумы попадают на периоды таяния снега, особенно в половодье, когда талые воды смывают бактерии с поверхности водосбора.

Список литературы

1. Фомин Г.С. Вода. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам. Энциклопедический справочник. М.: Изд-во «Протектор», 1995.

. Долгоносов Б.М., Дятлов Д.В., Сураева Н.О., Богданович О.В., Громов Д.В., Корчагин К.А. Информационно-моделирующая система Aqua CAD - инструмент по управлению технологическими режимами на водопроводной станции // Водоснабжение и санитарная техника. 2003. №6. С. 26-31.

. Долгоносов Б.М., Храменков С.В., Власов Д.Ю., Дятлов Д.В., Сураева Н.О., Григорьева С.В., Корчагин К.А. Прогноз показателей качества воды на входе водопроводной станции // Водоснабжение и санитарная техника 2004. №11. С. 15-20.

. Кочемасова З.Н., Ефремова С.А., Рыбакова А.М. Санитарная микробиология и вирусология. М.: Медицина, 1987.

. СанПиН 2.1.5.980-00. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод.

. СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества.

. МУК 4.2.1018-01. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.