Тестирование зрительной функции млекопитающих

Тестирование зрительной функции млекопитающих

ВВЕДЕНИЕ

Данная работа посвящена одному из методов тестирования зрительной функции млекопитающих. Зрительная система разных видов млекопитающих обнаруживает высокую степень специализации, которая позволяет надежно детектировать зрительные объекты в разнообразных условиях естественного освещения. Изучение особенностей сравнительной физиологии зрительной коры млекопитающих позволяет определить, за счет каких функциональных механизмов обеспечивается тонкая настройка зрительного анализатора. Классические исследования свойств нейронов проводят с помощью регистрации внеклеточных потенциалов отдельных нервных клеток. Однако такой подход является довольно трудоемким и длительным по времени, поскольку требует накопления данных на большой популяции клеток. Новые исследовательские технологии позволяют быстро и эффективно регистрировать активность больших популяций нейронов и выявлять особенности работы зрительной коры.

В данной работе представлены данные по объективному тестированию зрительной функции млекопитающих с помощью одного из современных методов картирования нейронной активности коры мозга, которым является оптическое картирование по внутреннему сигналу, в основе которого лежит детектирование разницы в оптических свойствах окисленной и восстановленной форм гемоглобина крови.

Цель работы

С помощью оптического картирования по внутреннему сигналу подобрать и оценить оптимальные параметры зрительных стимулов для активации зрительной коры млекопитающих.

Основные задачи исследования

.        Адаптировать методику оптического картирования по внутреннему сигналу для проведения экспериментов на крысах.

.        Подобрать параметры зрительной стимуляции для активации зрительной коры млекопитающих.

.        Оценить степень активации коры в разных стимульных условиях.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

§ 1.1 Сенсорные системы

Окружающая среда полна изменений и событий. Чтобы выжить, млекопитающим нужна максимальная информация о ней, поэтому в ходе эволюции развился целый арсенал сенсорных датчиков и связанных с ними анализаторных центров мозга. Сенсорные системы мозга млекопитающих можно уподобить ситу, которое задерживает лишь малые крупицы всей доступной информации. Представление об окружающем мире у животных и человека ограничено, так как ограничен воспринимаемый диапазон энергий, на который в состоянии реагировать. Организмы способны прямо ощущать только те виды энергии, которые их преобразователи могут обнаружить и превратить в нервные импульсы. В тоже время основные изменения в окружающей среде (для большинства организмов) могут быть сгруппированы в несколько основных категорий: механические, химические, электромагнитные и термические [2,5]. Соответственно можно классифицировать основные сенсорные системы как:

ü  механорецептивная (реагирует на механическое раздражение и разделяется на три класса : а) кожные рецепторы и рецепторы суставов; б) вестибулярные органы; в) ухо):

ü  хеморецептивная (обоняние и вкус);

ü  фоторецептивная (зрительная система).

В отличие от трех основных классов рецепторов, терморецепторы, являющиеся наиболее широко представленными в организме, не развили сложного чувствительного органа.

В ходе эволюции фоторецептивная сенсорная система претерпела множество изменений. Природа совершенствовала зрительный анализатор, так как он является ключевым в восприятии окружающего мира. Животные и человек способны оценивать расстояние, воспринимать контраст, различать объекты, их границы и форму. Развитие цветного зрения поставило млекопитающих на более высокую ступень эволюции. Все это обеспечивало живые организмы преимуществами, определяющими успешность стратегии выживания в процессе естественного отбора.

§ 1.2 Основные этапы обработки зрительной информации

Зрительная система посзвоночных животных, несмотря на значительные различия для разных систематических групп, обладает сходным планом строения (рис. 1). Обработка светового сигнала начинается на сетчатке глаза, а заканчивается в высших зрительных центрах головного мозга.

Рис.1 Строение зрительных путей человека

Сетчатка

Первым этапом обработки зрительной информации является сетчатка. Гистологическое строение сетчатки довольно сложное, в ней более 50-ти подтипов основных видов нейронов. Основными типами нервных клеток сетчатки являются:

ü Фоторецепторные клетки: палочки и колбочки отвечают за сумеречное и дневное зрение, соответственно. Именно они поглощают фотоны.

ü  Горизонтальные клетки: формируют сложную, контролируемую медиатором, электрически связанную сеть; объединяют группы фоторецепторных клеток. Потенциалы действия не генерируют.

ü  Биполярные клетки: передают информацию от фоторецепторов ганглиозным и (или) амакриновым клеткам.

ü  Интерплексиформные клетки: проводят информацию из внутреннего синаптического слоя (ВСС) к наружному синаптическому слою (НСС), будучи частью эфферентного пути, благодаря которому мозг модулирует активность сетчатки.

ü  Амакриновые клетки: не имеют аксонов, получают сигналы от биполярных клеток и посылают сигнал дендритному дереву ганглиозных клеток. Потенциалы действия обнаруживают редко.

ü  Ганглиозные клетки: передают информацию в мозг, генерирую потенциалы действия. Аксоны ганглиозных клеток формируют зрительный нерв.

Ганглиозные клетки сетчатки генерируют потенциалы действия довольно постоянном ритме даже при отсутствии внешнего раздражения. Воздействие небольших световых пятен на ганглиозные клетки млекопитающих вызывает усиление импульсации покоя, либо снижает ее. Такой участок сетчатки, попадая в который стимул активирует клетку, называют рецептивным полем клетки [2, 3, 4, 7, 8] (рис. 2). Если частота импульсации при раздражении светом возрастает, то такого рода ответ называют «on»-реакцией. Если освещение снижает частоту импульсации, то такой ответ является «off»-реакцией. Рецептивные поля бывают двух типов: 1)небольшой круглый «on»-центр и окружающую его обширную «off»-периферию; 2) небольшой круглый «off»-центр и окружающую его обширную «on»-периферию. Для каждой клетки эффект освещения зависит от того места рецептивного поля, на которое падает свет. Два пятна, падающие на разные пункты «on»-области, вызывают более сильную «on»-реакцию, чем каждое пятно в отдельности, тогда как если одно пятно света падает на «on»-зону, а другое на «off»-зону, то два эффекта стремятся погасить друг друга, что приводит к очень слабой «on»- или «off»-реакции. У клетки с «on»-центром освещение всего центрального участка вызывает максимальную реакцию; пятно света, площадь которого меньше или больше «on»-центра, менее эффективно. Диффузное освещение всей сетчатки не вызывает в ганглиозной клетке даже приблизительно того эффекта, какой вызывает маленькое круглое световое пятно определенной величины, закрывающее точно центр рецептивного поля. Для этих клеток главным является контраст освещения между одним участком сетчатки и окружающими зонами.

Рис. 2. Концентрические рецептивные поля характерны для ганглиозных клеток сетчатки и клеток коленчатого тела

На верхней осциллограмме показана сильная импульсация клетки с «on»-центром при освещении центра поля; если свет падает на «off»-зону, то импульсация прекращается, до тех пор пока свет не выключат. Внизу показана реакция клетки с «off»-центром

Ганглиозные клетки с концентрическими рецептивными полями - наиболее представленный класс в сетчатке кошки. Она характеризуется значительной неравномерностью густоты ганглиозных клеток. Наиболее плотно эти клетки расположены в центральной области сетчатки (area centralis). По мере удаления от центра сетчатки к периферии плотность расположения ганглиозных клеток падает. В сетчатки кошки описаны два типа ганглиозных клеток, имеющих концентрические рецептивные поля. Они были обозначены как X- и Y-типы и разделены по такому признаку, как нелинейность или линейность суммации возбуждения и торможения в рецептивном поле. Для X-клеток возможно подобрать такое положение стимула в рецептивном поле, когда освещение одной половины поля и одновременное затемнение другой половины полностью компенсируют друг друга и реакция на стимул отсутствует. Это означает, что возможна линейная суммация возбуждения и торможения в рецептивном поле. У Y-клеток ни при каком положении светлых и темных элементов стимула реакция не исчезает, т.е. суммация возбуждения и торможения нелинейна. Также Ганглиозные клетки сетчатки кошки могут быть разделены на две группы по такому существенному признаку, как характер их реакции на раздражение: клетки одного типа (X-клетки) реагируют тонической реакцией, т.е. увеличивают частоту импульсной активности в течение всего времени действия стимула, а клетки другого типа (Y-клетки) реагируют фазической реакцией - вспышкой импульсной активности только в начале действия стимула. Оба типа включают как on -, так и off-клетки. X-клетки имеют небольшие рецептивные поля (диаметр центра обычно не более 1°) с хорошо очерченной тормозной периферией. Из-за эффективной тормозной периферии рецептивного поля они плохо отвечают на диффузные световые раздражения. Эти клетки имеют относительно тонкие аксоны с небольшими скоростями проведения - 15-20 м/с. Y-клетки имеют значительно большие рецептивные поля (диаметр центра 2-3°) и лучше отвечают на диффузные световые раздражения. Они имеют аксоны большего диаметра с максимальными скоростями проведения - 35-50 м/с. X-клетки сосредоточены в основном в центральной области сетчатки, а к периферии их количество резко убывает. Y-клетки относительно равномерно распределены по всей сетчатке, так что на периферии они доминируют.

Латеральное коленчатое тело

По зрительному нерву, сформированному аксонами ганглиозных клеток, сигнал передается через хиазму и зрительный тракт на клетки латеральных (наружных) коленчатых тел (ЛКТ). Клетки ЛКТ обладают многими свойствами ганглиозных клеток сетчатки. Организация рецептивных полей отдельных нейронов ЛКТ очень близка к таковой у ганглиозных клеток. Однако между ними существуют различия, из которых наиболее существенным является более выраженная способность периферии рецептивного поля клеток коленчатого тела подавлять эффект центра. Это говорит о большей специализации клеток ЛКТ в отношении реакции именно на пространственный перепад освещения сетчатки, а не само освещение. Функция ЛКТ заключается в усилении различия между реакциями на небольшое центрированное световое пятно и на диффузное освещение.

Организация ЛКТ изучена достаточно детально только у некоторых представителей млекопитающих, которые являются обычными объектами нейрофизиологических исследований. Наиболее подробно у кошек и приматов. Менее обширные сведения имеются относительно крыс и некоторых других животных.

Связи между сетчаткой и ЛКТ кошки организованы таким образом, что имеется значительная неравномерность проекции поля зрения на ЛКТ. Проекция участка поля зрения, ближайшего к центру, занимает в ЛКТ относительно больший объём, чем проекция периферии поля зрения. Функциональные характеристики и структура рецептивных полей у нейронов ЛКТ кошки различны для разных слоев - крупноклеточных А и А1 и мелкоклеточных С и С1. В слоях А и А1 преобладают нейроны с концентрическими рецептивными полями. Нейроны расположенные в слое А активируются волокнами от контралатерального глаза, в слое А1 от ипсилатерального. Как и ганглиозные клетки сетчатки, нейроны слоёв А и А1 ЛКТ кошки по комплексу признаков и по свойствам могут быть разделены на два типа - X и Y. Нейроны X-типа имеют тонкие медленнопроводящие аксоны и реагируют на раздражение центра их рецептивного поля тонической реакцией. Нейроны Y-типа имеют толстые быстропроводящие аксоны и реагируют на раздражение относительно короткой фазической реакцией. Также X- и Y-нейроны чувствительны к разным скоростям движения стимулов через рецептивное поле. Реагирующие короткой вспышкой Y-нейроны чувствительны к стимулам, движущимся с более высокими скоростями, а тонические X-нейроны чувствительны к более медленнодвижущимся стимулам [16]. X-нейроны лучше реагируют на изображения с более дробным рисунком (с высокими пространственными частотами), чем Y-нейроны. Кроме того, у X-нейронов ЛКТ реакция зависит от освещенности в значительно более широком диапазоне, что позволяет предполагать участие этого типа нейронов в передаче информации не только о локальных контрастах, но и об освещенности [12].

Распределение нейронов ЛКТ на группы, в которых разные скорости аксонного проведения коррелируют с разной организацией рецептивных полей, также может наблюдаться у животных со слабо специализированным мозгом. У крысы, в частности, в ЛКТ выделяется группа нейронов, по свойствам сходная с Y-типом, которая активируется наиболее быстропроводящими ретинальными волокнами, а нейроны с другими свойствами активируются волокнами с более низкими скоростями проведения.

Первичная зрительная кора

Механизм обработки зрительной информации на кортикальном уровне представляют максимальный интерес и являются предметом самого тщательного изучения. В коре мозга имеется несколько областей, заведомо различающихся по ряду свойств, которые непосредственно участвуют в процессах зрительного анализа. К их числу относятся, прежде всего первичная зрительная область (VI), вторичная (VII или поле 18) и третичная (VIII или поле 19). В то время как клетки ЛКТ сохраняют многие свойства ганглиозных клеток сетчатки, нейроны первичной зрительной коры клетки демонстрируют совершенно иные функциональные свойства. Хьюбел и Визел впервые выявили распределение возбудительных и тормозных эффектов в рецептивных полях клеток первичной зрительной (стриарной) коры (поле 17 по Бродману), получив за эту работу Нобелевскую премию. Рецептивные поля корковых клеток имеют более или менее прямоугольную форму, и возбудительные зоны в них разделены прямыми линиями (Рис. 3 В).

Рис. 3 Обычная архитектура РП «простых» клеток стриарной коры «+» ON-ответ, «-» - OFF-ответ

Самое простое из рецептивных полей состоит из области, в которой свет вызывает возбуждение, и смежной с ней области, где свет вызывает торможение. В некоторых из них возбудительная зона принимает форму удлиненной полосы, по обеим сторонам которой лежат тормозные зоны и наоборот (Рис.3 А и Б). Такие клетки лучше всего стимулируются освещенной полосой на темном фоне. Чтобы вызвать возбуждение клетки, такая полоса должна иметь определенную ориентацию (наклон) и положение внутри зрительного периметра

Хьюбел и Визел различают в зрительной коре два типа клеток. Они назвали первый тип «простыми», или клетками «с простым рецептивным полем», а второй - «сложными клетками». Узнать «простую» клетку можно с помощью сканирования рецептивного поля маленьким световым пятном. Но у всех действенных стимулов всех корковых нейронов имеются сходства выражающиеся в том, что такие стимулы обладают прямолинейными границами между освещенными и затемненными участками. Корковые клетки оптимально реагируют на границу с прямолинейным контрастом. «Простые» можно назвать иначе клетками «с фиксированным полем», а «сложные» - «детекторами угла» или «наклона» [9].

На популяционном уровне первичная зрительная кора млекопитающих имеет крайне специфическую модульную организацию, которая может быть обнаружена с помощью разных методических подходов.

§ 1.3 Функциональная организация первичной зрительной коры

Уже с помощью микроэлектродного метода удалось показать, что в каждом небольшом участке зрительной коры кошки и обезьян, перпендикулярно ее поверхности, сгруппированы нейроны с одинаковыми функциональными свойствами. Они образуют так называемую колонку нейронов. Колончатая функциональная организация коры проявляется в том, что нейроны коры функциональные характеристики, отличающие их от нейронов соседних колонок. В 1962 г. Хьюбел и Визел показали, что в зрительной коре кошки [17] (а позднее и в коре головного мозга обезьяны[18]) нейроны, расположенные в одной корковой колонке, избирательны к одной и той же ориентации стимулов; к другим ориентациям стимулов избирательны нейроны других, соседних колонок. Такая упорядоченность хорошо выявляется при погружении регистрирующего микроэлектрода через всю толщину коры от поверхности до глубоких слоев.

Если направление погружения электрода перпендикулярно к поверхности коры и совпадает с направлением колонки, то все нейроны, активность которых регистрируется по ходу погружения электрода, имеют одинаковую ориентационную избирательность. Если электрод погружать в кору наклонно, то по мере погружения несколько раз происходит смена ориентации рецептивных полей, когда электрод переходит из одной колонки в другую. В 1986 году Amiram Grinvald с группой ученых методом оптического картирования по внутреннему сигналу уточнили особенности колончатой организацию первичной зрительной коры кошки [21]. Так ими было показано, что ориентационные колонки, кодирующие все возможные ориентации зрительного стимула, образуют локальную корковую структуру подобную детской вертушке («pinweel»). По всей видимости, эта структура соответствует функциональному модулю - гиперколонке. Этот термин ввели в обиход еще Хьюбель и Визел, и он обозначает функциональную единицу коры, которая в определенной точке зрительного пространства оказывается задействована в анализе информации об ориентации границ объектов. Интересно, что в центре гиперколонки не обнаруживается сигнала, коррелирующего с ориентацией зрительного стимула.

Нейроны в вышеописанных колонках имеют свою специфичность и называются нейрон - детекторами.

Нейрон - детектор - высокоспециализированная нервная клетка, способная избирательно реагировать на тот или иной признак сенсорного сигнала. Это прежде всего ориентационно- и дирекционально-селективные клетки. Первые генерируют максимальный по частоте и числу импульсов разряд при определенном угле поворота одиночной световой (или темновой) полоски или решетки из чередующихся полос в пределах своего рецептивного поля, т. е. определенной пространственной области фоторецепторов сетчатки. При других ориентациях эти клетки отвечают на стимул плохо или не отвечают совсем. По кривой зависимости ответа от ориентации стимула оценивают остроту настройки и предпочитаемую нейроном ориентацию. Дирекционально-селективные нейроны избирательно реагируют на движение стимула через их рецептивное поле по одному из возможных направлений. В большой части случаев нейроны зрительной коры обладают одновременно и ориентационной, и дирекциональной селективностью.

Исследования классическими методами предполагали наличие в поле 17 большего числа нейронов, детектирующих вертикаль и горизонталь по сравнению с детекторами диагональных ориентаций. Оптическое картирование не выявило достоверных различий в площади активированных ориентационных колонок при действии решеток вертикальной и горизонтальной ориентации по сравнению с диагонально ориентированными решетками [13].

Такого рода сложная функциональная организация обнаруживается у животных с доминирующим зрительным анализатором. В зрительной коре крыс, у которых преобладает обоняния, также имеются нейроны чувствительные ориентации зрительного стимула, однако функциональная организация первичной зрительной коры отличается по структуре от коры хищников и приматов. Чувствительные к ориентации стимула нейроны у крыс не собраны в колонки, а перемешаны. Поэтому четкой модульной организации обнаружить не удается [20]. Тем не менее, при стимуляции более простыми стимулами - движущимися полосками или локально вспыхивающими световыми точками - возможно выявить четкую ретинотопическую организацию [15]. Под ретинотопической понимается такая организация зрительной области, при которой помещенный в определенное место пространства зрительный стимул активирует строго локализованный участок коры.

Исследования свойств нейронов проводят разными способами, каждый из которых имеет определенные достоинства и недостатки. Остановимся подробнее на исследовательских технологиях, которые определяют современное состояние нейробиологии.

§ 1.4 Методы исследования функции нервной системы

Достаточно грубо методы нейрофизиологических экспериментов можно разделить на инвазивные и неинвазивные. Отдельного внимания заслуживают частично инвазивные методы, которые позволяют после некоторого хирургического вмешательства наблюдать за активностью больших популяций нервных клеток.

Инвазивные методы исследования нервной системы.

Удаление частей мозга.

В таких экспериментах с помощью специальных хирургических техник у исследуемого животного удаляют части мозга. Как оказалось, даже удаление обширных зрительных областей не делает животное абсолютно слепым. Клювер считал, что остаточное зрение, сохраняющееся после обширной экстирпарации зрительной коры, - это не более чем различение светового потока без истинного предметного зрения. Если животное способно было сделать выбор между двумя предметами, то это объясняли различием градиента светового потока. Эта области исследований до сих пор порождает много споров, особенно когда речь идет о сложных экспериментах на кошках и обезьянах. У которых при удалении поля 17 возникали серьезные нарушения, и только лишь некоторые из них частично восстанавливались. Исследователи осторожны в выводах. Нет полной уверенности в том, что в ходе экспериментов удаленной оказывается вся стриарная кора. Выдвигаются предположения, что сохраняется различения положения зрительных объектов в пространстве, но не обязательно предметное зрение. Довольно противоречивые данные были получены на тупайе. У этого вида, который, как полагают, очень близок к древним приматам, стриарная кора занимает значительную часть поверхности больших полушарий мозга и лежит на поверхности. Она не скрыта в бороздах и ее можно удалить, лишь минимально повредив окружающие области коры. После такой операции кажется, что зрительная функция экспериментального животного нисколько не пострадала [14]. Животное не только могло решать поставленные перед ней исследователями задачи, но и бегало, не натыкаясь на предметы, прыгало и прекрасно ориентировалось в новой для него обстановке. Видимо у этого вида стриарная кора не является необходимой для простого предметного зрения.

Регистрация клеточной активности у анестезированных животных и на срезах мозга.

В таких экспериментах в зрительную кору вводят специальным образом подготовленный микроэлектрод для регистрации внеклеточной электрической активности отдельных нейронов. Активность кортикальных клеток наблюдалась, когда сетчатка получала зрительные стимулы. После завершения исследования одной клетки, микроэлектрод перемещали к другой клетке и процедуру повторяли. В конце животное усыпляли и делали гистологические препараты коры, след от микроэлектрода оставался заметен, и можно было идентифицировать клетки, от которых проводилось отведение.

Микроэлектроды имеют свои недостатки. Вряд ли можно считать одиночный нейрон представителем многих миллионов элементов, совокупно участвующих даже в самых простых событиях в центральной нервной системе.

Неинвазивные методы исследования нервной системы

Ядерно-магнитно-резонансная (ЯМР) топография.

Годом открытия принципов магнитно-резонансной томографии принято считать 1973 <#"587981.files/image004.gif">

Осветитель связан световодом с источником света, снабжённым набором сменных светофильтров с заданными характеристиками, что позволяет освещать кору мозга светом с заданной длиной волны. Источник света подключён к сети через блок постоянного тока. Также в установку входят блок управления камерой, компьютер для накопления данных, компьютер и монитор для зрительной стимуляции.

§ 2.2 Выборка животных

Крысы

Эксперименты по оптическому картированию проводили на 4-х капюшонных крысах возрастом 3-6 месяцев. Состояние мозга в этот период характеризуется полным созреванием стриарной коры и достаточным зрительным опытом животных.

Кошки

§ 2.3 Анестезия

Крысы

Анестезию инициировали внутрибрюшинной инъекцией уретана (1,2 г/кг). Для снятия болевых ощущений вводили анальгетик общего действия бутомидор (0,05 мл/кг подкожно; действующее вещество тартрата бутарфанола). Размер зрачка стабилизировали атропином. Для предотвращения высыхания роговицы глаза периодически промывали ее физраствором. Перед помещением в стереотаксическую установку ушные проходы животного обрабатывали гелем, содержащим 2,5%-ный лидокаина гидрохлорид. Дорзальная поверхность головы, область около ушей и глаз дополнительно обезболивались подкожной инъекцией 2%-ого раствора лидокаина. Стабильность физиологического состояния животного контролировалась по параметрам ЭКГ (частота, RR-интервал, форма пика; дифференциальный усилитель MCP Alpha Omega) и дыхания (частота).

Кошки

Анестезию инициировали внутримышечной инъекцией гидрохлорида кетамина (15 мг/кг) в комбинации с ветранквилом (0,5 мг/кг; действующее вещество ацепромазин). Погруженное в 30-40-минутный сон животное помещали на операционный стол, в вену передней лапы вводили катетер, подключённый к перфузионному шприцевому насосу. Через катетер в течение всего эксперимента непрерывно внутривенно инфузировали раствор Рингера с 1,25% раствором глюкозы и пропофолом со скоростью 1-2 мг/кг/час.

Животное интубировали и переводили на искусственное дыхание. Для подавления спонтанного дыхания вводили ардуан (0.1 мг/кг). Рабочую поверхность интубационной трубки обрабатывали спреем, содержащим 10% лидокаина гидрохлорида. Для подавления слюноотделения внутримышечно вводили атропин (0.04 мг/кг, 0.1% раствор).

Перед помещением в стериотаксическую установку ушные проходы животного обрабатывали гелем, содержащим 2,5%-ный лидокаина гидрохрорид. Дорзальная поверхность головы, область около ушей и глаз дополнительно обезболивались подкожной инъекцией 2%-ого раствора лидокаина.

Для дополнительной релаксации животного в продолжение эксперимента каждые два часа внутривенно инъецировали ардуан. При необходимости животному дополнительно внутримышечно вкалывали бутомидор.

Физиологическое состояние контролировалось по показаниям ЭКГ (Дифференциальный усилитель MCP Alpha Omega), глубину сна контролировали по содержанию CO2 в выдыхаемом воздухе (поддерживали на постоянном уровне в диапазоне 3.7-4.2%) по показаниям газоанализатора.

Роговицу глаз предохраняли от высыхания жёсткими контактными линзами. Размер зрачка стабилизировали атропином (1%), мигательную перепонку глаза удаляли препаратом ирифрин (10% раствор; действующее вещество фенилэфрин), а веки дополнительно раскрывали.

В течение всего эксперимента животное находилось на термостатическом коврике с температурой 38,5°С.

Протоколы экспериментов одобрены Комиссией по этике Института ВНД и НФ РАН, эксперименты выполнялись в соответствии с требованиями Директивы Совета Европейского Сообщества (86/609/EEC) об использовании животных для экспериментальных исследований.

§ 2.4 Хирургическая операция

Для оптического доступа к коре мозга крыс и кошек предварительно фиксировали в стереотаксической установке. Кожные покровы и мышечную ткань удаляли с теменно-затылочной области черепа. Локальное костное кровотечение останавливали воском или прижиганием. Трехмесячным крысам трепанация не требовалась, так как регистрация была возможна через прозрачную кость черепа.

Шестимесячным животным проводили по обстоятельствам краниотомию или утончение кости черепа при помощи аппарата Dremel (MultiPro model 395, Dremel Europe, Нидерланды-Мексика). Трепанационное отверстие у крыс имело диаметр 5мм, у кошек - диаметр 20мм и располагалось своим центром над полем 17. У взрослых животных дополнительно удалялась твердая оболочка мозга.

Фото 1. Экспериментальные животные в опыте по оптическому картированию: А) крысы; Б) кошки. Трепанационные отверстия закрыты агарозой и покровным стеклом.

Трепанационное отверстие заливали агарозой и накрывали покровным стеклом (Фото 1). Для предотвращения высыхания агарозу покрывали защитным слоем. Агароза создаёт идеальную оптическую среду и одновременно пространственно стабилизирует и изолирует от внешних воздействий мозг животного, искусственно «имитируя» кость черепа.

§ 2.5 Снятие зеленого образа

Камера фиксировалась над трепанационным отверстием, которое освещалось зеленым светом с длиной волны 546 нм, что позволяло получить так называемую «сосудистую» карту мозга, т.е. фактически фотографию поверхности коры с расположенными над ней кровеносными сосудами. Фиксация расположения поверхностных сосудов необходима при обработке результатов эксперимента. Полученные таким образом карты позволяют выбрать область интереса для регистрации, свободную от крупных сосудов и видимых артефактов, и сфокусировать камеру под поверхность сосудов на глубину регистрации (800-1000 мкм).

§ 2.6 Параметры освещения

Для регистрации данных используется красный свет с длиной волны 630нм, оптимальная длина волны для различения дезоксигемоглобина и оксигемоглобина. Интенсивность освещения выставляется по верхней границе диапазона чувствительности камеры.

§ 2.7 Параметры стимуляции

Крысы

Проводилась непрерывная скотопическая монокулярная стимуляция одиночной полоской, движущейся сверху-вниз или снизу-вверх с периодом 20 секунд (программа «ContStim»). Такой стимул при последовательном смещении по экрану последовательно активирует нейронные популяции первичной зрительной коры мозга и тем самым выявляет её ретинотопическую организацию. Монитор выставляли латерально по отношению к крысе на расстоянии 30 см.

Также в исследовании по изучению влияния характеристик стимула на силу ответа использовались три градации контраста стимула по отношению к фону: 25, 50 и 100% от максимального значения.

Кошки

Проводилась непрерывная скотопическая монокулярная стимуляция ориентационной решеткой (ориентация менялась в диапазоне 0-360°) с периодом вращения 60 секунд и пространственными частотами 0.2, 0.8 цикл/градус. Использовались 8 градации контраста стимула по отношению к фону: 0, 0.8, 1.4, 6.25, 12.5, 25, 50, 100% от максимального значения.

Стимульный монитор располагался на расстоянии 57 см от глаза животного. Монитор выставляли по расположению проекции центра поля зрения с помощью офтальмоскопии глазного дна. Перед глазом животного помещали корригирующую очковую линзу.

Пространственные решетки, помимо ориентации составляющих их полос, могут быть охарактеризованы пространственной частотой - количеством черно-белых периодов на градус поля зрения. Использование стимулов в виде решёток интересно не только как модель для исследования взаимодействия нескольких элементов стимула, но и как способ изучения чувствительности и избирательности нейронов к пространственным частотам элементов изображения. Такие решетки оптимально активируют поля 17 и 18 зрительной коры кошки. Частота стимуляции подобрана так, что она отличается от частот физиологических циклов (дыхательного, сердечного и вазомоторного)

§ 2.8 Накопление и обработка данных

Сбор данных осуществлялся высокочувствительной CCD-камерой, связанной с компьютером для обработки информации. Пространственное разрешение камеры ограничено особенностями строения кровеносной системы млекопитающих и составляет 50 мкм, что соответствует расстоянию между мельчайшими капиллярами. Временное разрешение в данной модификации метода не имеет критического значения, потому что регистрируется внутренний сигнал, относящийся к медленным, так как имеет секундную динамику развития; максимальное же возможное разрешение ограничивается параметрами камеры и в настоящем случае составляет 0.3 мс (максимальная частота оцифровки 3 кГц).

По результатам регистрации строятся функциональные карты. Функциональная карта - это «мгновенный» снимок, или фрейм, коры, записанный с частотой 512 Гц (длительность фрейма 2 мс) и составленный из 512x512 пикселей. «Сырая» функциональная карта визуализирует распределение интенсивностей отражённого корой света в каждом пикселе изображения - в каждой «точке» коры (в каждом пикселе 21 мкм² площади коры). Усреднённая функциональная карта в процессе обработки данных может быть представлена в виде фазовой или амплитудной карты. В данном исследовании функциональные карты построены в результате накопления от 15 до 60 предъявлений каждого стимула.

Накопленные функциональные карты обрабатывались программой VK Imaging, разработанной Валерием Калацким (Хьюстон, США). В основе анализа данных лежит определение для каждой точки изображения коры фазы цикла стимуляции, которая вызывает максимальный отклик. В случае ретинотопических экспериментов определенная фаза цикла стимуляции соответствует положению стимула в зрительном поле животного. Использование анализа Фурье для обработки экспериментальных данных позволяет надежно выделять картирующий сигнал из совокупности периодических сигналов, вносящих вклад в регистрируемую от определенного объема ткани мозга интенсивность света. Так получали амплитудные функциональные карты коры мозга (Рис. 7), где темно-светлое в противофазе пятно это популяционный ответ нейронов зрительной коры на предъявление стимула. В свою очередь, для получения фазовых функциональных карт необходима дальнейшая обработка: в каждом пикселе рассматривается фаза синусоиды при условии совпадения частоты сигнала с частотой стимуляции; далее фаза синусоиды кодируется определённым цветом, который соответствует сдвигу по фазе от нулевого значения. Нулевое значение, т. е. начало синусоидальной кривой на отметке стимуляции, соответствует положению полосы стимула внизу монитора (в случае эксперимента на крысе, Рис. 7) и вертикальной ориентации решетки (в случае эксперимента на кошке, Рис. 17). Кроме того, используя разные гармоники спектра Фурье, можно было построить также функциональные карты чувствительности коры к направлению движения. Полученные в результате фазовые карты в случае экспериментов на крысах отражали вовлеченность определенных участков коры в анализ информации о пространственном расположении зрительного стимула (ретинотопическая организация зрительной коры). В экспериментах на кошках на фазовых картах четко выявляется рисунок активации ориентационных (в другом случае, дирекциональных) колонок, поскольку в данном случае фаза цикла стимуляции соответствует изменениям ориентации зрительного стимула.

Усреднённые функциональные карты использовали для дальнейшего анализа с применением частотных фильтров, в ходе которого изучали как сохранность пространственной структуры карты во времени, так и усредненные амплитудно-частотные характеристики. Дополнительную обработку карт проводили с помощью программ, созданных в среде программирования Matlab.

§ 2.9 Результаты экспериментов и их обсуждение

Перед началом регистрации фокусировали камеру на освещённой зелёным светом поверхности кости черепа (или поверхности коры мозга) - это точка отсчета, соответствующая 0 мкм, на рис.5 видно расположение сосудов непосредственно под костью и на некоторой глубине. Использование именно зелёного освещения позволяет чётко выделить кровеносные сосуды всех размеров, сделать снимок их расположения (создать сосудистую карту, зелёный образ) и сфокусироваться на глубину расположения нейронов, участвующих в обработке поступающей с периферии зрительной информации.

Рис. 5. «Зелёный образ»

Рис. 6. Глубина 1000мкм

На следующем шаге опускали фокус камеры с шагом в 200 мкм до глубины примерно 800-1000 мкм от поверхности коры (плоскости расположения сосудов) и таким образом уменьшали вклад в итоговое изображение коры артефактов, связанных с кровообращением и сердцебиением (Рис. 6). При регистрации сигнала использовали красный свет. На полученных амплитудных функциональных картах виден участок, содержащий популяционный ответ на стимул (тёмное и светлое - в противофазе - пятно) (Рис. 7, правая половина).

Рис.7. Амплитудная карта

Рис. 8. Фазовая карта

На фазовой карте (Рис. 7), однако, сигнал может быть неразличим, так как карта является сильно зашумлённой, а интенсивность ответа очень мала по сравнению с шумом. В такой ситуации карты обрабатывали частотными фильтрами.

Рис.9 Функциональная карта после частотной фильтрации

Рис.10 Сосудистая карта с областью а

В итоге функциональная фазовая карта приобретает следующий вид (Рис. 9) с хорошо различимой областью, содержащей постепенное изменение цвета, каждая градация которого соответствует определённому положению линии на мониторе - это область нашего интереса, которую выделяли и анализировали далее. При нанесении этой области на сосудистую карту (Рис. 10), дополнительно удостоверялись в отсутствии артефактов, которые могли быть внесены проходящими в данном месте крупными сосудами.

Этап накопления данных для кошек и крыс практически не отличался. В связи с этим описание накопления карт проведено на примере крыс.

Сравнение индивидуальных функциональных карт (Рис. 11) позволяет выявить сходства и различия в топографии сигнала. Сходство выражается в наличие и принципиальной структуре ответа при идентичной стимуляции и может быть описано количественно (размер области, ширина полос и пр.).

Рис. 11 Сравнение индивидуальных карт, полученных оптическим картированием

Разница, прежде всего, обусловлена различиями в индивидуальном зрительном опыте животных, а, следовательно, и в строении индивидуального мозга, особенно его коры - созревание и установление связей между зрительными нейронами происходит за короткий промежуток времени у уже зрячего животного. Отчасти это уже не позволяет нам добиться полной идентичности условий регистрации сигнала на разных особях, как-то: сфокусироваться не просто на одинаковой глубине от поверхности коры, но в одинаковых слоях клеток мозга. Словом, морфологические и анатомические особенности строения коры мозга разных животных обуславливают разницу в представлении функциональных ответов их клеток (что дополняется случайными и систематическими ошибками измерения, вносимыми, например, экспериментаторами или приборами).

В тоже время, для одного животного можно констатировать стабильность расположения и структуры метаболической нейронной активности (Рис. 12). При регистрации в разные промежутки времени сигнал обнаруживается в одном и том же месте, периодичность изменения цвета совпадает. Данное сходство можно оценить количественно - используя коэффициент корреляции (r). При предъявлении одного и того же стимула через 15 минут структура ответа совпадает на 88%, через 45 минут или час совпадение может составлять до 90%. Таким образом, обнаруживается высокая степень сходства между картами, полученными для идентичных условий стимуляции, но в разные моменты времени в ходе эксперимента. Было установлено, что коэффициент корреляции может служить действенным инструментом для определения стабильности регистраций оптического сигнала.

Следует отметить, что часто можно наблюдать колебания коэффициента корреляции, что может быть связано с изменениями функционального состояния коры.

Рис. 12. Сравнение индивидуальных карт, полученных оптическим картированием

Стабильность регистрации позволила провести эксперименты, направленные на выявление закономерностей в изменении силы реакции первичной зрительной коры крысы в ответ на изменения контраста зрительного стимула (Рис. 12). Так, при уменьшении контрастности в 2 раза от максимальной фиксировали некоторое ухудшение силы ответа (r =0,83). При последующем кратном изменении контраста сигнал становился практически неразличим среди шума, корреляция с ответом при максимальных значениях контрастности составляла 50%. В то же время, повторное использование первоначальных значений стимула (через час) приводит к получению хорошо структурированного ответа с r = 0,9. Наличие ответа вместе со стабильным состоянием животного говорит о восприимчивости зрительной системы данного вида грызунов к изменению контраста зрительного стимула.

Рис.13 Фунциональная карта с ответом на ориентационную решетку

В некоторых случаях при недостаточной или неявной активации зрительной коры в ответ на стимул-полоску изменяли протокол стимуляции и предъявляли вращающийся ориентационный стимул, который по нашей гипотезе должен был сильно активировать зрительную кору. В итоге установили границы зрительной области (Рис.13). К цветовой градации в данном случае следует относиться с осторожностью - в данном случае имеет место запрограммированный способ представления данных, при котором происходит выделение областей, имеющих одинаковый сдвиг по фазе, но это не однозначно связано с топическим принципом организации коры, который на предыдущих слайдах кодировался спектральным градиентом. Однако наличие активации при использовании данного стимула является закономерным, что, в частности, подтверждается литературными данными - до 80% клеток зрительной коры крысы чувствительны к ориентации стимула. При этом показано, что чувствительные к определённой ориентации клетки в коре крысы размещены хаотично (перемешаны) [20], а не собраны в вертикальные колонки, как, например, у хищных млекопитающих, когда каждая клетка колонки преимущественно отвечает на одну и ту же ориентацию линии, а клетки соседней колонки могут реагировать уже на совершенно другую ориентацию.

Эксперименты по исследованию влияния контраста зрительного стимула на силу реакции нейронных популяций показали перспективность использования оптического картирования по внутреннему сигналу для объективного тестирования работы зрительной коры. Для более детального исследования была проведена серия экспериментов на 7 кошках, в которой проводили анализ фазовых и амплитудных функциональных карт ориентационной и дирекциональной чувствительности.

На рис. 14 представлены кривые, отражающие закономерности изменения силы отклика в зависимости от контраста зрительного стимула. Данные приведены отдельно для каждого животного. Значения амплитуды оптического сигнала усредняли для двух областей интереса, которые были расположены в полушариях мозга, ипси- либо контралатеральных по отношению к стимулируемому глазу.

Рис. 14. Индивидуальные графики зависимости силы оптического сигнала от контраста зрительного стимула, представляющего собой решетку с пространственной частотой 0.2 цикл/градус. Кривые, обозначенные кружками, соответствуют данным по амплитуде ориентационных карт, а треугольниками - данным, отражающим чувствительность к направлению движения зрительного стимула. Измерения в каждом эксперименте проводили для двух областей интереса: ипси- и контралатеральной по отношению к стимулируемому глазу

Несмотря на индивидуальные различия во всех экспериментах, четко прослеживается зависимость силы оптического ответа от контраста зрительного стимула.

Рис. 15 Нормированные усредненные кривые зависимости силы оптического сигнала от уровня контраста зрительного стимула. Данные 7 экспериментов. Обозначения см. рис. 14. Графическое отображение величины ошибки представляет собой стандартное отклонение

Так, для крайних значений контраста (0.8 и 100%) наблюдается в среднем двукратное снижение амплитуды оптического отклика. Для построения усредненных графиков по всем экспериментам данные нормировали относительно значения амплитуды, вычисленного при усреднении функциональной карты, которая была получена в ответ на предъявление стимула с уровнем контраста 100% в контралатеральном по отношению к стимулируемому глазу полушарии. Фоновое значение не превышает значения 0.2. Усредненные данные приведены на рисунке 15.

Таким образом, подтверждаются наблюдения, произведенные на отдельных животных: четко прослеживается закономерность изменения силы оптического сигнала в зависимости от контраста зрительного стимула.

Проведя серию экспериментов с изменением пространственных частот, мы выявили четкую границу в разделении активации зрительных полей. Так, при значении 0.2 цикл/градус одинаково активируется 18-ое и 17-ое поля. Пространственная частота 0.8 цикл/градус позволяет активировать 17-ое поле (Рис. 16) и практически не вызывает оптического отклика поля 18.

Рис. 16. Амплитудные карты с активированными зрительными полями, а) 17-ым и 18-ым, б) 17-ым

Такое различие в ответе на стимулы разной пространственной частоты связано с особенностями строения сетчатки и организацией наружного коленчатого тела. Известно два пути обработки зрительной информации: X- и Y-пути. Можно заметить, что более быстро проводящие Y-пути приходят в стриарную кору, т.е. место, где идет первичная обработка информации, которая нужна для определения границ объектов.

Рис. 17 Фазовая карта с популяционным ответом на ориентационную решетку слева, и справа увеличенный фрагмент, показывающий гиперколонку

Обработка карт программой Калацкого позволяет еще раз убедиться и увидеть функциональную единицу первичной зрительной коры - колонку, а также структуру гиперколонки. На рисунке 17 видны колонки, где каждая имеет цвет, соответствующий ориентации решётки (синий цвет означает начало цикла стимуляции, когда на экране вертикаль, т.е. 0°), образующие гиперколонку с так называемым «pinweel».

Выводы

1.   Оптическое картирование по внутреннему сигналу может быть использовано для быстрой оценки функции зрительной коры разных видов животных.

2.       Уменьшение контраста зрительного стимула вызывает не только изменения в структуре функциональных карт, но и снижает уровень популяционного отклика в коре.

.        Изменение условий зрительной стимуляции позволяет выявить пороговые значения, запускающие нейронные реакции.

.        Стабильность функциональных карт первичной зрительной коры достаточна для проведения тестов с набором изменяющихся стимулов.

Заключение

В ходе экспериментов по оптическому картированию зрительной коры крыс и кошек было показано, что этот методический подход может быть крайне перспективен для использования в экспериментах, в которых необходимо быстро, объективно и эффективно оценить зрительную функцию экспериментального животного. Оптическое картирование по внутреннему сигналу можно использовать не только в фундаментальных исследованиях, но его применение может оказать значительный вклад в развитие прикладной медицинской науки. По данным Всемирной организации здравоохранения предполагается, что если не будут приняты срочные меры, то к 2020 году число незрячих людей в мире может удвоиться. Между тем, до 75 % всех случаев слепоты у взрослых людей можно предотвратить с помощью профилактики и лечения. В настоящее время для некоторых дегенеративных заболеваний сетчатки созданы экспериментальные модели на животных, на основе которых возможна разработка методов лечения поражений зрительной системы. При использовании данных моделей важную роль играет регулярное объективное тестирование зрительной функции: остроты зрения, контрастной чувствительности и динамических характеристик зрительного стимула.

В настоящее время для этой цели чаще всего применяют поведенческий и электрофизиологический методы тестирования зрительной функции. У них есть определенные достоинства и недостатки.

Мы предлагаем использовать метод оптического картирования по внутреннему сигналу, который может ускорить процесс отладки новых терапевтических подходов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.     Основы физиологии. Перев. с англ./Под редакцией П. Стёрки. М.: Мир, 1984. 556 с.

2.       Смит К., Биология сенсорных систем / Пер. с англ. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 583 с.

.        Кейдель В.Д. Физиология органов чувств. Часть I. М.: Медицина, 1975.

.        Супин А.Я. Нейрофизиология зрения млекопитающих. М.: Наука, 1981. 252 с.

.        Восприятие: механизмы и модели./ Под редакцией Н.Ю. Алексеенко. М.: Мир, 1974. 366 с.

.        Уолд Дж. Глаз и фотоаппарат. По: Восприятие: механизмы и модели./ Под редакцией Н. Ю. Алексеенко. М.: Мир, 1974. С. 124-141.

.        Хьюбел Д. Зрительная кора мозга. По: Восприятие: механизмы и модели./ Под редакцией Н. Ю. Алексеенко. М.: Мир, 1974. С. 167-184.

.        Хьюбел Д. Глаз, мозг и зрение. М.: Мир, 1990. 240 с.

.        Сомьен Дж. Кодирование сенсорной информации. М.: Мир, 1975. С. 321-350.

.        Шевелёв И.А. Функциональное картирование мозга. Успехи физиол. наук. 1987. 18(2). с. 16-36.

11.     Шевелёв И.А. Нейроны-детекторы зрительной коры. М.: Наука, 2010. 183 с.

12.     Дудкин К.Н., Глезер В.Д., Гаузельман В.Е. Типы рецептивных полей наружного коленчатого тела и их функциональная модель. - Нейрофизиология, 1975, т. 7, с. 27 -34.

.        Иванов Р.С., Бондарь И.В., Салтыков К.А., Шевелев И.А. Площадь зон оптической активации поля 17 коры мозга кошки при предъявлении решёток разной ориентации // Журнал высшей нервной деятельности имени И.П. Павлова, 2006, № 4, с. 516 -522.

14.     Snyder M., Diamond I. T., The organization and function of the visual cortex in the tree shrew, Brain, Behavior and Evolution, 1, 1968, p. 244 - 288.

.        Gias C., Hewson-Stoate N., Jones M., Johnston D., Mayhew J.E, Coffey P.J. Retinotopy within rat primary visual cortex using optical imaging // NeuroImage. 2005. Vol. 24. p. 200-206.

.        Dreher B., Sanderson K.J. Receptive field analysis: responses to moving visual contours by single lateral geniculate neurons in the cat. - J. Physiol., 1973, vol. 234, p. 95 -118.

.        Hubel D.H., Wiesel T.N. Receptive fields, binocular integration and functional architecture in the cat’s visual cortex. - J. Physiol., 1962, vol. 160, p. 106 - 154.

.        Hubel D.H., Wiesel T.N. Receptive fields and functional architecture of monkey striate cortex. - J. Physiol., 1986, vol. 195, p. 215 - 243.

.        Grinvald A., Shoham D., Shmuel A., Glaser D., Vanzetta I., Shtroyerman E., Slovin H., Sterkin A., Wijnbergen C., Arieli A. In-vivo optical imaging of cortical architecture and dynamics. The Grodetsky Center for Research of Higher Brain Functions.// Technical Report GC-AG/99-6. 2001.

.        Ohki K, Chung S, Ch'ng YH, Kara P, Reid RC. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature, 2005.

.        Grinvald A, Lieke E, Frostig RD, Gilbert CD, Wiesel TN. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature, 1986.

.        Hubel D.H. Evolution of ideas on the primary visual cortex, 1955-1978: a biased historical account //Nobel lecture, 8 December 1981/ From Nobel Lectures, Physiology or Medicine 1981-1990, Editor-in-Charge Tore Frängsmyr, Editor Jan Lindsten, World Scientific Publishing Co., Singapore, 1993.