Фармакологические свидетельства присутствия 5-НТ рецепторов в нервно-мышечном соединении брюхоногих моллюсков
Фармакологические
свидетельства присутствия 5-НТ рецепторов в нервно-мышечном соединении брюхоногих
моллюсков
Н.Л.
Кононенко, В.В. Жуков
Исследовано
влияние аппликации серотонина и его двух антагонистов (миансерина и
метерголина) на сокращения дорсальной продольной мышцы гастроподного моллюска
Lymnaea staganalis L., вызванные электрическим раздражением n. cervicalis
inferior. Установлено, что увеличение концентрации серотонина в физиологическом
растворе вызывало двоякое действие: в концентрации 2×10 -8 – 10 -6 М он усиливал мышечные сокращения, а в
концентрациях свыше 10 -5, напротив, ослаблял. Блокирующее действие
антагонистов серотонина на амплитуду вызванных сокращений возрастало с
увеличением их концентраций в исследованном диапазоне от 10 -5 – 10 -3 М (для
миансерина) и от 5×10 ‑8 –
10 -4 М (для метерголина). Предполагается, что 5-HT рецепторы, участвующие в
нервно-мышечной передаче в исследованном соединении, имеют иной
фармакологический профиль, чем 5-HТ рецепторы позвоночных животных.
Введение
Основной
объем сведений о механизмах нервно-мышечной передачи дают исследования синапсов
на мускулатуре позвоночных и членистоногих животных. Соответствующие
эксперименты, проведенные на брюхоногих моллюсках, сравнительно немногочисленны.
И это притом, что разнообразие как гистологии и свойств мышечных волокон, так и
их функциональных взаимоотношений с нейронами у брюхоногих может быть не
меньше, чем у животных других систематических групп. Так же, как и у
членистоногих, каждая мышечная клетка этих животных может быть иннервирована
функционально различными типами волокон – как возбуждающими (фазными или
тоническими), так и тормозными [1]. Сами мышечные волокна могут быть связаны
между собой электрически, что в большинстве случаев оставляет открытым вопрос о
числе и типе иннервирующих их аксонов, которые могут образовывать на миоцитах
многочисленные окончания [2]. Столь же разнообразной представляется химическая
природа медиаторов нервно-мышечной передачи у этих животных. Наиболее
распространенными типами нейротрансмиттеров являются соединения группы
моноаминов (ацетилхолин, серотонин, дофамин), а также аминокислоты (глутамин) и
нейропептиды (FMRF-амид) [3 – 6]. Поэтому любые исследования, дополняющие пока
еще сравнительно разрозненную картину сведений о нервно-мышечной передаче
брюхоногих моллюсков, важны для эволюционного анализа физиологических функций
животного организма.
В
качестве модели исследования было выбрано нервно-мышечное соединение n.
cervicalis inferior с продольной дорсальной мышцей Lymnaea stagnalis, которая
является одним из эффекторов оборонительного рефлекса [7]. Известно, что тела
управляющих этой мышцей мотонейронов обнаружены в большинстве ганглиев ЦНС
моллюска [8]. Эти нейроны принимают возбуждающие сигналы с механо- и
фоторецепторов кожной поверхности тела и направляют свои аксоны к указанной
мышце в составе n. cervicalis inferior и n. cervicalis superior [9; 10].
Сведения о структурной организации синапсов, присутствующих на миоцитах
продольной дорсальной мышцы Lymnaea stagnalis в литературе отсутствуют. Однако
предыдущими исследованиями было показано угнетающее действие двухвалентных
катионов на амплитуду вызванных мышечных сокращений, что может
свидетельствовать о химическом механизме нервно-мышечной передачи [11].
Одновременно было показано участие в этом процессе серотонинергических
механизмов и соответствующих рецепторов. Настоящая работа представляет собой
шаг в направлении детализации их фармакологических свойств этих механизмов.
Материалы и методы
Животные.
Опыты выполнены на взрослых особях Lymnaea stagnalis (высота раковины около 3
см), собранных в прудах Калининграда, которых содержали в лабораторных
условиях.
Препарат
состоял из ноги и мантии моллюска, рассеченной по средней линии. Центральный
конец нерва, n. cervicalis inferior (номенклатура по [12]), иннервирующего
дорсальную продольную мышцу (название мышцы дается по [13]), помещали во
всасывающий электрод.
Состав
физиологического раствора (мМ): NaCl – 40; KCl – 3; CaCl2 – 3; MgCl2 – 1.
Значение РН = 7,5 – 7,6 поддерживали карбонатным буфером (NaHCO3).
Исследуемые
вещества. В ходе экспериментов применяли серотонин (5-НТ), миансерин и
метерголин (Sigma Chemical Co). Маточные растворы веществ готовили на
дистиллированной воде (серотонин, миансерин) или на 0,1 Н растворе HCl
(метерголин). Рабочие растворы получали путем разведения маточных в
физиологическом.
Оборудование.
Датчик для регистрации сокращения мышцы был изготовлен из пары проволочных
тензосопротивлений, наклеенных на противоположные стороны полоски гибкой пленки
[14]. Сопротивление тензодатчика изменялось при деформации пленки, вызванной
натяжением лески, прикрепленной с помощью металлического крючка к исследуемой
мышце. Исходное натяжение лески устанавливали вручную винтом манипулятора. Тензосопротивления
включали в схему мостика Уитстона, с которого электрический сигнал подавали на
вход усилителя постоянного тока. Усиленный сигнал поступал на осциллограф С1-67
и чернильный автоматический потенциометр К-201 (Германия).
Стимуляцию
нерва осуществляли сериями электрических импульсов (длительностью 2 мс,
амплитудой около 5 В), которые подавали на хлорсеребряный электрод,
вмонтированный в трубочку всасывающего электрода. Второй хлорсеребряный
электрод помещали в физиологический раствор в экспериментальной камере.
Ход эксперимента
1.
Электрическая стимуляция препарата в физиологическом растворе.
2.
Замена физиологического раствора на растворы веществ и спустя 10 минут
электрическая стимуляция нерва. Перед каждым новым раствором с последовательно
увеличивающейся концентрацией вещества препарат промывали в физиологическом
растворе в течение 30 минут.
3.
Промывка препарата в физиологическом растворе в течение 30 минут и
электрическая стимуляция.
Статистическая
оценка полученных результатов проводилась по Т-критерию Уилкоксона [15].
Результаты
Аппликация
серотонина в концентрациях в диапазоне от 2×10‑8
М до 10-6 М усиливала мышечные сокращения, причем эффект наблюдался спустя 10
минут после добавления вещества в ванночку и мог сохраняться на протяжении
получаса после возврата к физиологическому раствору. Более высокие концентрации
серотонина (10-5 М и выше), напротив, снижали амплитуду мышечных сокращений.
Максимальный усиливающий эффект серотонина проявлялся при его концентрации в
ванночке около 10-7 М (рис. 1). Эта концентрация серотонина сама по себе
вызывала небольшое укорочение мышцы. Изменения амплитуды сокращений, которые
наблюдались в присутствии серотонина 10-8 и 10-6 М, статистически не
подтверждались.
Рис.
1. Концентрационная зависимость влияния серотонина на сокращения дорсальной
продольной мышцы Lymnaea stagnalis L., вызванные ритмической стимуляцией n.
cervicalis inferior:
ось
абсцисс – отрицательный десятичный логарифм концентрации серотонина в
нормальном физиологическом растворе; ось ординат – отношение амплитуды мышечных
сокращений в растворе серотонина к амплитуде мышечных сокращений в
физиологическом растворе; вертикальные линии – стандартное отклонение (n = 5)
Аппликация
миансерина снижала амплитуду вызванных сокращений. Статистически значимый
эффект миансерина проявлялся в концентрациях от 10-4 до 10-3 М (рис. 2а). Более
низкие концентрации миансерина (5×10-5
М и ниже) статистически выявляемого влияния на амплитуду мышечных сокращений не
оказывали. Эффект действия миансерина, в отличие от серотонина, проявлялся
непосредственно после его аппликации.
Аппликация
метерголина также снижала амплитуду вызванных мышечных сокращений. Однако
статистически значимый эффект метерголина проявлялся в концентрациях от 10-5 до
10-4 М (рис. 2б). Эффект действия метерголина проявлялся спустя 15 минут после
его аппликации.
а
б
Рис.
2. Концентрационные зависимости влияния миансерина (а) и метерголина (б) на
сокращения дорсальной продольной мышцы Lymnaea stagnalis L., вызванные ритмической
стимуляцией n. cervicalis inferior: оси абсцисс – отрицательный десятичный
логарифм концентраций исследованных препаратов в нормальном физиологическом
растворе; оси ординат – отношение амплитуды мышечных сокращений в
физиологическом растворе к амплитуде мышечных сокращений в метерголине или
миансерине; вертикальные линии – стандартное отклонение (n = 5)
Обсуждение
Усиливающее
действие серотонина (5-HT) на нервно-мышечную передачу было отмечено у многих
видов моллюсков [3 – 5]. Известно, что действие этого вещества проявляется
через большое количество типов и субтипов рецепторов. К настоящему времени у
позвоночных животных было клонировано семь различных 5-HT рецепторов: 5-HT1A,
5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1Da, 5-HT1Db, 5-HT2 и фармакологически не
охарактеризованный 5-HT рецептор человека [16]. Однако сведения о 5-HT
рецепторах в нервной системе беспозвоночных в большинстве случаев отрывочны и
не поддаются классификации, установленной для позвоночных животных.
Как
показали наши наблюдения, серотонин усиливает, а его антагонисты – миансерин и
метерголин – подавляют амплитуду вызванных сокращений дорсальной продольной
мышцы. Возможно, что механизм увеличения амплитуды вызванных мышечных
сокращений в присутствии серотонина может указывать на возможную роль
последнего как медиатора нервно-мышечной передачи. В этом случае взаимодействие
экзогенного серотонина с синаптическими 5-HT рецепторами мышечных клеток может
приводить к их деполяризации и повышению возбудимости. Частичное сокращение
исследуемой мышцы при добавлении серотонина в физиологический раствор,
вероятно, согласуется с таким предположением. Исчезновение усиливающего
действия экзогенного серотонина при повышении его концентрации до 10-6 М мы
склонны объяснять развивающейся десенситизацией 5-HT рецепторов. Угнетающее
действие антагонистов серотонина на мышечные сокращения также может быть
следствием их взаимодействия с синаптическими рецепторами. В наших опытах
метерголин и миансерин проявляли свое действие в значительно более высоких
концентрациях по сравнению с серотонином. В таких концентрациях эти вещества
могут блокировать одновременно 5-HT1A и 5-HT2 типы серотониновых рецепторов,
обнаруженные у L. stagnalis, фармакологический профиль которых в исследованных
гигантских церебральных клетках совпадает с профилем этих рецепторов у
позвоночных [17 – 19]. Поэтому влияние низких концентраций серотонина можно
было бы объяснить взаимодействием его молекул с другим типом серотониновых
рецепторов, например 5-HT3. Последний был обнаружен в нервной системе L.
stagnalis при исследовании фармакологических свойств нейронов церебрального
ганглия [20].
К
настоящему моменту известно, что набор агонистов и антагонистов для 5-HT
рецепторов беспозвоночных значительно отличается от набора фармакологических
агентов 5-HT рецепторов позвоночных животных. К примеру, константа диссоциации
(Ki, нМ) для метерголина в отношении 5-HTlym составляет 55, а при связывании с
5-HT1 и 5-HT2 рецепторами позвоночных животных 10 и 2,1 соответственно [21,
16]. Отмечается, что 5-HT рецепторы беспозвоночных животных характеризуются
иными фармакологическими и функциональными свойствами, чем рецепторы
позвоночных [22]. Кроме того, филогенетические различия между моллюсками и
позвоночными животными настолько велики, что фармакологический профиль
соответствующих рецепторов беспозвоночных видов вряд ли может быть полностью
подобен профилю рецепторов позвоночных животных, поэтому требует для
дифференциации других фармакологических агентов [23, 24]. Возможно, что в
данном нервно-мышечном соединении присутствует особый тип серотониновых
рецепторов, чей фармакологический профиль отличается от уже известных. Высокие
же значения эффективных концентраций мианзерина и метерголина могут
свидетельствовать о высоком значении константы диссоциации этих веществ для
данного типа рецептора. По крайней мере, фармакологическая характеристика
5-HTLym рецептора, недавно полученного методом клонирования в культуре нервных
клеток L. stagnalis, не совпадает ни с одним из фармакологических профилей
5-HT1 рецепторов позвоночных. На основе чего авторы сделали предположение о
дополнительном субклассе – 5-HT1 – подобных рецепторов, еще не обнаруженном у
позвоночных [16]. Для поиска ответа на вопрос: сходны ли свойства серотониновых
рецепторов нервно-мышечного соединения и центральных нейронов моллюска L.
stagnalis – необходимо существенно расширить спектр исследуемых соединений.
Авторы
приносят благодарность профессорам Ф.-В. Шурману (университет Геттингена) и Г.
Брилла за любезно представленные фармакологические препараты, а также К.А.
Судоплатову за техническую помощь в организации экспериментов. Работа выполнена
при финансовой поддержке грантов ИНТАС-РФФИ №97-04-71075 (IR-97-798) и
Минобразования №97-0-10.0-207.
Список литературы
1. Muneoka Y., Twarog B. Neuromuscular transmission and
excitation-contraction coupling in molluscan muscle // The Mollusca / Eds.
A.S.M. Saleuddin, K.M. Wilbur. New-York; London: Academic Press, 1983. V. 4. P.
35 – 64.
2. Heyer C.B., Katert S.B., Karlsson U.L. Neuromuscular systems in
mollusca // Amer. Zool. 1973. V. 13. P. 217 – 270.
3. Fox L.E., Lloyd P.E. Serotonergic neurons differentially modulate
the efficacy of two motor neurons innervating the same muscle fibers in Aplysia
// J. Neurophysiology. 1998. V.80. P. 647 – 655.
4. Versen B., Gokorsch S., Fiedler A., Schipp R. Monoamines and the
isolated auricle of Sepia officinalis: are there b-like receptors in the heart of a cephalopod?
// J. Exp. Biol. 1999. V. 202. P. 1067 – 1079.
5. Yoshida M., Kobayashi M. Modulation of the buccal muscle
contraction by identified serotonergic and peptidergic neurons in the snail
Achatina fulica // J. Exp. Biol. 1995. V. 198. 729 – 738.
6. Fox L.E., Lloyd P.E. Glutamate is a fast excitatory transmitter
at some buccal neuromuscular synapses in Aplysia // J. Neurophysiology. 1999.
V. 82. P. 1477 – 1488.
7. Cook A. The withdrawal response of a freshwater snail (Lymnaea
stagnalis) // J. Exp. Biol. 1975. V.62. P. 783 – 796.
9. Ferguson G.P., Benjamin P.R. The whole-body withdrawal response
of Lymnaea stagnalis. II. Activation of central motoneurones and muscles of
sensory input // J. Exp. Biol. 1991. V. 158. Р. 97 – 116.
10.
Судоплатов К.А., Жуков В.В. Электрические реакции периферических нервов
моллюска Lymnaea stagnalis на фотостимуляцию кожной поверхности // Журн.
эволюц. биох. и физиол. 1999. Т. 35. №4. С. 274 – 280.
11.
Жуков В.В., Кононенко Н.Л. Возможное участие серотонина в периферическом звене
оборонительного рефлекса моллюска Lymnaea staganalis // Журн. эволюц. биохим. и
физиол. 2002. Т.38. C.225 – 231.
12. Elo J.E. Das Nervensystem von Limnaea stagnalis (L.) Lam // Ann.
Zool. Soc. Zool.-Bot. Fen. Vanamo. 1938. T. 6. №4. S. 1 – 40.
13. Plesh B., Janse C., Boer H. Gross morphology and hystology of
the freshwater pulmonate Lymnaea stagnalis // Neth. J. Zool. 1975. V.
25. №3. P. 332 – 352.
14.
Блаттнер Р., Классен Х., Денерт Х., Деринг Х. Эксперименты на изолированных
препаратах гладких мышц. М., 1983.
15.
Лакин Г.Ф. Биометрия. M., 1990.
16.
Sugamori K.S., Sunahara R. K., Guan H.-C., Bulloch A.G., Tensen C.P., Seeman
P., Niznik H.B., Van Tol H.H.M. Serotonin receptor cDNA cloned from Lymnaea
stagnalis // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V. 90. P. 11 – 15.
17. Hatakeyama P., Ito E. Three-dimensional reconstruction and
mapping of serotonin-like immunoreactive neurons in the CNS of the pond snail,
Lymnaea stagnalis, with the confocal laser scanning microscope // Bioimages.
1999. №7 (1). P. 1 – 12.
18. Walcourt-Ambakederemo A., Winlow W. 5-HT receptors on identical
Lymnaea neurons in culture. Pharmacological characterization of 5-HT1A
receptors // J. Comp. Biochem. Physiol. 1994. V. 107C. № 1. P. 129 – 141.
19. Walcourt-Ambakederemo A., Winlow W. 5-HT receptors on identical
Lymnaea neurons in culture. Pharmacological characterization of 5-HT2 receptors
// J. Gen. Pharmacology. 1995. V. 26. № 3. P. 553 – 561.
20. Walcourt-Ambakederemo A., Winlow W. 5-HT receptors on identical
Lymnaea neurons in culture. Pharmacological characterization of 5-HT3 receptors
// J. Gen. Pharmacology. 1994. V. 25. P. 1079 – 1092.
21. Peroutka S.J., Snyder S.H. Multiple serotonin receptors and
their physiological significance // Federation Proc. 1983. V. 42. P. 213 – 217.
22. Zang B., Harris-Warrick R.M. Multiple receptors mediate the
modulatory effects of serotonergic neurons in a small neural network // J. Exp.
Biol. 1994. V. 190. P. 55 – 77.
23. Tierney A.J. Structure and function of invertebrate 5-HT
receptors: a review // J. Comp. Bioch. and Physiol. Part A. 2001. V. 128. P.
791 – 804.
24. Tabor J.N., Cooper R.L. Physiologically identified 5-HT2-like
receptors at the crayfish neuromuscular junction // Brain Research. 2002.
V. 932. P. 91 – 98.
Для
подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://elib.albertina.ru