Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии

Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии

Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии

Оглавление

Введение

Глава 1. Биологические особенности кумжи

.1 Систематическое положение и внутривидовая структура кумжи

.2 Экология анадромной кумжи

.3 Экология ручьевой форели

.4 Морфология анадромной кумжи

.5 Морфология ручьевой форели

.6 Основное представление о генофонде кумжи

.7 Искусственное воспроизводство и хозяйственное значение

.8 Охрана вида

Глава 2. Материалы и методы исследований

.1 Определения возраста рыб по чешуе

.2 Изучение морфологических характеристик рыб

.3 Микросателлитный анализ ДНК.

.3.1 Выделение тотальной ДНК

.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

.3.3 Электрофорез

Глава 3. Результаты исследований

.1 Возрастной состав изучаемых форелей

.2 Морфологические параметры изучаемых форелей

.3 Результаты микросателлитного анализа ДНК

Выводы

Литература

Приложения

Введение

Кумжа (Salmo trutta L.) является ценной промысловой рыбой. Из-за нерегулируемого промысла, гидростроительства, загрязнения рек и браконьерства популяции кумжи резко сократили свою численность. В связи с этим данный объект внесен в Красные книги разных стран, в том числе и Российской Федерации 2001 года. Проходная форма черноморской кумжи (Salmo trutta labrax) в Красной книге Российской Федерации отнесена к категории 1, как находящаяся под угрозой исчезновения. Для восстановления численности популяций данного вида необходимым является искусственное воспроизведение кумжи в рыбозаводах и выпуск покатников (смолтов) в реки. В естественных условиях обитания для кумжи характерно большое генетическое разнообразие разных субпопуляций, приуроченных к определённым рекам, что во многом обусловлено высокой степенью хоминга. При искусственном восстановлении численности для воспроизводства используют малое количество иногда одних и тех же особей из определённого местообитания. Это может привести к инбридингу, понижению природного полиморфизма популяций и обеднению генофонда. Поэтому важно иметь сведения о генетической структуре природных популяций, чтобы осуществлять подбор особей для формирования ремонтно-маточного стада сохраняя природное генетическое разнообразие.

В качестве генетических маркеров ранее использовались морфологические (фенотипические) признаки, количество которых ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды. Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов экспрессии генов (белковый, или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК). В генетических исследованиях локусов с большим аллельным разнообразием, гетерозиготностью и высокой скоростью мутирования используют мини - и микросателлитные методы. Микросателлитные маркеры выявляют генетическую дифференциацию в тех случаях, когда она не обнаруживается другими методами, среди близкородственных популяций или экологических групп одного вида.

Целью данной работы является изучение популяций кумжи (Salmo trutta L.) в реках Абхазии с использованием микросателлитного анализа ДНК. Поставленная цель определила решение следующих задач:

) определение возраста исследуемых рыб;

) определение морфометрических параметров изучаемых особей;

) проведение микросателлитного анализа ДНК рыб с подбором локусов с соответствующими праймерами;

) выявление гомо- или гетерозиготности исследуемых особей по изучаемым локусам;

) выявление полиморфизма по каждому микросателлитному локусу.

Генетика кумжи довольно хорошо изучена, но черноморский подвид кумжи и её популяции из рек Абхазии в популяционно-гентическом плане не исследованы, поэтому изучение их генофонда является весьма актуальным.

В данной работе впервые проведены исследования популяций кумжи в реках Абхазии с помощью микросателлитного анализа ДНК по STR-локусам с соответствующими праймерами.

Работа выполнена на кафедре экологии и морфологии животных Абхазского Государственного Университета, под руководством доцента, к.б.н. Гогуа Марины Лементьевны.

При подготовке данной работы активную помощь оказывали сотрудники лаборатории генетики и радиологии Азовского Научно-исследовательского Института Рыбного Хозяйства (АзНИИРХ). На разных этапах выполнения дипломной работы помощь оказывали сотрудники кафедры экологии и морфологии животных АГУ. Всем им мы выражаем искреннюю благодарность.

Глава 1. Биологические особенности кумжи

.1 Систематическое положение и внутривидовая структура кумжи

Кумжа занимает следующее место в системе животного мира (Константинов и др., 2004):

Царство: Животные, Animalia

Тип: Хордовые, Chordata

Подтип: Позвоночные, Vertebrata

Надкласс: Челюстноротые, Gnathostomata

Класс: Костные рыбы, Osteichthies

Подкласс: Лучепёрые, Actinopterygii

Надотряд: Костистые рыбы, Teleostei

Отряд: Лососеобразные, Salmoniformes

Семейство: Лососёвые, Salmonidae

Род: Лососи, Salmo L.

Вид: Кумжа, Salmo trutta L.

Кумжа (Salmo trutta L.) ─ типичный представитель семейства Лососёвых (Salmonidae). Это интересный вид, имеющий сложную популяционную структуру и делящийся на подвиды.

Систематики выделяют 6 подвидов Salmo trutta L., из которых в водах России и бывшего СССР обитают пять подвидов ─ 4 проходных и 1 озёрный:

. Salmo trutta trutta L. ─ обыкновенная кумжа (проходная) ─ обитает в бассейнах Балтийского, Белого и Баренцова морей на восток до Печоры. Это типичный подвид кумжи, который проводит в пресной воде от 3 до 7 зим, причём здесь данная форма растёт лучше, чем обыкновенный лосось (сёмга), в море же типичная кумжа растёт хуже.

В реке молодь питается главным образом водными личинками насекомых и воздушными насекомыми. В море основную пищу составляет мелкая рыба и в меньшей степени ракообразные. В море не совершает столь значительных миграций, как обыкновенный лосось. Ход в реку обычно очень растянут, нерест происходит в реках бывшего СССР в октябре и ноябре, а в реках Западной Европы ─ в ноябре ─ декабре (Никольский, 1971).

. Salmo trutta caspius Kessler ─ каспийская кумжа ─ обитает в бассеине Каспийского моря; на нерест идёт в р. Куру, в бассеине которой образует жилую форму (форель).

По-видимому, когда Каспийское море было соединено с Азовским, в него проникла кумжа, образовав со временем новый подвид ─ каспийский лосось (кумжа). На Каспии его называют каспийским лососем или просто лососем. Каспийский лосось похож одновременно на черноморского и на сёмгу. Отличается более низким хвостовым стеблем. Это, по-видимому, самый крупный лосось Европы: известны случаи поимки рыб весом в 33 и даже 51 кг (Расс, 1971).

Сходство с сёмгой долгое время заставляло систематиков считать каспийского лосося подвидом сёмги. Лишь в недавнее время установили, что по особенностям строения зародыша в икринке и числу хромосом это сильно отклонившаяся форма кумжи.

Каспийский лосось входит для нереста в реки главным образом западного берега, больше всего его в Куре, реже в Тереке, Араксе, Ленкоранке. В крупнейшую реку Каспия ─ Волгу он входит единичными экземплярами. У каспийского лосося также имеются яровые и озимые формы. Яровая форма входит в Куру с почти зрелыми половыми продуктами, поднимается по реке относительно невысоко и нерестится в том же году. Это сравнительно мелкий лосось (до 12 кг). Крупная озимая форма идёт на нерест с ноября по февраль (чаще в декабре ─ январе). Половые продукты у неё развиты слабо, средний вес 15 кг, и поднимается она очень высоко, до истоков Арагви. Плодовитость куринского лосося составляет 16 ─ 30 тыс. икринок (Никольский, 1971). От 8 до 11 месяцев озимые лососи созревают в реке. Молодь живёт в реке до двух лет. Сходные сезонные формы обнаружены и у лососей, входящих в другие реки (Самур, Терек) (Расс, 1971).

. Salmo trutta ciscaucasicus Dorofeeva ─ предкавказская кумжа ─ обитает в бассеине Каспийского моря; на нерест идёт в реки западного побережья (кроме Куры), повсеместно образует пресноводные формы форели. На территории России это кумжа из рек Терек, Самур и крайне редко Волга и Урал.

Неопределенная по статусу ручьевая форель из верховьев Волги и Урала имеет статус 4 - неопределенные по статусу жилые формы кумжи в виде ручьевых форелей. Количество оставшихся популяций неизвестно. Скорее всего, они принадлежали к предкавказскому подвиду, хотя в верховьях Волги мог быть и балтийский подвид. Раньше в бассейне Волги ручьевая форель была широко распространена от Саратовской области до верховий, включая бассейны рек Кама, Сура, Ока и др. В настоящее время она встречается в Тверской, Ульяновской, Самарской, Кировской, Пермской и северной части Оренбургской области. В то же время они полностью исчезла в Московской, Рязанской, Владимирской и Нижегородской областях. В последние годы она не встречается в республиках Марий-Эл и Мордовии, в Ярославской и Саратовской областях. В бассейне Урала ручьевая форель обитала только в пределах России, еще в 1970-1980-е годы она отмечалась в ручьях, впадающих в речки Большой Ик и Катралы (приток р. Сакмары). В последние годы отмечается повсеместное сокращение численности. Причины - изменение экологической ситуации в верховьях рек и ручьев, загрязнение вод и интенсивный вылов.

. Salmo trutta ezenami Berg ─ эйзенамская форель ─ пресноводная форель, обитает только в озере Эйзенам (Дагестан). Там обитают две формы этой рыбы ─ одна, мелкая, удивительно ярко окрашена: на боках тела крупные красные и мелкие чёрные пятна, спинной плавник чёрно-пятнистый и жировой ─ красно-пятнистый; она достигает в длину 34, чаще 24-25 см и питается планктоном и моллюсками-прудовиками. Но в том же озере обитает и другая форма, более глубоководная, крупная, тёмноокрашенная и ведущая хищный образ жизни (Расс, 1971).

. Salmo trutta labrax Pallas ─ черноморская кумжа (черноморский лосось) ─ обитает в бассеинах Чёрного и Азовского морей, образует пресноводные формы форели (Salmo trutta morpha fario L.).

. Аральская кумжа (Salmo trutta aralensis) ─ самая восточная форма проходной кумжи, населяющая Аральское море и поднимающаяся на нерест в Амударью. Этот подвид близок к каспийскому, но отличается меньшим числом позвонков и более крупной головой. Длина его до 1 м, вес до 13-14 кг. Об образе жизни этой немногочисленной формы очень мало известно (Расс, 1971).

В систематике рыб форель ручьевая (Salmo trutta morpha fario L.) и форель озёрная (Salmo trutta morpha lacustris) относятся к особой таксономической единице - морфе, то есть слабо закреплённой наследственностью изменённой форме, которая при соответствующей перемене внешних условий легко возвращается в исходное состояние. Форель ручьевая является пресноводной формой морской проходной лососёвой рыбы - кумжи, легко образующей в пресных водоёмах жилые формы, которые хорошо приспосабливаются к пресноводному образу жизни, никогда не уходят в море, но обладают меньшими по сравнению с исходным морским видом интенсивностью роста и плодовитостью.

В запутанном вопросе систематики и родства многих «кумжеобразно-форелевых» форм решающую роль сыграли акклиматизация и разведение кумжи в искусственных условиях. Ранее кумжу и форель считали отдельными группами рыб. Например, долгое время ученые придерживались точки зрения Линнея, согласно которому ручьевая и озерная форель считались особыми видами. На ложность этого утверждения указал следующий факт: в Новую Зеландию для акклиматизации в здешних реках была привезена ручьевая форель. Спустя некоторое время часть освоившейся форели скатилась в низовье рек и море и превратилась в проходную кумжу.

В настоящее время можно считать доказанным фактом явление превращения проходной кумжи, ручьевой и озерной форели друг в друга. Европейские ручьевые форели иногда даже скатываются на 300-700 км вниз по рекам, выходя в приустьевые пространства Средиземного и Адриатического морей, как бы совершая попытки превратиться в проходную форму. При выпуске молодых форелек из рыбоводных заводов в Балтийское море акклиматизанты легко приобретают серебристый цвет и возвращаются на нерест в облике проходной кумжи (Расс, 1971).

.2 Экология анадромной кумжи

Естественный ареал кумжи (Приложение 1), существенно сократившийся в XX в., представлен ныне рядом локальных анадромных и пресноводных популяций, приуроченных к бассейнам морей, омывающих Европу, а также бассейнам Чёрного, Каспийского и Аральского морей (Алтухов, 2004).

На Балтийском море кумжу называют лососем-тайменем; обитает она и на Белом море. В Америке кумжи не было до акклиматизации её там человеком; крайний западный пункт её естественного распространения ─ Исландия (Расс, 1971).

В Средиземном море проходная форма кумжи отсутствует, но речные формы ─ форели ─ в его бассейне есть. В ледниковое время кумжа в южных морях была распространена более широко и была более многочисленна; об этом можно судить как по ископаемым остаткам, так и по распространению форелей, которые сейчас встречаются там (например, бассейн Средиземного моря), где проходной кумжи сейчас нет (Никольский, 1971).

Черноморский лосось из Чёрного моря заходит в различные реки: Бзыбь, Чёрная речка, Гумиста, Кодор, Ингур, Кинтриши, Мачахела, Чорохи, редко в Хоби и Чурия; заходит в Азовское море, в р. Кубань, в реки Крыма, в Днепр, Дунай и др. (Шарвашидзе, 1984, Эланидзе, 1983). По данным Г.П. Барача (1960), лосось заходит также в р. Хипста (Белая), Ацы (Баклановка), Моква, Галидзга; в р. Риони лосось не заходит (Барач, 1960).trutta L. ─ анадромный, эвригалинный вид. Для нереста заходит в реки; подростки проводят там первые годы жизни, а затем скатываются в море, где они быстро растут и созревают; образуются местные стада, связанные с отдельными реками.

Для кумжи, как и для других лососёвых, характерен хоминг (от англ. home), то есть инстинкт родного дома. При этом особь возвращается для нереста в те же пресные водоёмы, где и «родилась». Отклонение от строгого хоминга, т.е. возврат для нереста не на место рождения, а на другие территории, называется стрэингом (от англ. to stray ─ сбиться с пути, заблудиться).

Средняя интенсивность стрэинга (в %) для Salmo trutta L. по данным Ю.П. Алтухова (2004) равна 3,1, т.е. меньше аналогичной величины для близкородственного вида Salmo salar (3,9); но средняя интенсивность стрэинга некоторых тихоокеанских лососей меньше, чем усреднённая интенсивность стрэинга для кумжи. Например, для Oncorhynchus kisuch она равна 1,25 %, для Oncorhynchus nerka ─ 2,3 % (Алтухов, 2004). По этим данным можно сделать вывод о том, что Salmo trutta характеризуется более

точным хомингом, чем Salmo salar, но уступает по данному показателю некоторым видам тихоокеанских лососей.

Хоминг является очень важной биологической особенностью зоологических видов. Он создаёт очевидные предпосылки для сильной внутривидовой дифференциации в соответствии с историей и географией видового ареала. Эта изоляция в период нереста, усиленная сложным репродуктивным поведением, способствует формированию множества репродуктивных популяций, или локальных стад, рассеянных на громадных пространствах (Ricker, 1972; Коновалов, 1980; цит. по: Алтухов, 2004).

Молодь черноморского лосося в реках питается зообентосом: ракообразными, хирономидами, подёнками, трихоптерами, олигохетами, насекомыми, попавшими в воду, частично планктоном; в море кумжа питается, в основном, рыбой, разными беспозвоночными (Эланидзе,1983).

По Г.П. Барачу (1962), основу питания в реке Чёрной как сеголеток, так и годовиков-двухлеток (а также и жилой форели старших возрастов) составляют бокоплавы, хирономиды и воздушные насекомые (Барач, 1962; цит. по: Шарвашидзе, 1984). На счёт этих трёх групп падает, по количеству остатков, в среднем, до 85%, из них 25% ─ на долю воздушных насекомых. Около 6% остатков пищи составляют личинки ручейников и некоторых других насекомых. Хищничество в реке Чёрной почти не наблюдается, ─ рыбные остатки встречаются в виде исключения; осенью в желудках годовиков встречается икра ─ до 10% и более (Барач, 1962; цит. по: Шарвашидзе, 1984).

В реке Гумиста, по Г. П. Барачу, преобладающую роль в питании молоди

черноморского лосося и форели играют воздушные насекомые ─ до 46% остатков. Возрастает роль личинок насекомых; усиливается также хищничество. Недостаточная обеспеченность питания водной фауной компенсируется, главным образом, воздушными насекомыми (Барач, 1962; цит. по: Шарвашидзе, 1984).

В море черноморская кумжа питается, главным образом, хамсой. В некоторых реках и рыбы составляют существенную часть рациона (Шарвашидзе, 1984).

По данным Р.Ф. Эланидзе, половой зрелости черноморский лосось достигает с 3-летнего возраста, самцы ─ раньше чем самки. В реках Ингур, Кодор, Келасур, Бзыбь, Псоу, Белая, Чорохи, Чёрная и др. ход черноморского лосося начинается в марте, с первого же половодья и помутнения реки; разгар хода в апреле, мае; вначале входят единичные, более крупные, длиной 80-100 см, весом 5-6 кг, а затем мелкие экземпляры, длиной 50-60 см, весом 2 кг (Эланидзе, 1983; Шарвашидзе, 1984).

Средний вес ходовых лососей при первой нерестовой миграции Г.П. Барачем определён 2,0 кг, при второй 4,98 кг, третьей 6,7 кг, четвёртой 9,5 кг и пятой 11,7 кг (Шарвашидзе, 1984).

На реке Бзыбь нерестилища расположены, начиная от пункта ниже моста за шоссе Сухум ─ Гагра и вверх почти до сел. Псху. Нерестилища в р. Чёрной по сведениям Г.П. Барача (1941), расположены выше сел. Бармиши. В р. Кодор черноморский лосось поднимается для нереста на 15 километров выше сел. Аджары, заходя во все её притоки (Барач, 1941; цит. по Шарвашидзе, 1984).

Нерест черноморской кумжи в реках Абхазии начинается с октября, при температуре воды 5-12º и продолжается до января, разгар нереста в ноябре. Черноморские лососи во время нереста идут парами, впереди идёт самка, за нею ─ самец; в это время у них уже выражен половой диморфизм ─ самка более крупная, светлого цвета, самец ─ меньше самки и тёмноватого цвета.

Половой диморфизм заключается ещё и в том, что у самцов нижняя губа заходит крючком в верхнюю (Шарвашидзе, 1984).

Во время поиска места нереста они мало реагируют на окружающую среду, причём входят иногда в такие мелкие притоки, где вода их не покрывает полностью. В это время производители сильно ударяют хвостом в обе стороны и оставляют след; размножается лосось в местах распространения форели, т.е. в нижней части форелевого участка реки. Нерест происходит, главным образом, на рассвете, на мелководных, галечно-песчаных местах.

На галечном перекате лосось облюбовывает подходящие для нереста места, прощупывает дно и убедившись, что оно крепкое, начинает «обрабатывать» его носом и хвостом. В работе участвует и самец, но больше работает самка, а самец, в основном, охраняет гнездо. Гнездо бывает длиной 1,5 м и более, шириной до 1 м, и больше ─ 1,20 см. Размер гнезда зависит от величины производителей. Глубина гнезда 35 см, а иногда даже больше ─ до 42 см. Во время постройки гнезда лососи очень чутки и в случае опасности сразу покидают излюбленное место и ищут менее опасные места. Если во время икрометания около производителей появляется человек, то они уплывают в другое место, где начинают строить новое гнездо и заканчивают нерест. После нереста самец в течение 2-3 дней охраняет гнездо от ручьевых форелей, которые похищают икру лосося. Когда самца нет, самец ручьевой форели оплодотворяет отложенную икру лосося, но так как форель имеет очень мало молока, огромная часть икры остаётся неоплодотворённой и погибает. Так что роль карликовых самцов в деле оплодотворения икры лосося совершенно незначительна (Шарвашидзе, 1984).

При закладке икры в естественных условиях значительная часть её сноситься течением и для размножения теряется, вымываются также частично молоки и не вся заложенная в гнездо икра оплодотворяется. Потери икры при естественном нересте достигают 70-90%, выход молоди (личинок) составляет от 10 до 30 % от выметанной икры (Барач, 1960).

Лосось и форель нерестятся в одно и то же время. Опытный рыбовод К.Н. Титов (лососеводный пункт на р. Кодор, сел. Лата) передаёт, что если при нересте самка лосося бывает одна, без самца, за ней гонятся самцы форели, которые, по-видимому, оплодотворяют её икру; по его же наблюдению, лосось после нереста спускается по реке хвостом вниз (Эланидзе, 1983).

Кодорский лососеводный пункт в 1952 г. выпустил в безрыбный приток р. Кодор 3000 мальков черноморского лосося, где на 4-ом году после запуска нашли половозрелых экземпляров с икрой; этот факт может свидетельствовать о том, часть мальков лосося остаётся в реках в течение всей жизни.

В тех местах реки Кодор, куда заходит черноморский лосось и где он размножается вместе с форелью, встречается молодь лососевых трёх разных форм: первая форма ─ настоящая форель, с высоким телом, оранжевого цвета, на фоне которого разбросаны красные, жёлтые и тёмные пятна; у второй формы тело низкое, удлинённое, с оттенком оранжевого и стального цвета, красных пятен меньше; у третьей формы тело также низкое, удлинённое, стального цвета, выше боковой линии и на спине тёмных пятен больше, чем у второй формы, а жёлтых пятен меньше; эта последняя форма является молодью лосося, вторая же форма ─ переходная между лососем и форелью. Такой смешанный состав лососевых встречается только в общих местах распространения и размножения лосося и форели. На чисто форелевых участках такая картина не наблюдается (Эланидзе, 1983).

Отложенная икра черноморского лосося, по наблюдениям В.Л. Шарвашидзе, круглая, желтовато-оранжевого, иногда светло-лимонного цвета; диаметр икры 4,4 мм, желтка ─ 3,8 мм; икра бзыбского лосося в диаметре 5,6 мм, вес ─ 0,40-0,42 г, диаметр желтка ─ 4,31 мм (Шарвашидзе, 1984).

В опытах В.Л. Шарвашидзе, естественное вылупление лосося происходило в возрасте 40 суток. Эмбрионы имели длину тела 13-14 мм. В возрасте 45 суток личинка достигала длины до 24 мм. В возрасте 57 суток мальки лосося достигали длины 27 мм (вес 0,42 мг), активно плавали. Вес малька длиной 46,4 мм до одного грамма. Тело покрыто сгруппированными пигментными клетками вдоль всего тела, характерными для молоди (Шарвашидзе, 1984).

Плодовитость лосося ─ от 2,5 до 15,5 тысяч икринок, их диаметр ─ от 4,5 до 6,5 мм; развитие икры происходит в течение 50─90 суток, длительность развития зависит от температуры воды.

Молодь черноморского лосося и форели в реках живёт вместе и образует единый фонд, который на второй год жизни разъединяется на 2 группы ─ на форелей, остающихся в реке, и на лососей, скатывающихся в море (Эланидзе, 1983). В море скатываются преимущественно самки, в реке остаются в большинстве самцы (Барач, 1960). Лосось скатывается в море при длине тела 12─20 см, на 2─3 году жизни.

Англичане называют покатников смолтами (smolt). Название это встречается и в русской литературе, но в настоящее время получает большее распространение наименование серебрянка. Молодь, не приобретшую отличительных особенностей покатной, называют «пестрятками» (Барач, 1960).

Установление возраста черноморского лосося вызывает споры. Лосось живёт 8─12 лет, но некоторые считают, что крупные экземпляры доживают изредка до 18─25, как исключение до 30 лет (Шарвашидзе, 1984).

.3 Экология ручьевой форели

Распространены ручьевые форели очень широко. Они есть везде, где имеется проходная и озёрная кумжа, и, кроме того, распространены в горных ручьях Средиземноморья (Марокко, Алжир, Тунис, Испания, Португалия, Франция, Корсика, Сардиния, Сицилия, Италия, Греция, Малая Азия, верхнее течение Евфрата и Амударьи). Эти рыбки остались здесь от времени, когда климат Средиземноморья был значительно холоднее, и там могла обитать проходная кумжа (Расс, 1971).

Форель водится почти во всех горных реках и ручьях, которые вообще бывают холодными, быстротекущими, прозрачными, с каменистым дном и рассыпанными многочисленными глыбами камней, образующими котловины разных размеров и форм. По данным В.Л. Шарвашидзе, ручьевая форель распространена в водах бассейнов Каспийского, Чёрного, Азовского, Средиземного, Балтийского, Белого морей. Форель встречается в большинстве рек и озёр Кавказа. Обитает в реках Кура, Храми, Арагви, Боржомула, Лиахви, Толоши, Ахалкалакисцкали, Алазани, Илто, Челта, Кабали, Иори и др. В озёрах: Паравани, Сагамо, Табискури и др. В пределах Абхазии ручьевая форель распространена от реки Ингур до реки Мзимта; в озёрах Мзи, Рица (Эланидзе, 1983).

Форель предпочитает в основном холодные, чистые, быстротекущие горные реки и горные озёра, богатые кислородом. В верхнем течении многих рек она является единственной распространённой там рыбой, где другие рыбы не могут существовать.

Форель обитает в водоёмах, с каменисто-песчаным дном, которое изобилует перекатами.

В нижнем течении рек, в которых форель распространена всюду (Кодор, Бзыбь и др.), встречается проходная форма, заходящая в море и превращающаяся в черноморского лосося. Летом форель поднимается выше по течению реки, где вода более холодная.

В 1959 г. в устье реки Бзыбь в одном и том же месте Р.Ф. Эланидзе и др. были добыты сеголетки форели в количестве 30 экз. и подростки черноморского лосося 35 экз., что, по их мнению, является общим запасом лосося (Эланидзе, 1983).

Оптимальные условия обитания форели в Абхазии ─ температура воды 13-18º, содержание кислорода 6-10 см3/л, слабощелочная реакция, жёсткость 8-15 градусов. При усиленном питании, особенно весной и летом, потребность в кислороде увеличивается и, наоборот, при ослабленном питании, осенью и зимой, потребность в кислороде заметно уменьшается (Шарвашидзе, 1984).

В реках создаются благоприятные условия для разведения форели благодаря наличию многочисленных заводей, естественных котлов и порогов, несколько замедляющих бурное течение этих горных рек. Берега рек содержат много ям и полостей, сплетений корней, кустарников и т.п. Такие тихие и просторные места служат укрытием и убежищем для форелей. Благодаря тому, что течение в таких участках рек немного замедленно, там развиваются и задерживаются пищевые организмы. Форели предпочитают затенённые места, создаваемые деревьями и склоненными к воде ветвями. На них много насекомых, которые, падая в воду, представляют собой обильную пищу для форели.

По данным В.Л. Шарвашидзе (1984), богата форелью река Псоу, текущая по ущелью. Скорость течения от 1,5 до 1м в секунду; река течёт с перепадами. Температура воды в нижнем течении летом достигает до +20º. Вода имеет слабощелочную реакцию и хорошую насыщенность кислородом (около 8 см3 на миллилитр). Форель распространена преимущественно в верхних участках этой реки, однако спускается и ниже, до устья.

Мальки форели питаются в основном различными беспозвоночными, прежде всего насекомыми: подрастающая молодь переходит на хищнический образ жизни. В верхнем течении р. Кодор в пищевом рационе форели преобладают наземные беспозвоночные: муравьи, саранча, стрекозы, многоножки и др. В среднем течении преобладают гаммарусы (рачки-бокоплавы), а в нижнем течении ─ хирономиды, гаммарус, богомол и рыбы (А.Б. Кохия, 1961; цит. по Шарвашидзе, 1984).

По данным Р.Ф. Эланидзе (1983), форель питается, в основном, зообентосом: хирономидами, трихоптерами, подёнками, ракообразными, насекомыми, попавшими в воду, частично планктоном, мелкой рыбой, икрой рыб, лягушками и др.

В высокогорных олиготрофных водоёмах интенсивность питания форели ниже, чем в эвтрофных водоёмах предгорий и равнинной зоны. От питания в основном зависит и рост форели; в олиготрофных водоёмах низок и темп её роста, а в эвтрофных водоёмах рост более высок (Эланидзе, 1983).

Бокоплавы, составляющие в некоторых реках Абхазии (Чёрная и др.) основу питания форели, являются наилучшей пищей, обуславливающей и наилучшие вкусовые качества форели (Г.П. Барач, 1960).

По данным А.Б. Кохия, рыбы реки Ингур характеризуются невысокой степенью упитанности, что объясняется бедностью кормовых объектов. Это сказывается на питании форели и выражается в том, что в пище встречаются многие наземные, сухопутные (беспозвоночные) животные. Важным экологическим фактором, влияющим на темп роста форели, является состав пищи (Шарвашидзе, 1984).

В местах, где ручьевая форель и проходная кумжа перекрываются ареалами обитания, они составляют единое стадо, нерестующее вместе. В популяции проходной кумжи преобладают самки, недостаток самцов компенсируется за счёт ручьевой форели, где последние преобладают. Это связано с тем, что у лососей, как и у большинства других рыб, самцы созревают раньше самок (при меньших размерах), и поэтому период их жизни в море может укорачиваться и даже совсем выпадать (Расс, 1971).

Соотношение полов в составе речного населения меняется с возрастом. В море уходят преимущественно самки, самцы в большинстве задерживаются в реке дольше, поэтому в составе сеголетков соотношение полов близкое к 1:1, в составе же покатников (серебрянок) самки составляют более 80% и такое же, примерно, преобладание самцов в составе промысловой форели (Барач, 1960).

В реках Абхазии самцы форели достигают половозрелости на втором году жизни, самки ─ на третьем; средний размер зрелых самцов 13,5 см длины, а самок 15,8 см (Шарвашидзе, 1984).

По данным Р.Ф. Эланидзе (1983), ручьевая форель половозрелой становиться с 2─3-летнего возраста. Её нерест в высокогорных ручьях начинается несколько раньше ─ с половины сентября, а ниже ─ в предгорьях ─с октября и продолжается до наступления зимы, при температуре воды 7-12º. Она мечет икру в быстротекущих, мелководных местах, в вырытые на галечно-песчаном грунте ямы. Диаметр зрелой икры 2,5 ─ 6,5 мм (Эланидзе, 1983).

В.Л. Шарвашидзе (1984) указывает, что нерест форели в горных реках, речках и ручьях Абхазии происходит с сентября до конца декабря, редко до февраля; разгар нереста ─ октябрь-ноябрь при температуре воды 6-9º; самка закапывает икру в грунт (Шарвашидзе, 1984).

Плодовитость форели зависит от возраста и от экологических условий, она достигает от 200 до 2000 икринок, в некоторых водоёмах ─ до 27000 икринок и более (Сионское водохранилище).

Развитие икры продолжается 62-200 суток при температуре воды 1-8º; вылупившиеся личинки достигают 2-2,5 см длины. Р.Ф. Эланидзе указывает, что плодовитость форели в притоке (р.Местия) верхнего течения р. Ингур выше, чем в притоке его среднего течения (р. Ненскра). Икра форели в верхнем течении реки, взятая 1 сентября более зрелая, чем икра в среднем течении, взятая 2   1 сентября; отсюда видно, что нерест форели в реках Абхазии начинается раньше в верхнем течении, где температура воды осенью падает раньше (Эланидзе, 1983).

По данным В.Л. Шарвашидзе (1984), в опытах естественное вылупление происходит в возрасте 39-40 дней; общая длина эмбриона 16 мм; развивался при температуре воды 7-9,5º С. Длина тела личинки 24 мм; глаза большие, диаметр их составляет 35%, длина рыла ─ 14,3% от длины головы.

По литературным сведениям ручьевая форель живёт до 10-12 лет (Шарвашидзе, 1984). Возрастной состав речного населения исчерпывается практически 4-5 возрастными категориями; к четвёртому году жизни поколение, из которого пополняются проходные лососевые и речные форелевые стада, оказывается исчерпанным, с одной стороны, миграцией (скатом), с другой ─ выловом и возможной естественной смертностью (Барач, 1960).

.4 Морфология анадромной кумжи

Кумжа (Salmo trutta Linnaeus, 1758) существует в природе в разнообразных формах, отличающихся друг от друга внешне, по месту существования и экологии. В Чёрном море обитает один подвид кумжи ─ черноморская кумжа, или черноморский лосось (Salmo trutta labrax Pallas.) В реках локализуется отдельная жилая популяция кумжи ─ ручьевая форель (Salmo trutta morpha fario L.).

По данным Эланидзе Р.Ф.(1983) Д IV─V (VI) 8-10 (II), A III ─ IV (V) (7) 8─9 (10), P I 12─14, V1 8─9. Жаберных тычинок на первой дуге 15─21. Позвонков 55─57 (58). Пилорических придатков 42─77 (92) (Эланидзе, 1983), жаберных лучей 10─12 (Шарвашидзе, 1984). Верхняя челюсть уходит за вертикаль заднего края глаза. Длина головы составляет 19─20 % от длины тела. У взрослых особей на языке зубов 5─8; на сошнике расположены зубы в один ряд; хвостовой плавник слабо выемчатый. Спина тёмно-серая, с синим оттенком, бока и брюшная сторона серебристо-белые. От конца жирового плавника до боковой линии 18 рядов чешуй. На теле разбросаны чёрные пятна, их больше выше боковой линии. На боках головы располагаются более крупные, тёмные пятна. Плавники в основном серые; на спинном плавнике имеются несколько рядов мелких пятен, основа грудных, брюшных и анального плавников чаще розового цвета. У некоторых экземпляров на теле чёрных пятен нет. Черноморский лосось достигает в длину 110 см и весом до 24 кг, редко больше (Эланидзе, 1983; Шарвашидзе, 1984).

Черноморский лосось (Salmo trutta labrax Pallas.) от весьма близкого каспийского лосося (Salmo trutta caspius Kessler ) отличается более высоким хвостовым стеблем (Шарвашидзе, 1984). Этот вид обнаруживает большее удаление к семге (Salmo salar L.), чем к каспийскому лососю (Шарвашидзе, 1984). Еще одно отличие кумжи от сёмги - во время нерестового хода кумжа не прекращает питаться.

Кумжа очень похожа на обыкновенного лосося (Salmo salar L.); отличается более высоким хвостовым стеблем, окраской и рядом особенностей скелета, а также большим числом хромосом: у кумжи 80, лосося ─ 60 2n ; по образу жизни кумжа больше связана с пресной водой (Никольский, 1971).

.5 Морфология ручьевой форели

Ручьевая форель (Salmo trutta morpha fario L.) ─ локальная пресноводная форма зоологического вида Salmo trutta L., полностью адаптированная к жизни в пресных водах с быстрым течением и высоким содержанием кислорода.

Д III─V, 8─11, A II─IV 7─9 (10), P I 10─12, Y I 7─9, I. I 103─126, жаберных тычинок 16-22, позвонков 55-60, пилорических придатков 25-62 (65). Число жёстких лучей в спинном плавнике чаще всего 4, в анальном плавнике преимущественно 2. Длина головы в процентах ко всей длине тела колеблется в пределах от 21 до 24,6. Длина хвостового стебля ─ 11-13%. Наибольшая высота тела достигает 17-24,1%. Наименьшая высота ─ от 8,2 до 9,2% (Шарвашидзе,1984; Эланидзе, 1983).

Форель подвижная и красивая рыба. Окраска сильно варьирует в зависимости от места обитания, возраста, питания, пола, состояния или степени зрелости половых продуктов. Например, в реке Ингур встречаются экземпляры оранжевого и тёмного цвета, в реке Кодор наблюдается до трёх групп форели с разной окраской: одна группа оранжевого цвета, 2-я ─ тёмно-бурого цвета, 3-я ─ более светлого цвета, чем вторая (Эланидзе, 1983). У молодых рыб по бокам тела часто образуются ряды поперечных тёмных пятен, окраска которых меняется в зависимости от характера места обитания и возраста. В основном же спинная сторона тёмно-зеленоватого цвета, бока и брюшная сторона сравнительно светлее: тело по бокам покрыто разновеличинными бурыми, чёрными и оранжевыми пятнами; пятна часто окружены светлым ободком (Расс, 1971).

Во время размножения окраска тела меняется и у самцов бывает оливковая, а у самок становится более яркой и, в зависимости от грунта речки, сильно изменяется. Окраска тела ручьевой форели ясно и отчётливо различается у форелей из разных рек (Шарвашидзе, 1984).

Форель в реках достигает 40 см, весом больше 0,5 кг, редко ─ до 1 кг (Эланидзе, 1983), обычно 25-35 см длины и 200-500 г веса, крайне редко до 2 кг (Расс, 1971). Размеры и вес также определяются условиями внешней среды. Чем больше ручей, в котором обитает форель, чем больше в нём её пищевых объектов, тем больших размеров она может достигать.

По данным Р.Ф. Эланидзе (1983), форель, обитающая в озере, отличается от речной форели большим ростом, она там достигает в среднем до 50-60 см, весом ─ 4-5 кг (редко ─100-120 см, 15-20 кг). По данным того же автора, в Абхазии обитает две популяции форели ─ горная и предгорная популяции; обычно вблизи истоков рек встречается жилая форма, отличающаяся темноватой окраской, а значительно ниже ─ предгорная форма, имеющая желтоватую окраску. Предгорная форма мигрирует на большое расстояние: весной, когда температура реки поднимается выше 15º, она идёт вверх по течению реки, смешиваясь с местной жилой формой, а осенью, когда температура падает и начинается листопад, спускается вниз.

Горная и предгорная популяции отличаются между собой некоторыми морфологическими признаками: так, например, антедорсальное расстояние у горной форели большей частью превышает постдорсальное, а у предгорной форели имеется обратное соотношение; предгорная форель отличается быстрым темпом роста и относительно большим весом (Эланидзе, 1983).

Исследователи кавказских форелей (Барач, 1941; Владимиров, 1948; Абдурахманов, 1962; цит. по Шарвашидзе, 1984) указывают, что все они по ряду признаков отличаются друг от друга и вряд ли можно найти популяции форелей, населяющие соседние реки и ни в чём не отличающиеся друг от друга.

.6 Основное представление о генофонде кумжи

Кумжа представляет собой наиболее исследованный в популяционно-генетическом плане вид лососей. Наиболее важными популяционно-генетическими показателями являются уровень общей гетерозиготности, внутри- и межпопуляционного генного разнообразия. Эти показатели, полученные аллозимными методами, представлены в табл.1.

А. Фергюсон обобщил известные к концу 1980 годов данные о внутрипопуляционной аллозимной изменчивости кумжи (Ferguson, 1989; цит. по: Алтухов, 2004). Наблюдаемая гетерозиготность популяций колеблется по ареалу от 0 до 0,122 (в среднем 0,047), а доля полиморфных локусов от 0 до 0,398 (в среднем 0,160). Интересно, что в двух небольших озёрах Шотландии обнаружены популяции кумжи, оказавшиеся мономорфными как по белковым, так и по ДНК маркерам (мтДНК, моно- и мультилокусные минисателлитные локусы) (Prodohl et al., 1997; цит. по: Алтухов, 2004).

кумжа форель рыба анадромный генофонд

Таблица 1. Оценка генетического разнообразия по аллозимным локусам у кумжи Salmo trutta L.

Если величины общего генного разнообразия, НТ, вполне соизмеримы у кумжи и других видов лососей, то величина региональной межпопуляционной компоненты генного разнообразия у неё значительно выше, достигая в группах популяций из водоёмов Франции и Испании 50 ─ 60% (Krieg, Guyomard, 1985; Presa et al., 1994; Garcia-Marin et al., 1991; цит. по: Алтухов, 2004). В целом в атлантической части ареала кумжи межпопуляционное генное разнообразие составляет 60% (Ferguson, 1989; цит. по: Алтухов, 2004).

Особенно значительна генетическая дифференциация между совокупностями популяции северных и южных районов на территории бывшего СССР и североатлантического и средиземноморского бассейнов на территории Западной Европы (Krieg, Guyomard, 1985; Presa et al., 1994; Estoup et al., 1993; цит. по: Алтухов, 2004.)

В северных популяциях показатель GST в целом ниже, чем в южных. Это объясняется тем, что в южных регионах обитают популяции кумжи, во-первых, более древние из-за отсутствия здесь оледенений и соответственно с более длительным периодом дивергенции, а во-вторых, гидрографически связанные с разными морскими бассейнами ─ североатлантическим и средиземноморским. Действительно, согласно иерархическому анализу, существенная часть межпопуляционной компоненты генного разнообразия обусловлена дифференциацией между совокупностями популяций относящихся к этим основным морским бассейнам (табл. 2.)

Таблица 2. Межпопуляционное генное разнообразие GST (%) в природных популяций кумжи Salmo trutta L. Франции и Испании

Как видно из приведённых оценок GST, дифференциация популяций внутри «бассейновых» группировок выше, чем между самими группировками. Наиболее велика межпопуляционная изменчивость в этих регионах по локусам СК-2*, GPI-2*, MEP-1* и -3*, а среди популяций североатлантического бассейна ─ по PEP-LT*, LDH-5*, GPI-2*, LDH-1* (Алтухов, 2004).

Весьма рельефной оказывается у кумжи генетическая дивергенция на микрогеографической шкале, т. е. между субпопуляциями, населяющими притоки одной реки, бассейн небольшого озера или залива (Ryman et al., 1979; 1983; Ryman, 1981; Ferguson, Mason, 1981; Ferguson, 1989, Махров и др., 1999; цит. по: Алтухов, 2004); аналогичные результаты демонстрирует также анализ мтДНК и микросателлитных локусов (Hansen, Loeschke, 1996; Estoup et al., 1998; Hansen, Mensberg, 1998; цит. по: Алтухов, 2004). Более того, с помощью микросателлитных локусов у кумжи обнаруживается тонкая структурированность в пределах одной локальности (Ruzzante et al., 2001; цит. по: Алтухов, 2004).

Генетическое своеобразие субпопуляций кумжи наблюдается в отсутствии каких-либо изолирующих физических барьеров и сопровождается хорошо выраженной морфологической и экологической дифференциацией. Поэтому можно говорить о высокой степени хоминга у кумжи, обеспечивающего репродуктивную изоляцию.

В распределении аллелей отдельных локусов по ареалу кумжи наблюдаются определённые закономерности, отражающие, как полагают, историю происхождения современных популяций в ходе послеледникового заселения Северной Европы, начавшегося 10-18 тысяч лет назад (Ferguson, 1989; цит. по: Алтухов, 2004).

Предполагается, что картина географического распространения аллелей локуса LDH-5 (*100 и *90) в определённой степени обусловлено историей этого заселения. Так, среди популяций кумжи, связанных с бассейнами Средиземного, Чёрного и Каспийского морей, в локусе LDH-5 фиксирован аллель 100* , тогда как в популяциях бассейнов Балтийского и Белого морей встречаются оба аллеля *100 и *90 (Осинов, 1984; 1988; 1990; Ferguson, 1989, Garcia-Marin, Pla, 1996; цит. по: Алтухов, 2004). Была предложена гипотеза о том, что Северная Европа заселялась двумя «расами» кумжи. Первая, по-видимому, более древняя раса, обладавшая аллелем LDH-5 *100, могла распространяться из рефугиума, находившегося в бассеине Бискайского залива. Вторая, более молода раса, обладавшая аллелем LDH-5 *90, могла расселяться из рефугиума (ов), располагавшегося в бассеинах Балтийского или Белого морей, и вытеснять в той или иной мере «древнюю» расу (Ferguson, Fleming, 1983; Hamilton et al., 1989; цит. по: Алтухов, 2004). Таким образом, присутствие аллеля *90 в популяциях кумжи трактуется, как указание на их, возможно более позднее происхождение. Кроме того не исключается, что аллель *90 имеет определённые селективные преимущества в ряде северных популяций (Henry, Ferguson, 1985; Ferguson, 1989; Зелинский, Груздев, 1992; Махров и др., 1994; цит. по: Алтухов, 2004).

Позднее, в результате обобщения информации о географическом распространении по ареалу аллелей 11 аллозимных локусов, была предложена модель послеледникового расселения трёх основных филогенетических линий кумжи, обитавших в изолированных рефугиумах. Постулировалось, что расселение шло: 1) из Каспийско-Средиземноморского рефугиума на северо-запад; 2) из Атлантического рефугиума в районах Пиренейского полуострова и южной Франции в северном направлении; 3) из района Ла-Манша на север и восток (Garcia-Marin et al., 1999; цит. по: Алтухов, 2004).

Исследование митохондриального ДНК в популяциях кумжи позволили уточнить историю их формирования и показали, что в некоторых районах послеледниковое расселение кумжи могло быть более сложным, чем представлялось ранее (McVeigh et al., 1995; Hynes et al., 1996; Hansen, Loeschcke, 1996; цит. по: Алтухов, 2004). При анализе кодирующих и некодирующих сегментов мтДНК в выборках, охватывающих весь видовой ареал, обнаружено 5 основных филогенетических линий, составляющих современный митохондриальный генофонд кумжи (Giuffra et al., 1994; Bernatchez, Osinov, 1995; цит. по: Алтухов, 2004). Популяции атлантического бассейна принадлежат к одной ─ атлантической линии, а популяции бассейнов Чёрного, Каспийского, Аральского и Дуная относятся к дунайской линии. Все остальные типы митохондриального ДНК подразделяются ещё на три филогенетические группы, найденные в популяциях средиземноморской территории от Испании до Турции. Общий уровень дивергенции между этими линиями соответствует временным рамкам в 0,5 ─ 2 млн. лет, т.е. периоду плейстоценовых оледенений, сопровождавшихся климатическими и географическими преобразования среды (Bernatchez, 2001; цит. по: Алтухов, 2004). Анализ полной нуклеотидной последовательности контрольной области мтДНК выявил дивергенцию и внутри атлантической линии ─ между нативными испанскими и северо-атлантическими популяциями (Corney, Garcia-Marin, 2002; цит. по: Алтухов, 2004).

Интересно, что на территории Пиренейского полуострова найдены три из пяти названных выше филогенетических линий мтДНК, а также группа эндемичных гаплотипов (Suarez et al., 2001; цит. по : Алтухов, 2004). Очевидно, что именно в этом рефугиуме сохранились остатки наиболее древних популяций кумжи, обладающих максимальным генетическим разнообразием, о чём свидетельствуют данные и по аллозимам (Sanz, 2000; цит. по: Алтухов, 2004), и по мтДНК (Weiss et al., 2000; Suarez et al., 2001; цит. по: Алтухов, 2004). При существующем антропогенном давлении перспективы дальнейшего выживания этих популяций проблематичны, если не будут приняты специальные меры для охраны этого уникального генофонда (Алтухов, 2004).

Кумжа, как уже отмечалось, ─ один из наиболее изученных и изучаемых в популяционно-генетическом плане видов рыб, на котором отрабатывается применение новейших молекулярных методов анализа изменчивости (Ferguson et al.,1995; цит. по: Алтухов, 2004). Именно для групп популяций кумжи из разных участков ареала, изучавшихся по аллозимным генам, получены оценки межпопуляционной генетической изменчивости (FST) на основе полиморфизма фрагментов мтДНК и минисателлитных локусов. Сравнение показывает, что оценки FST по аллозимным и минисателлитным локусам весьма сходны, но могут оказаться как сходными, так и отличающимися от оценок FST по мтДНК (с учётом гаплоидности митохондриального генома) (Ferguson et al.,1995; Laikre et al., 1995; Estoup et al., 1998; цит. по: Алтухов, 2004).

Оценки FST, полученные для популяций кумжи по отдельным минисателлитным локусам (селективно нейтральные участки генома), довольно близки между собой, как и должно быть для нейтральных маркеров (Ferguson et al.,1995; цит. по: Алтухов, 2004). Следовательно, и усреднённый по многим аллозимным генам величины FST, будучи сходными с соответствующими величинами по минисателлитам, также могут рассматриваться как оценки уровня селективно нейтральной дифференциации. Но величины FST, полученные по отдельным аллозимным генам, в отличие от оценок по минисателлитам, варьируют гораздо сильнее, что, очевидно, служит указанием на разнообразие селективной значимости аллозимных генов (Алтухов, 2004).

Наконец, приведём для кумжи усреднённые по регионам величины основных популяционно-генетических показателей: величина общего генного разнообразия НТ = 0,0837, величина внутрипопуляционного генного разнообразия (HS) равна 0,0526 и величина межпопуляционного генного разнообразия (GST) составляет 37,10 (Алтухов, 2004). Для сравнения приведём аналогичные показатели для других видов лососевых (табл. 3) (Алтухов, 2004).

Таблица 3. Усреднённые по регионам величины общего генного (НТ), внутрипопуляционного (НS) и межпопуляционного (GST) разнообразия.

Из этих данных видно, что у разных видов общий уровень гетерозиготности варьирует не более, чем в три раза, тогда как межпопуляционная компонента изменчивости отличается между видами более, чем на порядок величины, достигая своего максимума у кумжи. Представленные виды можно ранжировать по степени пространственной генетической дифференциации в следующий ряд: горбуша < нерка <семга < кумжа (Алтухов, 2004).

1.7 Искусственное воспроизводство и хозяйственное значение

В настоящее время мировые масштабы искусственного воспроизводства лососей составляют более 5 млрд. экземпляров молоди, что примерно равно 20% от общего количества скатывающейся в море молоди лососей (Алтухов, 2004). Бурно развивается аквакультура ─ садковое (товарное) выращивание лососей на специальных фермах. При этом неизбежным представляется генетическое последствие искусственного разведения. Эти последствия можно выявить при сравнении природных и искусственно поддерживаемых популяций атлантических лососей ─ сёмги Salmo salar и кумжи S. trutta ─ обнаруживаются два противоположно направленных процесса, связанных с перераспределением внутри- и межгрупповой компонент генного разнообразия (Табл. 4).

Таблица 4. Генетическая изменчивость природных и заводских популяций лососей

Так, у сёмги, воспроизводимой на рыбоводных заводах, межпопуляционная генетическая дифференциация существенно выше, а внутрипопуляционный полиморфизм ниже, чем в природных условиях. Прямо противоположная, но ещё более рельефная картина характерна для испанских и французских стад кумжи. Очевидно, что в случае с сёмгой рыбоводная деятельность приводит к нарастанию инбридинга, чему способствует малая численность производителей, используемых для воспроизводства (Stahl, 1987; цит. по: Алтухов, 2004). В случае же кумжи нарастание внутрипопуляционной гетерозиготности и стирание межпопуляционной генетической дифференциации (табл. 4) есть следствие либо перемешивания генофондов различных по происхождению маточных линий, либо отбора в пользу гетерозигот (Krieg, Guyomard, 1985; Gacia-Marin et al., 1991; цит. по: Алтухов, 2004). В случае с сёмгой наблюдаются последствия инбридинга, а в случае с кумжей ─ аутбридинга (Altukhov, Salmenkova, 1994; цит. по: Алтухов, 2004). Отрицательные последствия инбридинга хорошо известны, тогда как соответствующие данные об аутбридинге довольно скудны. Например, есть сведения, что гибридизация заводских и природных стад кумжи разрушает репродуктивную изоляцию популяций (Ryman, 1983; цит. по: Алтухов, 2004).

В целом, выявление противоположных генетических процессов, сопровождающих искусственное разведение, свидетельствует о том, что при этом может нарушаться равновесие между инбридингом и аутбридингом, которые взаимно уравновешивают друг друга в условиях нормального воспроизводства дифференцированного генофонда (т. е. в нативных системах популяций) (Алтухов, 2004).

В мировых масштабах лососевые имеют важное промысловое значение. По данным Г.П. Барача (1960), в Абхазском АССР начало учётов уловов лосося связано с основанием в 1935 году лососевого рыбоводного завода на р. Чёрной (ЧРЗ). В результате искусственного разведения в период с 1935 по 1940 гг. и усиления охраны нерестовых рек запасы и уловы лосося стали быстро возрастать, достигнув в 1939 г. до 90 центнеров (Барач, 1960).

Искусственное разведение лосося было прервано в 1940 году в связи с войной и возобновлено после её окончания в 1945 г. В результате прекращения работ по разведению лосося, ослабления охраны нерестовых рек и развития хищнического браконьерского лова на реках, с применением взрывчатых и отравляющих веществ, запасы лосося сильно сократились; резко снизились промысловые уловы ─ в среднем до 13 центнеров в год в период 1945─1953 годов (Барач, 1960).

С 1955 года ЧРЗ, временно находясь в ведении Азчеррыбвода (Краснодар), фактически прекратил работы по воспроизводству лососевых запасов, вошёл в состав Чернореченского форелевого хозяйства и превратился в экспериментальную базу для тематических работ кафедры рыбоводства Мосрыбвтуза. В связи с этим численность речного лососевого населения реки Мчишта за эти годы сократилась в 18 раз, сильно сократились и уловы лосося на морских промыслах Грузрыбпрома, практически лосось потерял промысловое значение (Барач, 1960).

Рыбопродуктивную площадь лососево-форелевых рек Абхазии Г.П. Барач (1960) определяет ориентировочно в 18 тысяч гектаров, их возможную, при рациональном рыбохозяйственном использовании на основе широкого развёрнутого лососеводства-форелеводства, рыбопродукцию в 100 тыс. центнеров высококачественной рыбы ─ лосося и форели (Барач, 1960).

.8 Охрана вида

Несмотря на активное искусственное воспроизводство кумжи увеличения её запасов не происходит, численность диких популяций продолжает снижаться. Это вызвано как широким распространением и интенсивным проявлением синдрома М-74 на рыбоводных заводах ряда стран, так и нарушением экологического состояния фиордов и заливов, где в течение нескольких лет активно развивалось садковое разведение лососевых, так и утратой нерестовых рек в результате гидростроительства и лесосплава. Во всех странах в текущем столетии сократилось количество нерестовых рек, уменьшились площади нерестилищ. Результатом этого стало значительное сокращение численности смолтов.

Все подвиды кумжи резко сократили свою численность и внесены в Красную книгу Российской Федерации 2001 года.

Обыкновенная кумжа (Salmo trutta trutta) - как проходная, так и пресноводная (форель) формы из бассейнов Балтийского моря включена по категории 2 как сокращающиеся в численности популяции. Сюда включены проходная форма из Финского залива и Калининградской области, озерная форель из бассейнов Ладожского, Онежского и некоторых озер Карелии, а также речная форель из небольших рек и ручьев Карелии, Ленинградской, Псковской, Новгородской, Вологодской, Тверской и Калининградской областей. В настоящее время численность всех форм и популяций Балтийского моря постоянно сокращается, в некоторых водоемах они исчезли совсем.

Причины падения численности - строительство гидроэлектростанций, незаконный вылов, дренажные работы, сокращение площадей озер и их загрязнение.

Меры охраны: мелиорация нерестилищ, реконструкция нарушенных мест обитания, искусственное воспроизводство, криоконсервация геномов.

Проходная форма черноморской кумжи (Salmo trutta labrax) относится к категории 1, как находящаяся под угрозой исчезновения. Эта кумжа всегда была немногочисленной, но ценной промысловой рыбой. Ранее ежегодно у берегов Грузии ее добывали по 9 т. Сейчас же она повсеместно редка.

Причины резкого сокращения численности - нерегулируемый промысел, гидростроительство, загрязнение и браконьерство.

Меры охраны - искусственное воспроизводство и криоконсервация геномов. При восстановлении запасов особое внимание следует обратить на речную форель, так как в ряде случаев они образуют единое нерестовое стадо.

Проходная форма предкавказской кумжи (Salmo trutta ciscaucasicus) из бассейна

Каспийского моря также проходит по категории 1 как находящаяся под угрозой исчезновения. На территории России это кумжа из рек Терек, Самур и крайне редко Волга и Урал. Если раньше уловы были до 620 т в год, то в 1970 г выловили всего 5 т. В настоящее время ее численность на территории России не определялась.

Причины резкого сокращения численности - нарушение естественного воспроизводства после строительства плотин, нерациональный промысел и браконьерство.

Меры охраны искусственное воспроизводство с выпуском молоди на стадии смолта и криоконсервация геномов.

Неопределенная по статусу ручьевая форель из верховьев Волги и Урала имеет статус 4 - неопределенные по статусу жилые формы кумжи в виде ручьевых форелей. В последние годы отмечается повсеместное сокращение численности.

Причины - изменение экологической ситуации в верховьях рек и ручьев, загрязнение вод и интенсивный вылов. Мер охраны пока нет, кроме тех мест, которые относятся к заповедным.

Эйзенамская форель (Salmo trutta ezenami) относится к категории 2 - сокращающаяся в численности форма озерной форели, узкоареальный эндемик. Численность ее всегда была невелика, особенно крупной формы. До конца 1960-х годов численность оставалась относительно стабильной. В начале 1970-х в озеро вселили голавля, который стал поедать молодь форели.

Причины резкого сокращения численности - вселение нового вида и активное освоение озера человеком.

Меры охраны - сокращение численности голавля, искусственное воспроизводство (особенно крупной формы) и создание зоны особо охраняемой территории на оз. Эйзенам.

Аральская кумжа (Salmo trutta aralensis) относиться к категории 1. Это самая восточная форма проходной кумжи, ныне, по-видимому, исчезнувшая.

Населял Аральское море, встречаясь повсеместно единичными экземплярами, и Амударью. Ранее считали, что выше Турткуля лосось по реке не поднимался. Сейчас известны факты, позволяющие предполагать, что отдельные особи поднимались на нерест в верховья Амударьи и заходили в ее притоки - Кафирниган и Вахш. В Сырдарье не был отмечен.

В 1935-1937 гг. в Аральском море ежегодно вылавливалось до 10 особей. В последующем случаи поимки не известны. Основные лимитирующие факторы ─ зарегулирование и сокращение стока Амударьи, падение уровня и осоленение

Аральского моря.

Нерестилища аральского лосося в верховьях Амударьи, очевидно, частично совпадали с нерестилищами его жилой формы - амударьинской форели. В связи с этим, а также учитывая тот факт, что проходные и жилые формы кумжи в определенных условиях переходят друг в друга, амударьинская форель может служить резерватом для восстановления популяции проходного аральского лосося.

Вылов данной рыбы запрещен. С 1978 года внесена в Красную книгу Казахстана. Внесена в Красную книгу СССР (1984) по I категории.

Необходимыми мерами охраны являются: организация искусственного разведения, лимитирование любительского лова амударьинской форели.

Форель ручьевая, обитающая в реках Татарстана, внесена в Красную книгу и относится к категории 1. Она редкая, находится на грани исчезновения. На этой территории обитает только пресноводная форма. В конце XIX в. ручьевая форель была обычна в притоках р. Свияги, встречалась в реке Морквашке несколько выше г. Казани. В настоящее время ловиться рыбаками любителями в локальных участках некоторых притоков реки Камы в единичных случаях (Щеповских, 2006).

Лимитирующими факторами для данной формы являются: загрязнение вод малых рек и ручьев промышленными и сельскохозяйственными стоками, различные виды хозяйственной деятельности человека, в результате которых сокращается количество пригодных биотопов для обитания форели.

Меры охраны: охрана и восстановление малых рек и ручьев, прекращение всех видов их загрязнения, восстановление количества рыб за счёт искусственного воспроизводства и прудового рыборазведения.

Ручьевая форель занесена и в Красную книгу Башкортостана; статус ─ 3 категория - малочисленный вид, имеющий спорадическое распространение.

В Республике Башкортостан обитает в реках горно-лесной зоны: Узяне, Нугуше и Зигане и их притоках; в Зауралье в притоках р. Урал - Малом Кизиле и Янгельке. Изредка в верховьях речек Бугульминско - Белебеевской возвышенности, относящихся к бассейнам рек Демы и Ик.

Никто из исследователей не отмечает значительных по численности стад ручьевой форели. Считается, что на всем Урале обитает не более 10 тысяч экземпляров этого вида. Лимитирующие факторы: загрязнение малых речек, перелов туристами.

Мерами охраны являются: предотвращение загрязнения рек и речек, охрана от браконьеров в период нереста и в особо жаркую погоду.

В реках и ручьях Абхазии ручьевая форель, достаточно часто встречающаяся рыба,

особенно в верхних течениях. Точных научных данных о сокращении численности ручьевой форели в пределах Абхазии нет; можно лишь по косвенным причинам (загрязнение рек, браконьерство, сокращение численности многих других видов рыб и др.) предположить, что численность может иметь тенденцию к сокращению.

Глава 2. Материалы и методы исследований

.1 Определение возраста рыб по чешуе

Материалом исследования служили форели, выловленные в октябре 2009 года (4 особи) в р.Кодор и выловленные в июне и августе 2010 г.(27 особей) в р.Том (приток р.Ингур).

У многих рыб возраст определяют по чешуе. Данная методика оправдана и для лососёвых рыб. Для определения возраста рыб чешую рыб берут с середины бока рыбы, выше или ниже боковой линии. Чешуя помещается в чешуйную книжку, в которой приводятся биологические данные анализируемой рыбы. Собранную чешую хранят в сухом месте. При определении возраста чешую промывают в разведённом нашатырном спирте в воде и очищают от покрывающей её слизи. Возраст определяют обычно по передней части чешуи при увеличении под микроскопом (Пряхин и др., 2006) (Приложение 2).

Форма склеритов и их расположение у разных рыб неодинаковы. Летом при быстром росте чешуи откладываются более широкие склериты и расстояние между ними больше, чем при медленном росте чешуи в конце лета или осенью. При просмотре чешуи нам представляется картина смены широких раздвинутых склеритов узкими и сближенными. Широкие и узкие склериты, образовавшиеся в течение года, составляют годовую зону роста чешуи. Годовые зоны роста чешуи следуют друг за другом вокруг центра, и их число соответствует количеству лет, прожитых рыбой. Граница между тесно расположенными склеритами осеннего роста и широко раздвинутыми склеритами весенне-летнего роста называется годовым кольцом (Пряхин и др., 2006).

Годовые кольца замкнуты, идут параллельно окружности чешуи и образуются на границе тесно расположенных склеритов осенне-зимнего роста и раздвинутых склеритов весенне-летнего роста. В зависимости от времени определения возраст рыб обозначают по разному. В конце зимы и весной (до начала нереста популяции) возраст обозначают числами по количеству годовых колец с добавлением точки в верхней части цифр или слова «годовики». Летом и осенью цифрами обозначают количество полных колец, добавляя знак «+» или слово «летки». Знаком «+» обозначают прирост последнего сезона нагула.

При обозначении возраста лососей сначала ставится число лет, проведённых в реке, а затем проведённых в море. Например, 2+ + 3+. Иногда обозначение может быть более сложным: 3+ + 1+ SM + 1+. Это значит, что лосось провёл 3 года в реке, затем один год в море, потом нерестился в реке (знак SM) и снова один год провёл в море.

.2 Изучение морфологических характеристик рыб

Морфометрической обработке были подвергнуты форели, выловленные в октябре 2009 года в р.Кодор, и форели, выловленные летом (в июне и августе) 2010 г. в р.Том (приток р.Ингур).

При промерах лососей обычно пользуются схемой Смитта, который дал богатейший материал по систематике лососёвых.

Для морфометрического исследования изучаемых особей использовали некоторые общепринятые признаки в систематике лососёвых рыб: длина тела абсолютная (L1), длина тела до конца средних лучей (L2), длина тела до корней средних лучей (L3), длина головы (С), длина рыла (R), длина хвостового стебля (Fr), ширина рыла (SR), диаметр глаза (Y), высота головы (HC) (Приложения 3 и 4).

Длина тела абсолютная (L1), или длина всей рыбы, исчисляется от конца рыла до середины линии, соединяющей концы верхней и нижней лопасти хвостового плавника.

Длина тела до конца средних лучей (L2) ─ расстояние от вершины рыла, т.е. от передней, наиболее удалённой точки тела при закрытом рте, до конца средних лучей хвостового плавника.

Длина тела до корней средних лучей (L3) ─ расстояние от конца рыла до корней средних лучей хвостового плавника или до конца чешуйного покрова.

Длина головы (С) ─ расстояние сбоку от вершины рыла (при закрытом рте) до заднего наиболее удалённого края жаберной крышки.

Длина рыла (R) ─ предглазничный отдел ─ пространство головы от вершины рыла до переднего (наружного) края глазного яблока.

Длина хвостового стебля (Fr) ─ расстояние от заднего края анального плавника до основания хвостового плавника или до конца чешуйного покрова.

Ширина рыла (SR) ─ горизонтальное расстояние между краями рыла.

Диаметр глаза (Y) ─ собственно диаметр роговицы, обычно берётся горизонтальный.

Высота головы (HC) у затылка ─ верхняя точка берётся там, где оканчивается череп. Нижняя ─ противоположная ей по вертикали. Обычно верхняя точка находится там, где оканчивается чешуйчатый покров.

Значительная часть повторяющейся (сателлитной) ядерной ДНК состоит из тандемно повторенных копий так называемых коровых (от англ. сore ― ядро) последовательностей. В семействах таких тандемных повторов особое внимание исследователей в качестве генетических маркёров получили минисателлиты, состоящие из повторяющихся копий («мотива») длиной от 9-10 до сотни нуклеотидов каждая, и микросателлиты, повторяющиеся копии которых обычно имеют длину от 1 до 4, иногда 6 нуклеотидов. Микросателлиты обозначаются также как SSR (simple sequence repeat) или STR (short tandem repeat). Минисателлитный локус может насчитывать от двух до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус ― от 10 до 100 повторов. Предложена гипотеза об эволюционном происхождении минисателлитов из микросателлитов. Индивидуальные аллели этих локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.

Анализ индивидуальных микросателлитных локусов осуществляют с помощью ПЦР-амплификации, используя праймеры, комплементарные уникальным последовательностям (доменам), которыми фланкирован каждый микросателлитный локус. Далее электрофорезом в полиакриламидном геле определяют «размер» его аллелей, сравнивая с набором стандартных фрагментов ДНК известной длины.

Ряд перечисленных ниже свойств делает эти локусы весьма удобными генетическими маркёрами, обладающими большими возможностями (Wright, 1993).

. Оба типа локусов в очень большом количестве рассеяны по геному; например, грубая оценка числа микросателлитов (GT)n и (CT)n в геноме кумжи Salmo truttaL. составляет 109000 и 33000 соответственно.

. Эти локусы в основном локализованы в некодирующих регионах генома и, следовательно, должны быть селективно нейтральны. Это общее правило, видимо, имеет и исключения в случае тесного сцепления с адаптивно значимыми генами. Хотя точные функции мини- и микросателлитов неизвестны, ряд фактов говорит о том, что они могут служить кодирующими или регуляторными элементами.

. Для этих локусов характерна быстрая эволюция. Скорость спонтанного мутирования мини- и микросателлитных локусов составляет около 10―2 ― 10―4 на локус за поколение, что гораздо больше, чем у аллозимных генов ― около 10―5― 10―6. Поэтому, если дивергенция по аллозимным генам обусловлена только дрейфом, то по мини- и микросателлитным локусам ― и дрейфом и мутациями. Гетерозиготность по минисателлитам может более чем на порядок превышать аллозимную, достигая почти 100%, тогда как по микросателлитам встречается разный уровень полиморфизма, хотя, как правило также выше аллозимного.

. Микро- и «однолокусные» минисателлиты обладают менделевским кодоминантным наследованием.

. Микросателлиты одинаковы у близких видов, что позволяет использовать одни и те же праймеры и сходные протоколы анализа.

. Для анализа микросателлитов требуется очень малое количество крови или какой-либо ткани организма, поэтому возможно прижизненное взятие образцов (у рыб, например, пригодны также высохшая чешуя, отолиты).

. Возможен автоматизированный анализ микросателлитов.

Используются мини - и микросателлитные локусы в самых различных генетических исследованиях в связи с их высокой скоростью мутирования, большим аллельным разнообразием и гетерозиготностью.

Микросателлитные маркёры нередко выявляют генетическую дифференциацию в тех случаях, когда она не обнаруживается по аллозимным маркёрам, например, у организмов с низкой изменчивостью ферментных локусов, у подвижных морских рыб, на микрогеографической шкале, среди близкородственных популяций или экологических групп одного вида. Высокое аллельное разнообразие микросателлитных локусов, которое позволяет идентифицировать с их помощью потомство конкретных родителей не только в первом, но и в последующих поколениях, открывает возможность для исследования репродуктивного успеха и приспособленности среди особей, отличающихся биологическими и экологическими характеристиками.

В то же время следует указать, что микросателлитные локусы непригодны для эволюционных построений (филогении) на межвидовом и более высоких уровнях, так как наблюдаемое при этом сходство в величине аллелей может отражать не идентичность их происхождения, а так называемую гомоплазмию. Это явление возникает из-за высокой скорости мутирования, когда микросателлитные аллели одинакового размера образуются в результате конвергенции от разного числа прямых или обратных мутационных событий. Ещё одна проблема, с которой сталкиваются при анализе микросателлитов, ― наличие нулевых аллелей, появляющихся вследствие мутаций в сайте связывания с праймером, что не позволяет точно идентифицировать генотипы (Алтухов, 2004).

.3.1 Выделение тотальной ДНК

Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, нужно получить их в относительно чистом виде. Перед выделением ДНК образец ткани (часть хвостового плавника рыбы) извлекали из коллекционной пробирки и ножницами отделяли фрагменты необходимого размера. Мелкие фрагменты исследуемой ткани затем переносили в отдельную чистую пробирку.

Для экстракции ДНК применяли солевой метод (модифицированный) (Приложение 5). Для выделения ДНК этим методом необходимы следующие компоненты:

. лизирующий буфер.

. раствор протеиназы К (20 мг/мл)

. раствор 6М NaCl

. изопропанол

. 70% этанол

. бидистилят

Состав лизирующего буфера следующий: 0,4М NaCl; .01M TrisHCl (pH8.0); 2 mM EDTA (pH 8.0); 2% SDS.

На 100 мл лизирующего буфера приходятся следующие компоненты:

мкл             4М-ого NaCl

мкл                      1М-ого TrisHCl (pH 8.0)

мкл             0,5М-ого EDTA (pH 8.0)

мкл             20%-ого SDS

,6 мл           воды

SDS (додецилсульфат) ─ поверхностно-активное вещество, создающее на белках сильный отрицательный заряд, вследствие чего происходит их денатурация и отделение от нуклеиновых кислот. Вызывает разрушение структуры мембран, вследствие разрушения её белковых составляющих.

EDTA (этилендиаминтетраацетат) ─ хелатирующий агент, связывающий ионы металлов переменной валентности; используется для устранения ингибирования катализируемых ферментами реакций следовыми количествами тяжёлых металлов.

Для выделения ДНК данным методом необходимо осуществить следующие процедуры:

. навеску ткани поместить в 1,5мл-ую пробирку с 400 мкл лизирующего буфера и 2 мкл раствора протеиназы К. Оставить для лизиса на ночь или 2-3 часа при температуре +580С и периодическом перемешивании.

. к лизату добавить 300 мкл 6М NaCl, перемещать 30с на вортексе и осадить центрифугированием при 10тыс./мин. в течение 30мин.

. отобрать в чистые пробирки верхнюю фазу (около 600мкл), стараясь не трогать возможную липидную пленку сверху.

. к верхней фазе прилить 600 мкл изопрапанола для осаждения ДНК. Смешать. Оставить при минус 200С на 20 минут.

. отцентрифугировать при 10тыс./мин. в течение 20мин.

. отобрать изопрапаноловый спирт, промыть осадок 70%-ым этанолом, добавляя 500 мкл этанола и центрифугирования при 12тыс./мин. в течение 12мин.

Осадок ДНК должен быть белым или бесцветным, поэтому цветной осадок 70%-ым этанолом можно промыть неоднократно.

. спирт слить, подсушить осадок в течение 5-10 минут при 370С.

. растворить осадок в бидистиляте в течение 10 минут при 500С.

.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода полимеразной цепной реакции (Polymerase chain reaction) был разработан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госэпидемнадзора. Метод очень эффективен для изучения полиморфизма ДНК. Он позволяет относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Для реализации ПЦР необходимы следующие компоненты:

― ДНК-матрица (ДНК или её часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

― праймеры (синтетические олигонуклеотиды, включающие 20-30 пн, комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента);

― смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), т. е. смесь четырёх дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

― фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из термофильных бактерий Thermis aquaticus, катализирующая удлинение цепей праймеров путём последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

― буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Мg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Нами были использованы пять праймеров для выявления микросателлитных локусов, характеристики которых отображены в таблице 5.

ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах (Приложение 1):

.        денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93- 95°С в течение 30-40 сек.

. присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига ― 20-60 сек.

. достраивание цепей ДНК (синтез новых цепей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5/- конца к 3/- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Процесс синтеза, катализируемый Taq-полимеразой, проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза 20-40 сек.

Таблица 5. Характеристика микросателлитных локусов

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n ― число циклов амплификации (экспотенциальное увеличение числа цепей). Поэтому, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт” (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. Для этого применяется HotTaq полимераза (химически модифицированная), которая неактивна до начала ПЦР.

На отжиг праймеров, кроме температуры, влияет концентрация MgCI2. Высокая концентрация MgCI2 увеличивает образование неспецифических продуктов амплификации, а недостаток концентрации данного компонента снижает выход необходимого количества ПЦР-продуктов. На эффективность использования ПЦР, кроме концентраций необходимых компонентов и температурного режима, влияет и особенность работы конкретного амплификатора.

.3.3 Электрофорез

Молекулы ДНК представляют собой полианионы, которые в электрическом поле движутся к аноду. ДНК (одно- и двухцепочечные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные. Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорционально их длине. После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия.

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле продуктов ПЦР необходимы следующие реактивы:

·        3%-ый APS

Аммоний персульфат            0,2г

Дистиллированная вода                  5мл

·        30%-ый акриламид:бисакриламид 29:1

Акриламид                             29г

N,N’-Метилен-бис-акриламид         1г

·        Краска для нанесения проб

Глицерин                                         30г

Бромфеноловый синий                            250мг

Ксиленцианол                                 250мг

Дистиллированная вода                  70мл

·        10-кратный ТВЕ-буфер

Трис-НСl                                         54г

ЭДТА-натриевая соль                     4,65г

Борная кислота                               27,5г

Дистиллированная вода                  до 500мл

Разделяющий 6%-ый ПААГ (заливка стекол). На 100 мл (2 стекла) необходимо:

%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 20мл

х ТВЕ 10мл

%-ый APS 4 мл

Н2О 66мл

ТEMED 60мкл

%-ый ПААГ (пробка). На 8 мл (2 стекла) необходимо:

х ТВЕ 800мкл

%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 7,2мл

%-ый APS 400мкл

ТEMED 10мкл

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле осуществляли следующие процедуры.

. Подготовка камеры для вертикального электрофореза (Приложение 6 и 7).

Собирали камеру для вертикального электрофореза на два геля. Если необходим только один гель, вторую пару стекол заменяли одним квадратным стеклом. Важно, чтобы стекла были чистыми без ворсинок и пятен. На стол плашмя клали остов камеры, накрывали его стеклом с «рогами», совмещая с боковыми и нижним контурами остова. Вдоль боковых сторон стекла помещали по спейсеру и накрывали стеклом без выемки. Совмещали с помощью скальпеля края стекол и спейсеров, так чтобы последние не выглядывали (особо нижний край). Закрепляли стекла на остове прищепами «бульдог» по середине. Переворачивали конструкцию закрепленными стеклами на стол и повторяли процедуру с другой парой стекол. Окончательно выравнивали стекла так, чтобы поставленная на ровную поверхность камера не качалась. После этого закрепляли стекла с каждой стороны еще двумя парами «бульдогов». Камера готова к работе.

. Проводили пролимеризацию полиакриламидной пробки. Для этого на ровную поверхность (например, нижняя сторона поддона от камеры) наносили по разметке две дорожки 26%-ого ПААГ и вдоль них опускают дно камеры. Гель поднимается между стеклами на высоту около 1 см. Для застывания гелевой пробки камеру оставляли на 20 минут. Затем камеру с пробкой заливали разделяющим 6%-ым ПААГ. Для удобства гель рекомендуется заливать 20 ил 10-кубовым шприцем по внутренней стороне цельного стекла. Верхняя граница геля должна совпадать с верхней границей «рогатого» стекла. Заливали гель равномерно, стараясь не допускать попадания пузырьков воздуха. Сверху между стекол вставляют гребенку, ориентируясь по верхнему краю рогатого стекла, и давали гелю застыть около 1 часа. Камеру с гелем помещали в поддон и заливали её и ёмкость поддона 1-кратным ТВЕ буфером. Гребенки вынимали строго вертикально. Через клеммы камеру подключали к источнику питания.

. Префорез. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при постоянной силе тока 100 мА в течнение 30 минут.

. Нанесение проб на гель. Во избежание искривления дорожек пробы желательно не наносить в самые крайние слоты.

ПЦР-пробу смешивали с красителем в соотношении примерно 2:0,5, отбирали от общего объёма 15 мкл и вносили в слот.

. Электрофорез. Режим электрофореза - постоянная сила тока 55-70 мА. Процесс прекращали, когда расстояние от дна слот до середины полосы красителя составит не менее 13 см.

. Окраска и отмывка геля. После отключения от источника питания сливали

-кратный ТВЕ, камеру разбирали, гель помещали в поддон с 0,5 л дистиллированной воды (можно оставить гель на нижнем стекле для удобства его перемещения). Добавляли 20 мкл 10 мкг/мл раствора бромистого этидия. Окрашивали гель в течение 30 минут на шейкере. Затем отмывали гель дистиллированной водой в течение 30 минут на шейкере.

После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия. Получали электрофореграммы, которые позволяют визуализировать исследуемые микросателлитные локусы. Каждому бэнду (тёмной полосе) на электрофореграмме соответствует аллель определённой длины. Аллели разной длины в электрическом поле двигаются с разной скоростью, поэтому на электрофореграмме темные полосы располагаются на разных уровнях: ниже расположены короткие аллели, выше располагаются более длинные аллели. Толщина бенда зависит от количества ДНК в пробе. Аллели одинаковой длины будут располагаться на одном и том же уровне, поэтому толщина бенда увеличивается. Это будет свидетельствовать о гомозиготности исследуемой особи по определённому локусу.

Глава 3. Результаты исследований

.1 Возрастной состав форелей

Среди изученных особей обнаружены рыбы разного возраста. Возрастной состав форелей отражён в таблице 6 и на рис.1. Преобладающей возрастной группой явились трёхлетки, в меньшем количестве оказались четырёхлетки и пятилетки. Среди исследованных особей только одна особь оказалась двухлеткой.

Таблица 6. Возрастной состав исследуемых форелей.

Наличие четырёхлеток и пятилеток может свидетельствовать о том, что исследованные рыбы являются представителями жилой расы (форели).

Рис.1. Возрастной состав исследуемых форелей

3.2 Морфологические параметры форелей

Морфометрические показатели исследуемых форелей разных возрастных групп отражены в таблицах 7, 8, 9, 10 и 11.

Таблица 7. Показатели 2-летней (1+) форели из р. Том.

В реке Том (приток р.Ингур) на территории с. Саберио нами выловлены: одна рыба в возрасте 1+, шестнадцать в возрасте 2+, восемь в возрасте 3+, две в возрасте 4+. Рыбы из реки Кодор (4 особи) относились к одной возрастной группе 4+.

Таблица 8. Показатели 3-летних (2+) рыб из р. Том

Таблица 9. Показатели 4-летних (3+) форелей из р. Том.

Таблица 10. Показатели 5-летних (4+) форелей из р. Том

Таблица 11. Показатели 5-летних (4+) лососевых рыб из р. Кодор.

В таблице 12 отражены средние значения и соответствующие отклонения всех морфометрических показателей исследуемых рыб разного возраста, выловленных в реке Том. Для каждого параметра приведены минимальное и максимальное значение признаков.

Таблица 12. Морфологические параметры рыб, выловленных в р.Том.

X - средний параметр, mx - отклонение от ср.параметра, min - минимальный параметр, max - максимальный параметр.

Из таблицы 12 видно, что с увеличением возраста рыб происходит относительное увеличение всех рассматриваемых морфометрических показателей. Для трёхлеток их реки Том наиболее вариабельными признаками являются длина тела абсолютная (от 12,8 до 19,3 см), длина тела до конца средних лучей (12,2 - 18,2 см), вес рыб (25 - 70 г) и длина тела до корней средних лучей (12,2 - 16,7). Константными параметрами являются: длина рыла, диаметр глаз, длина хвостового стебля и др. Для четырёхлеток и пятилеток по нашим данным характерна большая выравненность по длине тела абсолютной, длине тела до конца средних лучей и длине тела до корней средних лучей.

Таблица 13. Сравнительные морфологические показатели пятилеток

Таблица 13 позволяет сравнить морфометрические показатели пятилеток из р. Том и р. Кодор. Сопоставляя параметры рыб одного возраста из разных рек видно, что особи, обитавшие в Кодор несколько крупнее, чем в реке Том. Однако малая выборка не позволяет нам на говорить о достоверных отличиях между особями из разных рек.

3.3 Результаты микросателлитного анализа ДНК

При исследовании локуса Str73INRA выявлено, что все изучаемые особи (17 особей) являются мономорфными по данному маркеру: они гетерозиготны (Рис.2). На электрофореграмме видно, что каждая исследованная особь в генотипе имеет два разных аллеля, так как тёмные полосы расположены на разных уровнях. Это свидетельствует о гетерозиготности всех исследуемых особей. Все 17 рыб имеют одинаковый генотип АВ, что указывает на их мономорфность по данному микросателлитному локусу. Аллель В длиннее аллелья А.

Рис.2. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str73INRA. Дорожки 2-18 ─ генотипы исследуемых форелей, дорожка 1- маркер молекулярной массы ДНК 20bp. А,В - аллели разной длины.

По локусу Str15INRA были исследованы 14 особей. На электрофореграмме видно, что на дорожке 2 имеется одна более жирная полоса, что говорит о гомозиготности данной особи. Все остальные рыбы оказались гетерозиготными по данному локусу. Но особи имеют разные генотипы, что указывает на полиморфизм изучаемых форелей по данному микросателлитному маркеру. Первая и шестая особь имеют одинаковый генотип АС, четвёртая и пятая особи имеют генотип ВЕ, а особи под номерами 7-10 и 14 характеризуются наличием генотипа АВ (Рис.3). Среди исследуемых рыб по данному локусу преобладают аллели А и В, реже встречаются аллели С и D. Самый длинный из всех аллелей данного локуса ─ Е, самый короткий ─ А.

Рис.3. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str15INRA. Дорожки 1-14 ─ генотипы исследуемых форелей (A,B,C,D,E - аллели разной длины).

По микросателлитному локусу Str60INRA нами исследовано 18 изучаемых форелей, которые также оказались полиморфными по данному молекулярному маркеру. Выявлено семь разных аллелей этого локуса (Рис.4). Электрофореграмма показывает, что только одна особь оказалась гомозиготной (АА), все остальные гетерозиготны. Не смотря на кривизну геля мы обнаруживаем, что все образцы с 8 по 18 идентичны по генотипу (DG). Большая часть особей имеют в генотипе аллели D и G, реже встречаются аллели Е и В. Самый длинный аллель данного локуса G, короткий ─ А.

Рис.4. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str60INRA (A,B,C,D,E,F,G - аллели разной длины). Дорожки 1-18 ─ генотипы исследуемых форелей

По локусу Str85INRA были исследованы 16 особей. Все исследуемые особи гетерозиготны по данному локусу. Особи оказались полиморфными, выявлено девять аллелей данного STR-локуса (Рис.5). В генотипе особей с большей частотой встречаются аллели H, G и D, реже встречаются аллели Е, I и А. Самый длинный аллель I, а самый короткий ─ А.

Рис.5. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str85INRA Дорожки 1-16 ─ генотипы исследуемых форелей (A,B,C,D,E,F,G,H,I - аллели разной длины).

По микросателлитному локусу Ssa197 нами исследовано 13 изучаемых форелей, которые также оказались полиморфными по данному молекулярному маркеру. Три особи оказались гомозиготными (DD, DD, BB), остальные исследуемые рыбы гетерозиготны по данному STR-локусу.

Выявлено шесть разных аллелей этого локуса (Рис.6). В генотипе особей преобладают аллели D,E и F, реже В, С и А.

Рис.6. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Ssa197 (A,B,C,D,E,F - аллели разной длины). Дорожки 1-13 ─ генотипы исследуемых форелей.

Итоговые данные микросателлитного анализа ДНК исследуемых рыб по пяти стандартным STR-локусам представлены в таблице 8.

Таблица 8. Аллельное разнообразие исследованных форелей.

Итак, в результате данных исследований подобраны микросателлитные маркеры, которые в дальнейшем могут быть успешно использованы для исследования генетического разнообразия речных популяций черноморской кумжи. Локус Str73INRA , проявивший мономорфизм среди исследованных особей, позволяет предложить его для идентификации кумжи, обитающей в реках Абхазии.

Выводы

. Среди изученных нами особей кумжи обнаружены рыбы в возрасте от 1+ до 4+. Преобладающей возрастной группой явились трёхлетки -52%. Представлены были четырёхлетки (25%) и пятилетки (19%). Такой возрастной состав указывает на то, что исследованные рыбы являются представителями жилой расы (форели).

. Морфометрические данные свидетельствуют об относительной однородности особей по большинству измеренных параметров в рамках каждой возрастной группы.

. Подобраны пять микросателлитных локусов (Str15INRA, Str60INRA, Str73INRA, Str85INRA и Ssa197) для изучения генетической структуры популяций кумжи в реках Абхазии.

. Большая часть исследованных особей являлись гетерозиготными по всем изученным локусам.

. По четырём локусам Str15INRA, Str60INRA, Str85INRA и Ssa197 выявлен полиморфизм, т. е. установлено наличие 5, 7, 9 и 6 аллелей соответственно.

. Локус Str73INRA проявил мономорфизм среди исследованных нами особей. Это позволяет предложить этот локус для идентификации кумжи, обитающей в реках Абхазии.

Литература

1. Алтухов Ю. П. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука, 2004. С. 86-92, 111-112, 151-156, 183-190.

. Барач Г. П. Внутренние водоёмы Абхазской АССР, их промысловая ихтиофауна и рыбохозяйственное значение. Сухум: Абгосиздат, 1960. С. 88-96, 127-130.

. Константинов В. М., Наумов С. П., Шаталова С. П. Зоология позвоночных. М.: Академия, 2004. С. 59, 70.

. Никольский Г. В. Частная ихтиология. М.: «Высшая школа», 1971. С. 151-152.

. Правдин И. Ф. Руководство по изучению рыб. Ленинград: издательство Ленинградского госуниверситета, 1939 г. С. 79-82, 166-173.

. Пряхин Ю. В., Шницкий В. А. Методы рыбохозяйственных исследований. Краснодар: Кубанский Гос. Ун-т, 2006. С. 67-70, 141-144.

. Расс Т. С. Жизнь животных. М.: «Просвещение», 1971. Т.4. С. 171-174.

. Тимошкина Н. Н., Барминцева А. Е., Усатов А. В., Мюге Н. С. Внутривидовой генетический полиморфизм русского осётра (Acipenser gueldenstaedtii) // Генетика. 2009. Т. 45, №9. С. 1250-1259.

. Шарвашидзе В. Л. Рыбы внутренних водоёмов грузинской ССР. Тбилиси: « Сабчота сакартвело», 1984. С. 33-40, 47-53.

. Щеповских А. И. Красная книга республики Татарстан. Казань: «Идеал-пресс», 2006. С. 155.

. Эланидзе Р. Ф. Ихтиофауна рек и озёр Грузии. Тбилиси: «Мецниереба», 1983. С. 39-45.

12. <http://www.redbook.ru/article87.html>. Рыбы Красной Книги Башкортостана. Составитель: Биккинин Р. Ф.

. http://fish-news.teia.org/trutta1.htm. Ручьевая форель и кумжа.

<http://www.ecosystema.ru/08natura/fish/025.htm>. Экологический центр «Экосистема».

. <http://redbook.minpriroda.by/animalsinfo.html>. Красная книга республики Беларусь.

. <http://www.lesder.ru/fish4.html>. Туристическая фирма «Лесная Деревня».