. Возбудители дерматофитозов животных, регистрируемые в республике Беларусь представлены в таблице 1. Дерматофитозы (трихофития и микроспория) регистрируются повсеместно на территории республики, наносят значительный экономический ущерб животноводству и представляет большую опасность для человека.
Таблица 1. Видовой состав дерматофитов выявленных у сельскохозяйственных животных Республики Беларусь
Вид животногоВид возбудителяКрупный рогатый скотTr.verrucosum,Tr.mentagrophytesЛошадиTr. equinum,Tr. mentagrophytes, M.canis, M. EquinumОвцыT. verrucosum var. AutotrophcumСвиньиTr.mentagrophytes, M.canis, M.gyp- seum, M. NanumСобаки и кошкиM. canisПушные звери и кроликиTr. mentagrophytes, M. сanisКуры и индейкиTr. gallinae
Диагноз на дерматофитозы ставят на основании характерных клинических признаков, эпизоотологических данных и результатов лабораторных исследований, включающих световую микроскопию и люминесцентное исследование патологического материала, выделение культуры гриба, и его идентификацию.
2. Отбор патологического материала
Материал для исследования у больных и подозрительных по заболеванию животных берут в виде глубокого соскоба из периферических частей свежих пораженных участков кожи, не подвергавшихся лечебным обработкам
Корочки с остатками волос, волосы, чешуйки отбирают пинцетом из пораженных участков (по возможности менее загрязненных) и помещают в чистые бумажные пакеты. Использовать для этой цели пробирки нецелесообразно, поскольку в них создается повышенная влажность, способствующая развитию плесневых грибов и бактерий.
На образцы отобранного патматериала направляемого в ветеринарную лабораторию для микологического исследования оформляют сопроводительную записку с указанием вида, возраста, клинических признаков болезни, место локализации пораженных участков кожи, даты взятия патматериала, а также район, область и хозяйство.
3. Методы лабораторной диагностики
дерматофитоз животное болезнь микроскопия
Микроскопия в люминесцентном микроскопе
Материал отбирают от больных дерматофитозом животных, не подвергавшихся лечению, и помещают в чашки Петри, облучают ртутно-кварцевой лампой и просматривают в затемненном помещении Патологический материал просматривают на расстоянии 20-25 см от светофильтра. Волосы, кожные чешуйки, инфицированные возбудителем микроспории, дают характерное изумрудно-зеленое свечение. Свечение может отсутствовать у животных черной масти, а также при инфицировании животных штаммами не продуцирующими пигмент птиридин. Поэтому при отрицательных результатах люминесцентной диагностики необходимо провести микроскопическое и культуральное исследования. При поражении трихофитоном пораженные волосы не имеют такого свечения. С помощью переносной ртутно-кварцевой установки можно исследовать в затемненном помещении животных подозрительных в заболевании.
Микроскопия в световом микроскопе
Для микроскопического исследования патматериал помещают в стерильную чашку Петри, которую ставят на темный фон (черную бумагу).
С помощью препаровальной иглы и глазного скальпеля отбирают и отрезают утолщенные корневые части волос, покрытые белым налетом и кожные чешуйки. Длина отрезков волос, подготовленных к микроскопии, должна составлять 1-2 мм. Затем несколько отрезков волос и чешуек (8-10) помещают на предметное стекло в каплю 20% NaOH или KOH, слегка подогревают над пламенем горелки до появления белого ореола вокруг капли, после чего добавляют 1 каплю теплого 50% водного стерильного раствора глицерина и покрывают покровным стеклом. Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и сухими. Чтобы не сломать покровное стекло его берут одной рукой за два ребра, а затем большим и указательным пальцем другой руки осторожно протирают марлей или салфеткой с обеих сторон. Исследуемый материал помещают в капле жидкости на предметном стекле, расправляют препаровальной иглой. Покровное стекло подводят ребром к капле жидкости и плавно опускают на объект. Из-под стекла жидкость вытесняет воздух, предотвращая образование воздушных пузырьков. Если капля жидкости выступает за пределы покровного стекла, ее избыток убирают фильтровальной бумагой, а если жидкости мало, то ее дополнительно вносят пипеткой у ребра покровного стекла, откуда она всасывается в силу капиллярности. Вначале микроскопируют с объективом x 10, затем x 40.
При микроскопии пораженных волос от животных, больных дерматофитозами устанавливают, что возбудителям трихофитии присуще наличие округлых спор (артроспор) гриба образующих вокруг волоса чехол. Они могут располагаться как на поверхности, так и внутри волоса. В чешуйках, на ранних стадиях встречается ветвящийся мицелий. Споры грибов T. verrucosum, T. verrucosum var. autotrophicum, T. equinum более крупные (2,5-7 до 12 мкм), чем споры дерматофита T. mentagrophytes (2-4 мкм). Для возбудителей микроспории характерно то, что артроспоры (1,5 - 3,5 мкм) беспорядочно располагаются у основания волоса, а иногда образуют чехлы на его поверхности. Споры резко преломляют свет и плотно прилегают друг к другу. Искривление мицелия и распад его на споры обуславливают характерное для микроспории мозаичное расположение спор. В редких случаях мозаичность расположения спор выражена несколько слабее. Кроме того в чешуйках встречается ветвящийся мицелий.
Обнаружение грибных элементов в патологическом материале (артроспоры, мицеальные нити) дает возможность поставить предварительный диагноз на трихофитию или микроспорию. Для идентификации и определения вида возбудителя необходимо выделить грибы в чистой культуре.
Выделение чистой культуры возбудителя.
С целью получения чистой культуры гриба и определения его вида проводят посевы корневых частей волос и кожных чешуек на сусло - агар, агар Сабуро или мясо-пептонно-глицериновый агар с 2% глюкозы (МПГА). Посев производят микологической иглой на пробирки с указанными средами. Микологическая игла (микологический крючок) вставляется в иглодержатель. Конец иглы загнут под прямым углом или тупым углом и сплюснут в виде лопаточки. Прокаленную иглу слегка погружают в питательную среду для охлаждения, а затем концом иглы прикасаются к частице волоса или чешуйке кожи и переносят их по одному на поверхность косяка питательной среды на расстоянии 1-1,5 см друг от друга в 2-3 точки на 7-10 пробирок. Зараженные пробирки инкубируют при 26-28 0С до 30 дней, просматривая посевы каждые 3-5 дней. Загрязненный патологический материал перед посевом заливают небольшим количеством 700 этилового спирта и выдерживают в термостате до его полного испарения.
Появление роста колоний дерматофитов на месте посева пораженных волос или кожных чешуек можно отметить на 3-5 день. В отдельных случаях развитие возбудителя заметно только на 20-й день, в связи с чем, наблюдения за посевами надо вести в течение месяца. Формирование колоний дерматофитов наступает в различные сроки. Так, характерный для T.mentagrophytes, T. equinum, M. canis, M. equinum рост отмечают на 10-14-й день и на 20-25-й день для T. verrucosum, T.verrucosum var.autotrophicum. В связи с чем, описание культур данных дерматофитов следует проводить именно в этот период.
Идентификация вида возбудителя.
При определении вида возбудителя описывают культуральные признаки, в частности, размеры колоний, их структуру и цвет, строение растущего края, пигментацию обратной стороны колонии и питательной среды, а также проводят микроскопическое исследование культур, отмечая строение и ширину мицелия, форму и размеры микроконидий, макроконидий, хламидоспор и артроспор. Для микроскопии культур готовят препараты: нагретой в племени горелки и охлажденной микологической иглой или лопаточкой вырезают кусочек выросшей колонии гриба (при этом пробирку держат около пламени горелки), помещают его на предметное стекло в каплю 50%-ного водного раствора глицерина или воды и накрывают покровным стеклом, слегка раздавливая фрагмент колонии. Микроскопируют препараты с объективом x 10 и x 40.
Характеристика культурально-морфологических признаков дерматофитозов животных
Trichophyton verrucosum (син. T. faviforme) - основной возбудитель трихофитии крупного рогатого скота, буйволов, север ных оленей. Культуры трихофитона развиваются медленно, рост заметен на 5-7 день. На 15-й день на МПГА образуются округлые беловатые стелющиеся колонии 10-15 мм в диаметре. Микроскопия культуры позволяет выявить многочисленные округлые четко видные расположенные артроспоры до 6 мкм в диаметре и единичные микроконидии. При пересеве на сусло-агаре к 20- 25 дню формируются белые, сероватые или желтоватые, кожистые, кожисто - бархатистые или бархатные колонии, плоские или возвышенные, ровные или бугристые, диаметром 5-8 мм. Микроконидии овальные, грушевидные, 1-3 x 2-8 мкм. Макроконидиии удлиненные, булавовидные, 3,5-8 x 20-50 мкм с 3-4 перегородками. Хламидоспоры округлые, диаметром 5-15 мкм, мицелий - 3-6 мкм. Обратная сторона колоний не окрашена. На агаре Сабуро образует кожистые колонии, пуговчатые в центре, с глубинным ростом в питательную среду. Многие штаммы этого гриба требуют тиамин и инозитол для своего развития. Эти витамины имеются частично в сусло-агаре. Штаммы T. verrucosum патогенны для человека и лабораторных животных.
Trichophyton verrucosum var. autotrophicum. Возбудитель трихофитии овец. Характеризуется интенсивным ростом первичных культур. Колонии на МПГА рыхлые, восковидные 10-20 мм в диаметре. Их рост сопровождается формированием хламидоспор округлой формы диаметром 10-22 мкм. Толщина мицелия - 4-12 мкм. Артроспоры округлой формы диаметром 4-12 мкм. На сусло-агаре рост замедляется на 20-25 день. Формируются восковидные коричневые со слабым ростом, светло-серые, пушистые или слабопорошистые, тонкие и нежные пушистые белые колонии. Микроконидии единичные, овальные, грушевидные, 5-10 мкм, макроконидии вытянутые, часто сохраняют «ножку», 25-30 мкм с 1-4 перегородками, хламидоспоры округлые концевые или интеркалярные до 4-5 мкм. Мицелий тонкий и толстый, четко просматриваются вздутия. Для своего развития возбудитель не требует добавления в питательную среду тиамина и инозитола. Штаммы патогенны для человека и лабораторных животных. Изменение окраски среды, содержащей сорбит, позволяет дифференцировать штаммы
T.verrucosum от T. verrucosum var. autotrophicum, T. mentogrophites, T. equinum. T. mentagrophytes (син. T. gypseum) - возбудитель
трихофитии пушных зверей, кроликов, морских свинок, мышевидных грызунов, реже лошадей, крупного рогатого скота. Для возбудителя характерен достаточно интенсивный рост, так к 14 дню на агаре Сабуро формируются плоские, ровные, белые, желтоватые и розовые колонии, которые покрывают всю поверхность косяка. Обратная сторона колонии желтоватая или розовая . Мицелий ровный, ветвящийся шириной 0,7 - 3 мкм, встречаются спиралевидные и кольцевидные окончания гиф. Микроконидии округлые, овальные, округло-овальные диаметром 2-4 мкм. Артроспоры отсутствуют. Макроконидии образуются при добавлении в питательную среду стерильных волос, они цилиндрические с закругленными концами, имеют до 5 перегородок размером 5-10 x 30-50 мкм. На сусло-агаре колонии белые, желтоватые, плоские, ровные, мучнистые, зернистые и бархатистые. Обратная сторона желтоватая, красно-коричневая. Морфология микро-макроконидий такая же, как на агаре Сабуро. Специальных ростовых питательных потребностей не требуется. Возбудитель патогенен для человека и лабораторных животных.
Т. equinum. Указанный вид вызывает развитие трихофитии лошадей. Возбудитель к 14-му дню на агаре Сабуро формирует белые, пушистые, плоские колонии 10-15 мкм в диаметре. Обратная сторона желтоватая, розоватая. На сусло-агаре колонии белые, бархатистые, плоские, гладкие или радиальнообразные. Обратная сторона желтоватая, красноватая. Морфология на сусло-агаре и агаре Сабуро идентична. Мицелий ветвящийся, 1-3 мкм шириной, выявляются интеркалярные хламидоспоры 3-4 х 5-10 мкм, иногда встречаются спиральные и кольцевидные окончания гиф. Микроконидии многочисленные, округлые, овальные, грушевидные, булавовидные на тонких коротких ножках по бокам мицелия 1-3х3-7 мкм. Макроконидии булавовидной формы с тупым наружным концом, с 3-4 перегородками и гладкими тонкими стенками размером 3-7х15-45 мкм. Специальные питательные потребности - отмечена зависимость от триптофана, никотинамида, никотиновой кислоты. Патогенны для лабораторных животных.
Т. gallinae (синоним Achorion gallinae). Возбудитель трихофитии птиц (фавуса, парши). Растет медленно, начиная с 4-5-го дня. Молодые колонии на агаре Сабуро гладкие, бархатистые, белые; зрелые- складчатые, мучнистые, морщинистые, похожие на губку, крошковатые. Колонии бывают розового, розово-красного или малинового цвета. Пигмент появляется при температуре до 300С, в пересеянных культурах нередко отсутствует. В молодых культурах мицелий у гриба тонкий (1,5-2 мкм), в виде сегментов. Встречаются гребешковые образования в виде рога северного оленя, канделябр, хламидоспоры, веретенообразные вздутия. Мицелий зрелых культур диаметром 5 мкм состоит из цепочек клеток, разнообразных по форме и размеру. Макроконидии-1-6-клеточные, микроконидии грушевидные размером от 3,5 до 5 мкм.
M. canis (син. M. lanosum, M. felineum, M. equinum). Возбудитель микроспории кошек, собак, кроликов, пушных зверей и лошадей. Первоначальные культуры M. canis обычно подразделяются на два типа: 1.- быстро растущие крупные типичные колонии, патогенные для лабораторных животных и 2-замедленный тип роста в виде мелких радиально-складчатых темно-коричневых, кожистых колоний, слабо патогенных для лабораторных животных, чаще всего выделяемые от лошадей которые, отнесены многими исследователями к M. еquinum. Изучение антигенной структуры штаммов вида М. canis и М. equinum показало, что они наиболее близки между собой при изучении белковых экстрактов. К 14-му дню на сусло-агаре и агаре Сабуро формируются быстрорастущие рыхлопушистые, серовато-беловатые, желтоватые или бежевые колонии, которые впоследствии становятся мучнистыми, изредка бугристыми или с неглубокими радиальными складками. Мицелий ровный, ветвящийся, неравномерно утолщенный, бамбукообразный, имеются гребешки и узловатые органы, встречаются гифы из ракетообразных клеток. Микроконидии немногочисленные округлые, грушевидные, продолговатые, размером 1,0-3,5x3-6 мкм (встречаются до 120 мкм), ширина 7-16 мкм. Чаще всего они многочисленные, веретеновидной формы с шиповатой двухконтурной оболочкой или ворсистые, состоят из 4-12 клеток. В зрелых культурах встречаются округлые, интеркалярные хламидоспоры диаметром 8-12 мкм. М. canis космополит. Специальных питательных потребностей для М. canis не отмечено. Однако для дифференциальной диагностики М. canis от других зооантропонозных дерматофитов используют способность ассимилировать маннит и сорбит. Кроме того, рост на картофельной среде М.canis отличается от других дерматофитов тем, что диффундирует в питательную среду красный пигмент.
М. gipseum. Возбудитель микроспории свиней. Быстрорастущий. На сусло-агаре дает плоские, с возрастом мучнистые, неправильно складчатые колонии, окруженные значительными мучнисто-бархатистыми зубчиками по периферии. Лабораторные штаммы неправильно складчатые, мучнистые, без периферической зоны. Цвет колоний желтоватый, светло-коричневый, коричневый, оборотная сторона рыжевато-коричневая. Мицелий ракетообразный, многочисленные, многоклеточные макроконидии 8-12 x 30-50 мкм, одиночные или располагаются группами. Микроконидии боковые 3-5x2,5-3,5 мкм. Микроконидии могут и не обнаруживаться. M. nanum является вариантом M.gypseum, культуральные свойства и признаки схожи с вышеуказанным возбудителем.
Сусло-агар. Используется для выделения и культивирования дерматофитов. Солодовое неохмеленное сусло получают с пивоваренного завода. Его разбавляют в два раза водопроводной водой до 70 содержания сахаров по Баллингу, устанавливают рН до 8-8,2 добавлением 10% NaOH и 2% агара. Среду фильтруют через 3-4 слоя марли, разливают в стерильную посуду и автоклавируют 30 минут при 0,5 атм. После стерилизации рН среды 6,3-6,7.
Мясопептонно-глицериновый агар (МПГА) с 25% глюкозы Используется для выделения дерматофитов из патологического материала. Глюкоза -20 гр., глицерин - 25 гр. (по весу), пептон - 10 гр., хлористый натрий - 5 гр., стерильная мясная вода (разбавленная дистиллированной водой 1:2) - 1л, агар-агар - 20г. Приготовление мясной воды. Мясной фарш 1 кг, холодная водопроводная вода 1 л. На выкипание добавляется 10% воды. Мясной фарш варят сразу же, нагревая его до кипения. За это время фарш уваривается, из красного становится серым. После этого варить еще один час, профильтровать через плотный марлевый или бумажный фильтр, если жидкость готова, то мясная вода будет прозрачная.
Агар Сабуро. Применяется для выделения и культивирования дерматофитов. Глюкоза - 40гр., пептон-10 гр., агар-агар - 18г, водопроводная вода 1 л. В небольшом объеме воды растворяют глюкозу и пептон, доводят объем жидкости до 1л, добавляют агар-агар и расплавляют его, нагревая воду, но не доводя до кипения. Питательную среду фильтруют через марлю (4-5 слоев), разливают в стерильную посуду, стерилизуют под давлением 0,5 атм. в течение 30 минут. рН после стерилизации 6,5 - 6,7.
Картофельный агар. Используют для дифференциальной диагностики M.canis от T. mentagrophytes и T. equinum. Картофель очищенный - 500 гр., глюкоза - 20 гр., NaCl - 5 гр., дрожжевой экстракт - 2,5 гр., агар-агар - 2гр., H2O - 1л. Очищенный картофель нарезают ломтиками, заливают водопроводной водой и помещают на 40 минут для обработки текучим паром. После фильтрования добавляют глюкозу, NaCl , дрожжевой экстракт и агар-агар. После растворения агара среду разливают в стерильную посуду и автоклавируют 30 минут под давлением 0,5 атм. После стерилизации рН среды 6,0-6,2.
Литература
1.Головина Н.П. Биология возбудителя Trichopyton verrucosum var. autotrophicum и разработка вакцины против трихофитии овец: Автореферат диссертации доктора биологических наук.- Москва, 1991-53С.
.Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические. - М.: Агропромиздат, 1991 г.
.Петрович С.В. Микозы животных. М.: Росагропромиздат, 1989 г.
. Саркисов А.Х., Королева В.П., и др. Диагностика грибных болезней животных. М.: « Колос», 1971 г.
. Спесивцева Н.А. Микозы и микотоксикозы животных. - М.: Агропромиздат, 1960 г.