ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
Вакцинное производство при лептоспирозе
Витебск - 2011
Оглавление
Введение
Порядок работы с производственными штаммами
Питательные среды
Получение матровой расплодки
Приготовление производственных расплодок лептоспир
Концентрирование бактериальной массы
Смешивание производственных культур лептоспир
Консервация культур
Составление серии вакцины
Расфасовка и маркировка вакцины
Приготовление сухой вакцины
Контроль поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных
Контроль сухой вакцины против лептоспироза животных
Список использованной литературы
Введение
Вакцины - это биопрепараты, получаемые из различных микроорганизмов, отдельных компонентов микробов или продуктов их жизнедеятельности и используемые для активной иммунизации в целях специфической профилактики инфекционных болезней.
За последние 10-15 лет сфера применения вакцин существенно изменилась и вышла за рамки профилактики инфекционных болезней.
Вакцины в зависимости от назначения делят на ветеринарные и медицинские, противоинфекционные, противопаразитарные, антифертильные, противоопухолевые и т.д.; по состоянию иммуногена - на живые и инактивированные; по составу - на корпускулярные, цельновирионные, субъединичные, химические, синтетические; по технологии получения - традиционные и генноинженерные, полученные химическим синтезом или гибридомной технологией; по характеру совмещения компонентов - механические смеси, адсорбированные, конъюгированные, липосомальные и другие; по количеству входящих иммуногенов- моно-, би-, поливалентные и ассоциированные.
Преобладающей формой вакцин все еще являются корпускулярные, живые и инактивированные.
В основе борьбы с лептоспирозом сельскохозяйственных животных лежат лабораторная диагностика и специфическая профилактика.
Промышленное производство лептоспирозных вакцин в нашей стране начато в 1949 году. В состав биопрепарата входили лептоспиры серогрупп Pomona и Grippotyphosa. В последующие годы в его состав ввели серогруппы: Icterohaemorrhagiae и Canicola (1952-1956), Tarassovi (1959-1962), Hebdomadis и Bataviae (1965-1966).
Первая вакцина представляла собой смесь культур лептоспир, выращенных в водно-сывороточной среде и инактивированная 0,5% -ным хинозолом, а затем фенолом. Ее применяли в больших дозах двукратно, однако она имела низкую иммуногенность и не во всех случаях профилактировала лептоспироносительство.
Вакцину выпускали до 1976 года в трех, а затем в двух вариантах, каждый из которых содержал лептоспиры 4-5 серогрупп. Ее вводили однократно, продолжительность иммунитета у вакцинированных животных не превышала 2-4 месяцев.
В 1978 году в ветеринарную практику была внедрена депонированная вакцина ВГНКИ, которая при однократном введении вызывала формирование иммунитета большей напряженности и продолжительности, чем феноловая вакцина при двукратном применении.
В дальнейшем в целях совершенствования специфической профилактики в 1990 г были внедрены концентрированная, а в 1996 году - сухая вакцины.
Концентрированная вакцина не получила практического применения из-за выпадения не разбивающегося при встряхивании осадка при длительном хранении.
В Республике Беларусь на ДП Витебская биофабрика выпускают поливалентную вакцину против лептоспироза животных в двух вариантах. Кроме того, в нашей стране применяется и сухая вакцина против лептоспироза, которая производится Ставропольской биофабрикой.
Подготовленное учебно-методическое пособие в значительной степени повысит уровень знаний читателей по вопросу технологического процесса изготовления биопрепаратов против лептоспироза.
Порядок работы с производственными штаммами
Пеналы со штаммами лептоспир, доставленные нарочным из специализированного учреждения, вскрывают комиссионно и составляют акт о состоянии пробирок и о качестве полученного штамма.
В цехе по производству противолептоспирозных препаратов из одной пробирки каждого штамма делают пересев в 4-6 пробирок с питательной средой, остальные хранят при комнатной температуре (18-250С). Питательная среда должна быть предварительно проверена на стерильность и пригодность для культивирования лептоспир.
У полученных штаммов лептоспир, проверяют комиссионно морфологию, культуральные свойства и серогрупповую принадлежность. Антигенные свойства проверяют по необходимости.
При обнаружении у культур лептоспир агглютинатов, нитевидных, зернистых, неподвижных с распрямленными концами бактерий штамм выбраковывают.
Загрязненные посторонней микрофлорой культуры лептоспир независимо от интенсивности загрязнения и роста выбраковывают.
Для приготовления производственной расплодки первоначально делают посев в пробирки, содержащие 8-10 см3 питательной среды, внося в них по 0,5-1,0 см3 культуры лептоспир. Через 5-7 суток накопление лептоспир должно составлять 80-100 лептоспир в поле зрения микроскопа.
Далее в таком же порядке делают пересев в пробирки с производственной питательной средой.
При наличии хорошего роста культуры пересевают из пробирок во флаконы с питательной средой, содержащей 80-100 см3 среды во флаконах вместимостью 200 см3 и по 200-250 см3 среды во флаконы вместимостью 500 см3 соответственно по 8-10 и 20-25 см3 культуры. Одновременно для контроля чистоты высевают по 0,5 см3 культуры в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и средой Сабуро.
Посевы для контроля на чистоту инкубируют в течение 10 суток при температуре 37-380С, а со средой Сабуро - при температуре 20-250С.
Питательные среды
Лептоспиры были выделены в чистой культуре значительно позже, чем многие другие патогенные микроорганизмы. Это связано с их повышенной требовательностью к составу питательной среды. Первые культуры были выращены на сыворотке крови кролика, в последующих работах использовали разведенную сыворотку. Простейшая сывороточная среда представляет собой смесь простерилизованной воды с асептически полученной сывороткой крови кролика или овцы в разных количествах.
Известно значительное количество сывороточных сред различного состава. Простейшей средой является среда Уленгута. Наиболее известные среды - это среда Фервоорт-Вольфа в модификации Тарассова (1937), среда Кортгофа (1932), полужидкая среда Флетчера (1928). Каждая из этих сред содержит 5-10% сыворотки крови кролика или барана, фосфатный буфер или дистиллированную воду, витамины группы В и некоторые другие добавки.
Сывороточные среды используют для поддержания производственных штаммов лептоспир и получения матровых и производственных расплодок.
Работать с сывороточными средами в производственных условиях весьма сложно. Для этого необходимо содержать стадо овец-доноров, не имеющих антител к лептоспирам, получать в асептических условиях и стерилизовать сыворотку крови фильтрованием. При соблюдении всех необходимых условий производственные штаммы в этих средах через 4-7 суток вырастают до концентрации 80-100 млн/см3 лептоспир.
Наряду с сывороточными широкое применение в биологической промышленности получили полусинтетические и синтетические белковые и безбелковые питательные среды.
лептоспироз вакцина сельскохозяйственное животное
Накопление лептоспир на этих средах значительно выше, чем на сывороточных средах и составляет от 1 до 5 млрд/см3 микробных тел.
Наиболее широко используются следующие среды: синтетическая безбелковая среда Шенберга, синтетическая безбелковая среда Торнея (1974), твин (полисорбат) - альбуминовая среда Элленгаузена в модификации Джонсона (1967), твин (полисорбат) - альбуминовая среда Рассела (1986), среда Элленгаузена (1976) и др.
Полусинтетические среды, так же как и сывороточные, имеют сходный состав. Они содержат фосфатный буфер, растворы неорганических солей, витамины В1 и В12, жирные кислоты и бычий альбумин. Мы попытались воспроизвести среды по известным прописям, используя отечественные компоненты, и сделать их пригодными для промышленного культивирования лептоспир. Наиболее доступным источником жирных кислот для лептоспир, на наш взгляд, служат водорастворимые липиды, из которых полисорбаты являются предпочтительными. К таким полисорбатам относятся твины: 20, 40, 60 и 80.
Глицерин в концентрации от 100 до 400 мг/дм3 не заменял жирные кислоты, но повышал выход бактериальной массы.
В качестве источника азота оказалось возможным использовать пептон 0,15-0,20 г/дм3, гидролизат казеина 0,5-1,5 г/дм3, аспарагин 0,25-0,5 г/дм3. В присутствии аспарагина растут все штаммы лептоспир.
Лептоспиры, несмотря на свою требовательность к питательным средам, метаболизируют также в качестве источника азота хлорид аммония или нитрит аммония (0,2-0,3 г/дм3).
Твин-альбуминовая среда, применяемая для производственных целей в биологической промышленности, имеет следующий состав:
. Готовят исходные растворы каждого компонента (из расчета г/100 см3 дистиллированной воды): NH4Cl - 25,0; ZnO4 x 7H2O - 0,4; Mg Cl2 x 8 H2O - 1,5; CaCl2 x H2O - 1,5; FeSO4 x 7 H2O - 0,5; молочнокислый натрий - 10,0; твин-80 - 10,0; В1 - 0,5 и В12 - 0,02.
. Раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА): БСА фракция У - 10,0; дистиллированная вода - 50,0; CaCl2 - 1,0; VgCl2 и ZnSO4 по 1 см3 исходного раствора; FeSO4 - 10,0 см3 свежеприготовленного исходного раствора; В12 - 12 см3; твин-80 - 1,25 см3. Дистиллированную воду добавляют до 100 см3, доводят рН до 7,4 и стерилизуют фильтрованием.
. Основная среда (на 996 см3 дистиллированной воды): NaHPO4 - 1,0; KH2PO4 - 0,3; NaCl - 1,0; NH4Cl - 1,0; тиамин - 1,0; молочнокислый натрий - 1,0; глицерин - 1,0. Доводят рН до 7,4, стерилизуют при 1210С в течение 20 минут
. Полная твин-80-альбуминовая среда: основная среда - 9 объемов и раствор БСА - 1 объем. Среду стерилизуют фильтрацией.
Твин-альбуминовая среда Расселя при использовании чистых и нетоксичных ингредиентов обеспечивает накопление лептоспир от 300 до 500 млн/см3 микробных клеток. Однако, при культивировании на этой среде в течение длительного времени лептоспиры утрачивают антигенную и иммуногенную активность, хотя и сохраняют способность к активному размножению. Данная среда пригодна только для первичной расплодки при условии введения в ее состав до 0,05% сыворотки барана. Для вторичной расплодки эта среда уже непригодна из-за резкого снижения антигенной активности выращенных на ней лептоспир.
Бытует мнение, что сывороточная среда, используемая в производстве вакцины, не отвечает требованиям современного индустриального производства, так как не обеспечивает стабильного роста всех производственных штаммов и высокого накопления бактериальных клеток (70-100 млн. м. к. /см3); нестандартна при изготовлении; процесс ее производства в промышленных объемах в стеклянных баллонах трудоемок.
По мнению специалистов ДП Витебская биофабрика им. Я.Р. Коваленко" далеко до конца не исчерпан ростовой потенциал сывороточных сред. Под руководством главного технолога биофабрики, кандидата ветеринарных наук Зайцева В.В. разработан целый ряд новых рецептур питательных сред на основе сывороточной среды. Сущность их не раскрывается, так как она является ноу-хау.
Модифицированные питательные сывороточные среды обеспечивают накопление лептоспир до 500-800 млн. м. к. /см3. При этом важно отметить, что среда пригодная для длительного культивирования и в отличии от аналогичных сред и твин-альбуминой среды Рассела не только не снижает антигенной активности, но и, напротив, повышает ее в 1,3-2,0 раза.
Сотрудниками биофабрики также предложена среда на основе лизированной крови овец и разработан метод очистки сыворотки от специфических антител, исключив таким образом ее выбраковку. Кроме того, для культивирования лептоспир ими приготовлена среда на основе гидролизатов белков казеина. В качестве белковой основы среда содержит гидролизат белков казеина и дополнительно - биостимулятор при следующем соотношении компонентов (об. %):
гидролизат казеина - 10
биостимулятор - 5-10
раствор - 10
вода очищенная - остальное.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что жидкая питательная среда, содержащая гидролизат казеина и биостимулятор, обеспечивает высокое накопление лептоспир (80-120 млн. м. к. /см3) и может быть использована для однократного производственного посева лептоспир без снижения антигенной активности. Способ приготовления данной среды прост и экономичен, но рецептуру приготовления необходимо усовершенствовать. Способ приготовления среды на основе гидролизата белков казеина признан изобретением и защищен патентом (Патент РБ № 951024, С 12 N 1/20, 1999).
Оптимизацию состава питательных сред осуществляли с помощью математической теории планирования многофакторных экспериментов, статистической обработки результатов и регрессивного анализа.
Сравнительную оценку экспериментальных и контрольных образцов питательных сред проводили в соответствии с методическими рекомендациями.
Питательную потребность в процессе культивирования лептоспир изучали, используя спектрометрию инфракрасного (ИК) и комбинированного рассеивания (КР) и хроматомасс-спектроскопию.
В процессе культивирования лептоспир определяли морфологию, жизнеспособность, антигенные свойства, продолжительность лаг-периода (время от момента посева до фазы нарастания скорости роста популяции), длительность экспоненциальной фазы (время от фазы нарастания скорости роста популяции до фазы замедления роста), максимальную удельную скорость роста (прирост биомассы на единицу времени), время генерации (удвоение концентрации лептоспир).
Получение матровой расплодки
Чистые с хорошим накоплением культуры лептоспир, полученные во флаконах, высевают по 700-800 см3 в стеклянные бутыли вместимостью 15-18 дм3, содержащие 8-12 дм3 среды. Бутыли с засеянной питательной средой выдерживают в термостате при температуре 27-280С в течение 5-10 суток.
Чистые культуры, имеющие накопление биомассы не менее 80 млн. м. к. /см3, типичную морфологию, используют как матровую расплодку для засева производственной партии питательных сред.
Определение накопления лептоспир производят в счетной камере Петрова-Хаусера или Тома по прилагаемой к ним методике. При отсутствии счетной камеры концентрацию лептоспир в культуре определяют следующим методом. Испытуемую культуру разводят питательной средой 1: 1 (к 1 см3 культуры добавляют 1 см3 среды). На предметное стекло наносят микропипеткой каплю культуры (0,02 см3) и накрывают стандартным покровным стеклом. Капля должна заполнять все пространство под покровным стеклом, но не выступать из-под него. Учет количества лептоспир проводят под микроскопом с моно - или бинокулярной насадкой, используя объектив 40 и окуляр 7-10.
Подсчитывают количество лептоспир в 15 полях зрения по диагоналям препарата, после чего определяют среднее содержание в одном поле зрения с учетом сделанного разведения.
Чистоту роста определяют путем просмотра культур под микроскопом в темном поле и высева 0,3-0,5 см3 культуры на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом по две пробирки с каждой средой.
При выдерживании посевов при температуре 36-380С в термостате в течение 5 суток не должно быть роста микрофлоры, так как лептоспиры на этих средах не растут.
Матровую расплодку поддерживают и хранят в отдельном помещении, закрепив за каждым штаммом отдельный стелаж.
Приготовление производственных расплодок лептоспир
Матровую расплодку засевают в бутыли вместимостью 16 литров, содержащие 10-12 дм3 питательной среды, из расчета 10% к среде (1,0-1,2 дм3 культуры на 10-12 дм3 питательной среды). Культивируют лептоспиры в течение 5-10 суток при температуре 26-280С без доступа света.
Контроль за ростом лептоспир осуществляют путем просмотра бутылей в проходящем свете и проб культуры из бутылей в темном поле микроскопа при увеличении 40 х 7-10.
Кроме того, в процессе выращивания культуру выборочно от 10% бутылей проверяют на стерильность. Культуры, в которых при просмотре в проходящем свете, или микроскопии, или при проверке на стерильность выявлено наличие посторонней микрофлоры, выбраковывают.
Все бутыли с чистой культурой и накоплением в поле зрения микроскопа не менее 60 лептоспир (75 млн. м. к. /см3) используют для составления серии вакцины.
Процесс культивирования лептоспир в стеклянных бутылях непроизводителен и трудоемок. Поэтому предлагается выращивание лептоспир в ферментере объемом от 0,05 до 0,4 м3.
Установлено, что для культивирования лептоспир в ферментере необходимо использовать посевные культуры лептоспир в экспоненцальной фазе роста.
Управляемое периодическое культивирование лептоспир в ферментере обеспечивает физиологически более активное выращивание культур, увеличение максимальной скорости роста, сокращение лаг-фазы и времени генерации по сравнению с традиционной технологией производства, интенсификацию процесса за счет уменьшения продолжительности выращивания лептоспир почти в 2 раза (с 6-8 до 4 суток). При этом наблюдается более высокое накопление живых клеток.
Концентрирование бактериальной массы
Концентрирование культур лептоспир успешно проводят на установках УПВ-6 и других подобных ультрафильтрационных установках, принцип работы которых основан на отделении микробных клеток и высокомолекулярных веществ от водной фазы.
Культуру концентрируют до 1,5-2 млрд. м. к. /см3. Концентрацию лептоспир определяют путем подсчета в камере Петрова-Хауссера.
Смешивание производственных культур лептоспир
Вакцину изготавливают в двух вариантах:
вакцина первого варианта состоит из штаммов лептоспир серогрупп Помона, Тарассови, Иктерогеморрагия и предназначена для профилактики лептоспироза у свиней, собак и лошадей;
вакцина второго варианта состоит из штаммов лептоспир серогрупп Помона, Тарассови, Гриппотифоза и Харджио и предназначена для профилактики заболевания у крупного и мелкого рогатого скота, лошадей.
Концентрированные культуры разводят фосфатным буфером до концентрации лептоспир 100-120 млн. м. к. /см3.
Культуры производственных штаммов отбирают в равных соотношениях и смешивают.
Смешивание культур осуществляют в стерильном реакторе.
Консервация культур
Для консервации культур лептоспир используют формалин, с содержанием не менее 36% формальдегида. Формалин предварительно разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 1 и добавляют при постоянно работающей мешалке до конечной концентрации в среде 0,25%.
Консервированную культуру выдерживают при температуре 27-280С в течение 18 часов.
Составление серии вакцины
К инактивированной смеси культур лептоспир, помещенной в реактор, добавляют простерилизованный 6% -ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% к объему вакцины, т.е. на 700 см3 культуры берут 300 см3 геля.
В течение 15 минут смесь перемешивают мешалкой, берут пробу вакцины из реактора и проверяют на стерильность путем посева на питательные среды.
Расфасовка и маркировка вакцины
Вакцину, признанную при цеховом контроле стерильной и содержащей достаточную концентрацию лептоспир, расфасовывают при постоянной работе механической мешалки в стерильные флаконы по 100 или 200 см3.
Флаконы плотно закрывают резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками и этикетируют.
На этикетке флакона с вакциной должны быть следующие обозначения:
наименование предприятия-изготовителя и его товарный знак;
название биопрепарата;
количество вакцины во флакане (см3);
перечень серогрупп лептоспир, входящих в вакцину;
номера серии и контроля;
дата изготовления (месяц и год);
дозы для животных;
срок годности;
условия хранения;
обозначение технических условий.
Приготовление сухой вакцины
Процессы приготовления питательных сред, культивирования, концентрирования, консервации аналогичны как и при изготовлении поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных.
Культуру лептоспир, сгущенную до получения концентрации биомассы 1,8-2 млрд. м. к. / см3 и инактивированную в реакторе, смешивают с защитной средой в соотношении 1:
. Защитную среду используют следующего состава (об. %):
сахароза - 20;
желатин - 4;
пептон - 1;
фосфатный буфер - 75.
К смеси культуры и защитной среды добавляют простерилизованный 6% -ный гидрат окиси алюминия в количестве 20-25% к объему вакцины.
После добавления к сгущенной бактериальной массе среды высушивания и гидрата окиси алюминия получают концентрацию лептоспир в среднем 750 мл. м. к. / см3. Такое их количество содержится в 10 см3 поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных.
Приготовленную вакцину расфасовывают по 10 см3 во флаконы емкостью 20 см3. Кассеты с вакциной помещают на предварительно охлажденную этажерку и замораживают в морозильном столе НС 700/50 до конечной температуре в продукте минус 45-500 С в течение 12-14 часов. Далее вакцину перегружают в сублиматор установки LZ-45 или другие модели с предварительно охлажденным до минус 60-650 С конденсером (испарителем). После подключения системы контроля за параметрами полок и продукта, сублиматор герметизируют и камеру вакуумируют до предельного остаточного давления 4-6 Па.
Через 2-3 часа после вакуумирования включают подогрев полок (минимальный режим подогрева). В течение первых 3 часов сублимации температура понижается на 3-50 С за счет самоохлаждения при низком давлении.
В течение 30-35 часов проводят сублимацию влаги при температуре продукта от минус 40 до минус 200 С. Затем осуществляют быстрое поднятие температуры продукта до +240 С за 10-12 часов.
Далее досушивают биопрепарат при его конечной температуре 24-260 С в течение 22-24 часов.
На стадии десорбции происходит понижение температуры конденсата до начальной (минус 60-650 С) и давления в сублиматоре до 4-6 Па. Установление указанных параметров указывает на окончание процесса сушки. После этого камеру установки заполняют сухим очищенным азотом. Вакцину переносят в бокс, флаконы укупоривают стерильными пробками УЛ-1 и обкатывают алюминиевыми колпачками.
Контроль поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных
Контроль биопрепарата проводят путем определения следующих показателей:
стерильности;
безвредности;
активности;
концентрации водородных ионов (рН).
Определение внешнего вида, наличия механических включений. Для определения внешнего вида, наличия механических включений, плесени, неразбивающихся конгломератов все флаконы с вакциной встряхивают, просматривают в проходящем свете. Одновременно проверяют правильность маркировки.
Флаконы с вакциной должны быть без трещин, плотно укупорены, содержать прозрачную жидкость с серо-белым обильным осадком, без посторонних механических включений.
Определение стерильности. Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посев проводят из каждого флакона в объеме 0,2 см3 в пробирки с МПА, МПБ, средой Китта-Тароцци и Сабуро и по 2 см3 во флаконы с МПА, МПБ и средой Китта-Тароцци. Посевы производят в 2 пробирки и 2 флакона с каждой средой из каждого флакона вакцины. Через 2 суток из жидких питательных сред проводят пересев в указанном объеме в 2 пробирки с МПА, МПБ и средой Китта-Тароцци. Посевы на среде Сабуро выдерживают при 20-220 С, а на остальных средах при температуре 370 С. Первичные посевы выдерживают в течение 10, а вторичные - 8 суток.
В посевах на питательных средах рост микрофлоры должен отсутствовать.
Определение безвредности. Для проведения испытания используют 5 флаконов выборки с вакциной. Из каждого флакона отбирается стерильной пипеткой по 10 см3 вакцины в стерильный флакон. Смесь вакцины встряхивают м полученную общую пробу применяют для испытания.
Для проверки на безвредность вакцину вводят внутрибрюшинно 5 белым мышам массой 16-18 г в дозе 0,3 см3 и подкожно 3 морским свинкам массой 300-400 г в дозе 3,0 см3.
Вакцину считают безвредной, если все иммунизированные животные остаются клинически здоровыми и живыми в течение 10 суток наблюдения.
Определение активности. Активность вакцины проверяют на 5 кроликах массой 3-3,5 кг. Каждому кролику вакцину вводят с соблюдением правил асептики в ушную вену однократно в дозе 0,6-0,75 см3. Через 25 суток после введения вакцины у кроликов из ушной вены берут по 5 см3 крови, получают сыворотку и исследуют ее в реакции микроагглютинации (РМА) со всеми штаммами лептоспир, входящих в состав биопрепарата.
Каждую пробу сыворотки разводят физиологическим раствором от 1: 25 до 1: 1600. К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем антигена (культуру лептоспир). Культуры должны быть 5-10 суточного роста с накоплением 60-100 подвижных лептоспир в поле зрения микроскопа.
Контролем реакции служит смесь антигенов с физиологическим раствором по 0,1 см3, в которой лептоспиры должны оставаться подвижными, без видимых изменений морфологии, признаков агглютинации и лизиса.
Пластины, содержащие смесь сывороток с антигеном, помещают в термостат и выдерживают в течение одного часа при температуре 30-370С.