Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения
Трансгенные растения как биопродуценты белков
медицинского назначения
Успехи
в области генетической инженерии растений открыли новые возможности для
получения рекомбинантных белков. Для этой цели широко используются клетки
бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд
существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансля-ционная
модификация и правильная укладка (фолдинг) полипептидных цепей многих
эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых лишены
подобных недостатков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено
высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков (Russel, Clarke, 1999).
По
сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии растения имеют ряд
особенностей и преиму-ществ. Прежде всего необходимо отметить, что в клетках
высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым
в клетках млекопитающих. Культивирование растений не требует доро-гостоящего
оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность
реком-бинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний
и широкого терапевтического использования. В отличие от животных, растительные
клетки не содержат в своём составе патогенные для человека вирусы, а также
прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных
белков медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого
белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других
систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде
случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве
"съедобных вакцин" выделение белка в чистом виде не требуется. В
дополнение ко всему перенос фраг-ментов экзогенной ДНК в растительный геном и
регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными
(Daniell et al., 2001).
Известно,
что аппарат транскрипции и трансляции у растений является универсальным и может
быть адап-тирован не только для накопления гомологичных белков, не
синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных белков как
бактериального, так и животного происхождения. С другой стороны, сами растения
in vivo могут служить благоприятной средой для развития различных организмов -
бактерий и вирусов, геном которых может быть модифицирован и адаптирован для
синтеза соответствующих гетерологич-ных белков. Анализируя данные литературы, необходимо
отметить, что поиск различных систем для экспрессии чужеродных генов за
последние десять лет был связан с развитием трёх основных подходов.
Первым
из них был предложен путь использования трансгенных растений, в ядерный геном
которых перене-сены гены, контролирующие синтез соответствующих гетерологичных
белков (De la Riva, 1998). Получение таких растений было основано на природной
способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей
собственной ДНК в виде Т-области мегаплазмиды в растительные клетки. Именно эта
часть Ti-плазмиды была использована учёными для переноса генно-инженерных
конструкций, включающих различные целевые гены. В качестве целевых можно было
использовать и гены гетерологичных белков меди-цинского назначения. Необходимо
отметить, что использование только агробактериального переноса в значи-тельной
степени сужало круг растений-реципиентов и ограничивало его, как правило, до
двудольных. Поэтому дальнейшее развитие идеи использования растительного генома
для синтеза гетерологичных белков стимули-ровало поиск новых способов переноса
фрагментов экзогенной ДНК в геном растений. Были разработаны мето-ды прямой
доставки чужеродных генов в растительный геном, такие, как микроинъекции
(Neuhaus et al. , 1987), электропорация (Fromm et al. , 1985) и методы
биобаллистики (Klein et al. , 1987). В этом слу-чае для переноса использовалась
очищенная плазмидная ДНК, в которой содержались генетические конструк-ции с
целевыми генами.
При
переносе в геном растения чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются
и передаются по-томкам в последующих поколениях согласно законам Менделя
(Horsch et al., 1984; Budar et al. , 1986; De-roles, Gardner, 1988;
Heberle-Bors et al. , 1988).
Хотя
идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки
соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот
подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них не-обходимо отметить низкий
уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных
промоторов. Содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях
табака составило 0,02 % от суммарного белка (Sijmons et al. , 1990). Ещё
меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003 %) и b-интерферона (0,001 %) (Edelbaum, 1992;
Kusnadi et al. , 1997). Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение
скорости деградации мРНК чужеродно-го гена, когда её уровень достигает
порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты
растения от РНК-содержащих вирусов (Matzke et al. , 1994; Matzke M., Matzke A.,
1995; Vaucheret, 2001). Второй причиной низкого уровня продукции является
протеолиз чужеродных белков в цитоплазме расти-тельной клетки. Введение в
полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляю-щих
его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота
протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности
трансгенных растений в 100 раз (Giddings et al. , 2000; Menassa et al. , 2001).
Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации
ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению
продуктивности на 2-3 порядка. Так, содер-жание химерного энкефалина человека в
семенах трансгенного A. thaliana составило 2,9 % от суммарного белка. Этого
удалось достичь введением в полипептидную цепь энкефалина сигнальной
последовательности глю-телина (запасного белка риса), направляющей его
транспортировку в компартменты накопления запасных белков. Химерный ген
находился под контролем промотора гена глютелина, который направлял его
тканеспецифичную транскрипцию в клетках запасной ткани семян (Vandekerckhove et
al. , 1989).
Интеграция
чужеродных генов в ядерный геном растения сопряжена и с рядом проблем
биобезопасности использования генетически модифицированных организмов. При
получении трансгенных растений в сель-скохозяйственных масштабах существует
опасность утечки трансгена в окружающую среду (выход из-под контроля) в
результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Для
повышения уров-ня биобезопасности рядом исследователей было предложено
использовать для трансгенеза стерильные по мужской линии растения (Menassa et
al. , 2001).
Другой
проблемой, возникающей при интеграции гетерологичных генов в ядерный геном
растений, явля-ется вероятность "замолкания" трансгенов в последующих
поколениях (сайленсинг). Вероятность сайлен-синга резко возрастает при
встраивании множества копий чужеродного гена на геном растения (Finnegan,
McElroy, 1994; Matzke et al. , 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Поэтому при
создании трансгенных растений-биопродуцентов рекомбинантных белков среди
трансформантов отбирают растения, содержащие только одну встройку чужеродного
гена.
В
связи с вышеперечисленными проблемами, возникающими при интеграции трансгенов в
ядерный ге-ном, весьма привлекательным представляется способ переноса
экзогенной ДНК в геном хлоропластов. Хлоропласты - органеллы растительной
клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, а также ряд дру-гих пигментов,
принимающих участие в поглощении световой энергии и осуществлении
фотохимических реак-ций. По форме и размерам хлоропласты высших растений
достаточно однородны. Некоторая вариабельность наблюдается в отношении их числа
в расчете на одну клетку, которое варьирует от нескольких десятков до сот-ни и
более. Каждый отдельный хлоропласт окружен двойной мембраной и имеет сложную
внутреннюю структу-ру. В одной растительной клетке в среднем содержится от 5 до
10 тыс. копий хлоропластной ДНК, за счёт чего уровень экспрессии чужеродных
белков достигает значений, сравнимых с уровнем экспрессии в E. coli (до 40 % от
суммарного белка клетки) (Staub et al. , 2000; De Cosa et al. , 2001). Однако в
литературе встречаются только единичные работы по получению растений с
генетически модифицированными хлоропла-стами. Это связано с чрезвычайной
сложностью методов их трансформации и последующего отбора.
Третий
путь использования растений для накопления белков гетерологичного происхождения
основан на природной способности растительных вирусов проникать в клетки
растений и колонизировать растительные тка-ни (Mushegian, Shepherd, 1995). На
этой основе возникает реальная возможность модификации вирусного гено-ма и
адаптации его не только в качестве вектора для доставки в растения
соответствующих генетических конст-рукций, но и в качестве матриц для
транзиентной экспрессии генов, кодирующих синтез белков, представляющих
коммерческий интерес. Для заражения растительных тканей используются
рекомбинантные (+)РНК-содержащие вирусы растений, несущие в составе своего
генома транскрипт чужеродного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Скорость
мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего
достигается высокая ко-пийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме
заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем
на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений (Giddings
et al. , 2000).
В
настоящее время широко используются два вида вирусов для продукции чужеродных
белков в растениях: ви-рус табачной мозаики (ВТМ) и вирус мозаики коровьего
гороха (ВМКГ). Вектор на основе РНК ВТМ использовался для получения ингибитора
репликации ВИЧ α-трихосантина в
Nicotiana benthamiana (Kumagai et al. , 1993). Для этого целевую
последовательность, кодирующую α
-трихосантин, поместили под субгеномный промотор белка оболочки ВТМ. Спустя две
недели после заражения рекомбинантный α
-трихосантин накапливался в листьях N. Benthamianaв количестве 2 % от
суммарного белка. На основе ВМКГ удалось получить химерные частицы этого вируса
с экспонированными на поверхности антигенными детерминантами ВИЧ1 (gp41) (Porta
et al. , 1996). Для этого последовательность эпитопа gp41 была
"сшита" с геном белка оболочки ВМКГ. Такие частицы обладали высокой
иммунногенностью и были способны нейтрализовать инфекционные свойства ВИЧ1 in
vivo.
Сравнивая
пути наработки гетерологичных белков в растительных тканях, необходимо
отметить, что каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. В трансгенных
растениях перенесенные гены стабильно встраиваются в геном и сохраняются в
последующих поколениях, тогда как при интеграции генов в геном вирусов в
зараженных вирусами растениях обеспечивается их временная (транзиентная)
экспрессия. Накопление соответствующих бел-ковых продуктов будет определяться
периодом вегетации зараженного растения-хозяина. С другой стороны,
пре-имуществом вирусного пути накопления белков в растениях является короткий
период размножения вирусных час-тиц, простота инфицирования растений, а также
широкий диапазон различных видов растений, которые могли бы быть использованы
для этих целей.
Растения-продуценты антител
Цель
иммунизации организма вакцинами - индуцировать продукцию антител на патогенный
агент. Альтерна-тивой такому подходу является метод пассивной иммунизации,
основанный на введении готовых иммуноглобу-линов. Широкое применение такого
подхода долгое время было ограничено высокой стоимостью антител, полу-чаемых
традиционными способами. В 1989 г. была показана возможность сборки
функционально активных им-муноглобулинов класса IgG и IgA из лёгкой и тяжёлой
цепей в растениях табака (Hiatt et al. , 1989). С того момента в нескольких
крупных лабораториях мира были получены трансгенные растения-продуценты
различных типов антител к эпитопам ряда патогенных агентов. В таблице 1
представлена сводка этих результатов.
Таблица
1
Растения-продуценты
антител
Применение и специфичность
|
Класс антител
|
Растение-продуцент
|
Уровень продукции
|
Лит. ссылка
|
Зубной кариес; стрептококковый
антиген
|
IgA-IgG
|
Табак
|
500 мкг/г сырого веса
|
Ma et al. 1995, 1998
|
Вирус простого герпеса 2
|
IgG
|
Соя
|
Нет данных
|
Zeitlin et al. 1998
|
Диагностика ряда заболеваний;
антитела, специфичные к IgG человека
|
IgG
|
Люцерна
|
1 % суммарного белка
|
Khoudi et al. 1999
|
Терапия рака; раковый
эмбриональный антиген
|
ScFv
|
Пшеница
Рис
|
900 нг/г сырого веса (листья)
1,5 мкг/г сырого веса (семена)
29 мкг/г сырого веса (листья)
32 мкг/г сырого веса (семена)
|
Stoger et al.
2000; Torres et al. 1999
|
Как
видно из таблицы 1, к настоящему времени получены трансгенные растения табака,
люцерны, пшеницы, риса и сои. Среди этих растений выделяются две группы:
продуценты иммуноглобулинов к антигенам двух пато-генных агентов (стрептококк и
вирус простого герпеса второго типа) и антител, специфичных к раковому
эмбрио-нальному антигену и к IgG человека.
Анализируя
уровень экспрессии перенесённых генов в геноме растений-биопродуцентов антител,
можно отме-тить, что уровень продуктивности иммуноглобулина к поверхностному
антигену Staphylococcus mutants в растениях табака оказался наиболее высоким и
составил 500 мкг/г сырого веса (табл. 1). Такие антитела, выделен-ные из
трансгенных растений табака, предупреждали развитие кариеса у пациентов при
непосредственном нане-сении их на зубную эмаль и не уступали по своим свойствам
аналогичным антителам, получаемым из гибридомы мышей.
Иммуноглобулины
к раковому эмбриональному антигену были получены в трансгенных растениях риса и
пшеницы (табл. 1). Такие антитела используются в иммунотерапии онкологических
заболеваний, а также для визуализации опухоли in vivo.
Трансгенные
растения рассматриваются как потенциальный недорогой источник иммуноглобулинов
для ме-дицинских и исследовательских целей. На рисунке представлена динамика
стоимости одного грамма чистого IgA, производимого в разных экспрессирующих
системах, по оценкам компании "Planet Biotechnology" (Daniell et al.
, 2001). Из графика видно, что уровень экспрессии значительно влияет на
конечную стоимость IgA в случае продукции в культуре клеток млекопитающих и
молоке трансгенных животных. В меньшей степени зави-симость цены от уровня
экспрессии наблюдается при использовании трансгенных растений. Это связано с
тем, что конечная цена рекомбинантного белка складывается из стоимости
наработки сырого материала и стоимости его выделения. Считается, что стоимость
очистки приблизительно одинакова для всех систем, а различие обу-словлено
затратами при наработке сырого материала, которая в клетках млекопитающих и
трансгенных живот-ных гораздо выше.
Растения-продуценты субъединичных вакцин
Трансгенные
растения-продуценты эпитопов болезнетворных агентов человека и животных
получили название "съедобных вакцин". Механизм иммунизации такими
вакцинами основан на антигенпредставляющей способности перитонеальных
макрофагов тонкого кишечника млекопитающих. В кишечнике чужеродный белок,
обладающий антигенными свойствами, распознается специальными М-клетками,
которые широко представлены в толще слизи-стого эпителия. М-клетки
транспортируют захваченный антиген к перитонеальным макрофагам и В-лимфоцитам,
находящимся в лимфоидных образованиях тонкого кишечника (пейеровых бляшках). В
результате презентации антигена на поверхности антиген-представляющих клеток
происходит активация T-лимфоцитов-хэлперов, которые в сочетании с антигеном
активируют В-лимфоциты. Дифференцированные В-клетки выходят из лимфоидных
фолликулов слизистой оболочки и посту-пают через общую циркуляцию в
мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превра-щение
в плазматические клетки, синтезирующие специфические к антигену антитела.
Плазматические клетки спо-собны снова мигрировать к слизистым оболочкам
дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трак-тов. Секреторные
иммуноглобулины IgA транспортируются на поверхность слизистых оболочек, где они
связыва-ются с чужеродными агентами и препятствуют их проникновению в организм.
Следует отметить, что мукозная вак-цинация стимулирует как иммунный ответ
слизистых оболо- чек - первого защитного барьера на пути патогенных агентов,
так и общий иммунный ответ организма (Walmsley, Arntzen, 2000).
Рис.
Динамика цены за 1 грамм рекомбинантного IgA, полученного из разных
экспрессирующих систем в зависимости от уровня экспрессии. I - культура клеток
млекопитающих; II - молоко трансгенной козы; III - трансгенные растения
(семена); IV - трансгенные растения (зелёная биомасса) (По: Daniell et al., 2001).
Таблица
2
Антигены,
экспрессированные в растениях
Патогенный агент или токсин
|
Растение-продуцент
|
Антиген
|
Ссылка
|
Вирус гепатита В
|
Табак
Картофель
Люпин
Салат
|
HbsAg
|
Mason et al.,
1992; Thanavala et al., 1995; Richter et al., 2000; Kapusta et al., 1999
|
Вирус бешенства
|
Томаты
|
Гликопротеин вируса бешенства
|
Энтеропатогенная E. Coli
|
Табак
Картофель
Кукуруза
|
В-субъединица энтеротоксина E.
Coli
|
Haq et al.,
1995; Masonet al., 1998; Streatfield et al., 2000
|
Холерный вибрион
|
Картофель
|
В-субъединица токсина V.
Cholerae
|
Arakawa et al., 1997
|
Вирус ящура
|
A. thaliana
Люцерна
|
VP1
|
Carrillo et
al., 1998; Wigdorovitz et al., 1999
|
Streptococcus mutants (зубной
кариес)
|
Табак
|
S. mutants поверхностный
антиген SpaA
|
Tacket, Mason, 1999
|
Цитомегаловирус
|
Табак
|
Гликопротеин В
|
Tackaberry et al., 1999
|
Вирус Норфолк
|
Табак
Картофель
|
Антиген капсида вируса Норфолк
|
Mason et al.,
1996; Tacket et al., 2000
|
ВИЧ1
|
Табак
|
gp120
|
Giddings et al., 2000
|
Вирус трансмиссивного
гастроэнтерита свиней
|
A. thaliana
Табак
Кукуруза
|
Гликопротеин S коронавируса
|
Tuboly et al.,
2000; Streatfield et al., 2000
|
К
настоящему времени получены трансгенные растения табака, картофеля, люпина,
салата, томатов, кукуру-зы, A. thaliana и люцерны, синтезирующие антигены
различных инфекционных патогенов человека и жи-вотных (табл. 2).
Первыми
"съедобными вакцинами" были трансгенные растения табака и картофеля,
экспрессирующие по-верхностный антиген вируса гепатита человека HbsAg (Mason et
al., 1992). Скармливание клубней картофеля-продуцента HbsAg мышам стимулировало
развитие мукозного (слизистого) и общего гуморального иммунного от-вета
(Thanavala et al., 1995).
Токсины,
выделяемые энтеропатогеннной E. Coli и холерным вибрионом, вызывают
желудочно-кишечные расстройства у человека и животных и являются сильными
оральными иммуногенами. При попадании в кишечник токсины вызывают продукцию
специфических IgG и IgA иммуноглобулинов. Созданы трансгенные расте-ния табака,
картофеля и кукурузы, синтезирующие В-субъединицу энтеротоксина E. Coli (табл.
2). Была про-анализирована степень протективности иммунитета, приобретенного
мышами при оральной вакцинации трансген-ным картофелем. Иммунизированные мыши
обладали устойчивостью к действию орально вводимого токсина по сравнению с
контрольной группой, потреблявшей нетрансгенные клубни, хотя уровень
устойчивости был ниже, чем у мышей, иммунизированных введением в желудок
эквивалентного количества В-субъединицы природного токсина. Полученные на
животных моделях результаты по выработке защитного иммунитета против
энтеропатогенной E. coli были подтверждены в дальнейшем в клинических
исследованиях на добровольцах (Tacket et al., 2000). В аналогичной работе
(Arakawa et al., 1997) было показано развитие защитного иммунитета у мы-шей
после скармливания клубней трансгенного картофеля, экспрессирующего
В-субъединицу токсина V. cholerae. Иммунизация сопровождалась выработкой
антител классов IgG и IgA.
Не
останавливаясь подробно на других антигенах, приведённых в таблице 2, следует
отметить, что практиче-ски во всех полученных растениях-продуцентах происходила
сборка индивидуальных молекул антигена в мульти-мерные комплексы или
вирусоподобные частицы, которые стимулировали развитие как мукозного, так и
общего гуморального иммунного ответа при скармливании экспериментальным
животным. Основные преимущества "съе-добных вакцин" - экономичность,
безопасность и доступность для широкой иммунопрофилактики населения.
Таблица
3
Фармацевтические
белки, полученные в трансгенных растениях
Применение
|
Растение-продуцент
|
Фармацевтический белок
|
Уровень продукции (в % от
суммарного растворимого белка)
|
Ссылка
|
Анестезия
|
A. thaliana
|
Энкефалин
|
2,9 (семена)
|
Vandekerckhove et al., 1989
|
Цирроз печени, ожоги, хирургия
|
Табак
|
Сывороточный альбумин
|
0,02
|
Sijmons et al., 1990
|
Косметология
|
Табак
|
Гомодимер коллагена
|
0,01
|
Ruggiero et al., 1990
|
Лечение гепатитов С и В
|
Табак
|
b-интерферон
|
0,001
|
Edelbaum, 1992
|
Заживление ран
|
Эпидермальный фактор роста
|
0,001
|
Higo, 1993
|
Ингибитор тромбина
|
Рапс
|
Гирудин
|
0,3 (семена)
|
Parmenter et al., 1995
|
Анемия
|
Табак
|
Эритропоэтин
|
0,003
|
Kusnadi et al., 1997
|
Заменитель крови
|
Табак
|
Гемоглобин a, b
|
0,05 (семена)
|
Dieryck et al., 1997
|
Заменитель материнского молока
|
Картофель
|
Казеин
|
0,01
|
Chong et al., 1997
|
Фиброзный кистоз, кровотечения
|
Рис
|
a-1-антитрипсин
|
Нет данных
|
Giddings et al., 2000
|
Антикоагулянт
|
Табак
|
Белок С
|
0,01
|
Cramer et al., 1999
|
Ингибитор трипсина
|
Кукуруза
|
Апротонин
|
Нет данных
|
Zhong et al., 1999
|
Гормон роста
|
Табак
|
Соматотропин
|
0,16 (семена)
|
Leite et al., 2000
|
Антимикробное средство
|
Картофель
|
Лактоферрин
|
0,1
|
Chong et al., 2000
|
Синдром Гоше
|
Табак
|
Глюкоцереброзидаза
|
1-10
|
Giddings et al., 2000
|
Воспалительные заболевания
кишечника
|
Табак
|
Интерлейкин-10
|
0,0055
|
Menassa et al., 2001
|
Нейропения
|
Табак
|
ГМ-КСФ
|
0,03 (семена)
|
Sardana et al., 2002
|
Иммунотерапия рака
|
Картофель
|
Интерлейкин-2
|
0,06
|
Park, Cheong, 2002
|
Болезнь Педжета, остеопороз
|
Картофель
|
0,02
|
Ofoghi et al., 2000
|
Растения-продуценты фармацевтических белков
За
последние несколько лет в ведущих биотехнологических центрах мира созданы
трансгенные растения-продуценты широкого спектра гормонов, цитокинов, факторов
роста и ферментов, имеющих потенциальное применение в фармакологии (табл. 3).
Все они не уступали по биологической активности аналогам, получаемым из других
систем экспрессии.
По
закону, принятому Всемирной организацией здравоохранения, любые предлагаемые
источники лекарствен-ных препаратов, в частности трансгенные растения, должны
быть зарегистрированы и пройти серию клинических испытаний. Первые клинические
испытания трансгенных растений риса, синтезирующих активный человеческий
a-1-антитрипсин для терапии фиброзного кистоза, были начаты в 1998 г.
Производство
рекомбинантных белков для медицинских целей с использованием традиционных
систем тре-бует значительных финансовых затрат. Так, например, недостаток
лизосомального фермента гликоцеребрози-дазы в организме вызывает синдром Гоше.
Единственным видом терапии этого заболевания является внутри-венное введение
гликоцереброзидазы. Долгое время этот белок получали из плаценты человека, на
поддержа-ние жизни одного пациента в течение года требовалось 160000$.
Переключение продукции гликоцереброзидазы на культуру клеток млекопитающих
снизило стоимость этого препарата, однако не вытеснило его из группы
"са-мых дорогих лекарств в мире". В 1999 г. сотрудниками корпорации
CropTech было показано, что трансгенные растения способны синтезировать
биологически активную гликоцереброзидазу человека. В дальнейшем были получены
высокопродуктивные трансгенные растения табака, в которых содержание
гликоцереброзидазы чело-века варьировало от 1 до 10 % TSP. Ожидается, что
получение рекомбинантной гликоцереброзидазы из таких растений позволит
значительно снизить её стоимость (Giddings et al., 2000).
В
заключение хотелось бы отметить, что несмотря на значительные достижения в
области продукции реком-бинантных белков медицинского назначения в растениях,
это направление находится лишь на начальном этапе своего развития.
Учёные-биотехно-логи уверены, что в будущем рекомбинантные препараты,
получаемые из генетически модифицированных растений, заменят дорогостоящие
бактериальные и животные аналоги на фар-мацевтическом рынке. "Съедобные вакцины"
позволят значительно усовершенствовать программы всеобщей иммунизации, особенно
для населения развивающихся стран.
Список литературы
Arakawa T., Chong D., Merritt J. et al. Expression of cholera and toxin B subunit oligomers in transgenic
potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.
Budar F., Thia-Toong, Van Montagu M. Agrobacterium-mediated gene
transfer results mainly in transgenic plants trans-mitting T-DNA as a single
Mendelian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.
Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J. et al. Protective immune
response to foot-and-mouth disease virus with VP1 ex-pressed in transgenic
plants // J. Virol. 1998. V. 72. P. 1688-1690.
Chong D., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of human milk
protein b-casein in transgenic potato plants // Trans-genic Res. 1997. V. 6. P.
289-296.
Chong D., Langridge W. Expression of full length bioactive
antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9.
P. 71-78.
Cramer C., Boothe J., Oishi K. Transgenic plants for therapeutic
proteins: linking upstream and downstream technolo-gies // Current Topics in
Microbiоl. and Immunol. 1999. V. 240. P. 95-118.
Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming:
production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants //
Trends in Plant Sci. 2001. V. 6. P. 219-226.
Deroles S.C., Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a
large number of transgenic petunias generated by Agro-bacterium-mediated transformation
// Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.
De Cosa B., Moar W., Lee S. et al. Overexpression of Bt cry2Aa2
operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals // Nature
Biotechnol. 2001. V. 19. P. 71-74.
De la Riva G., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Pardo C.
Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation //
Electronic J. of Biotechnol. 1998. V. 1, № 3. www.ejb.org.
Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from
transgenic tobacco // Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.
Edelbaum O., Stein D., Holland N. et al. Expression of active human
interferon-beta in transgenic plants // J. of Interferon Res. 1992 V. 12. P.
449-453.
Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: Plants fight back!
// Bio/Technology. 1994. V. 12. P. 883-887. Fromm E.M., Taylor L.P., Walbot V.
Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by
electropora-tion // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5825.
Giddings G., Allison G., Brooks D., Carte A. Transgenic plants as
factors for biopharmaceuticals // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1151-1155.
Haq T., Mason H.S., Clements J. et al. Oral immunization with a
recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995.
V. 268. P. 714-716.
Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D. et al. Genetic analysis of
T-DNA insertion into tobacco genome // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 571-574.
Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in
transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.
Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized
gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic
virus 35S promoter in transgenic tobacco // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry.
1993. V. 57. P. 1477-1481.
Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of
functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223. P. 496-499.
Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived
edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.
Khoudi H., Laberge S., Ferullo J. et al. Production of diagnostic
monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Bio-technology and
Bioengineering. 1999. V. 64. P. 135-143.
Klein T., Wolf D., Wu R., Sanford J. High-velocity microprojectiles
for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. V. 327. P.
70-72.
Kumagai M., Turpen T.H., Weinzettl N. et al. High-level expression
of biologically active alpha-trichosanthin in trans-fected plants by an RNA
viral vector // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 427-430. Kusnadi A.
Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical
considerations // Biotechnology and Bioen-gineering. 1997. V. 56. P. 473-484.
Leite A., Kemper E. Expression of correctly processed human growth
hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mo-lecular Breeding. 2000. V.
6. P. 47-53.
Ma J., Hiatt A., Hein M. et al. Generation and assembly of secretory
antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.
Ma J., Hikmat B., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant
plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans //
Nature Medicine. 1998. V. 4. P. 601-606. Mason H., Lam D., Arntzen C.
Expression hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl Acad.
Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.
Mason H., Ball J., Shi J. et al. Expression of Norwalk virus capsid
protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice //
Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V. 33. P. 5335-5340.
Mason H., Haq T., Clements J. et al. Edible vaccine protect mice
against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a
synthetic LT-B gene // Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.
Matzke M., Matzke A. How and why do plants inactivate homologous
transgenes? // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.
Matzke A., Neuhuber F., Park Y. et al. Homology-dependent gene
silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple
copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.
McGarvey P., Hammond J., Dienelt M. et al. Expression of the rabies
virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotech-nology. 1995. V. 13. P.
1484-1487.
Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A. et al. A self-contained system
for the field production of plant recombinant inter-leukin-10 // Mol. Breeding.
2001. V. 8. P. 177-185.
Mushegian A., Shepherd R. Genetic elements of plant viruses as tools
for genetic engineering // Microbiol. Rev. 1995. V. 12. P. 548-578.
Neuhaus G., Spandenberg G., Mittelstein O. et al. Transgenic rapesee
plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids
// Plant J. 1987. V. 75. P. 30-36.
Ofoghi H. Cloning and expression of human calcitonin genes in
transgenic potato plants // Biotechnol. Lett. 2000. V. 22. P. 611-615.
Park Y., Cheong H. Expression and production of recombinant human
interkeukin-2 in potato plants // Protein Expres-sion and Purification. 2002.
V. 25. P. 160-165.
Parmenter D., Boothe J.G., van Rooijen G. et al. Production of
biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant
Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.
Porta C., Spall V., Lin T. et al. The development of cowpea mosaic
virus as a potential source of novel vaccines // Intervi-rology. 1996. V. 39.
P. 79-84.
Richter L., Thanavala Y., Arntzen C. et al. Production of hepatitis
B surface antigen in transgenic plants for oral immuni-zation // Nature
Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.
Ruggiero F., Exposito J., Bournat P. et al. Triple helix assembly
and processing of human collagen produced in trans-genic tobacco plants // FEBS
Lett. 1990. V. 469. P. 132-136.
Russel C., Clarke L. Recombinant proteins for genetic disease //
Clinical Genet. 1999. V. 55. P. 389-394.
Sardana R., Alli Z., Dudani A. et al. Biological activity of human
granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a fusion with
seed glutelin peptide // Transgenic Res. 2002. V. 5. P. 521-531.
Sijmons P., Dekker B., Schrammeijer B. et al. Production of
correctly processed human serum albumin intransgenic plants // Bio/Technology.
1990. V. 8. P. 217-221.
Staub J., Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a
human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Na-ture Biotechnol.
2000.V. 18. P. 333-338.
Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable
production and storage systems for phar-maceutical scFv antibodies // Plant
Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.
Streatfield S., Jilka J., Hood E. et al. Plant-based vaccines:
unique advantages // Vaccine. 2000. V. 19. P. 2742-2748.
Tackaberry E., Dudani A., Prior F. et al. Development of
biopharmaceuticals in plant expression systems: cloning, ex-pression and
immunological reactivity of human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in
seeds of transgenic to-bacco // Vaccine. 1999. V. 17. P. 3020-3029.
Tacket C., Mason H., Losonsky G. et al. Human immune responses to a
novel Norwalk virus vaccine delivered in trans-genic potatoes // J. of
Infectious Diseases. 2000. V. 182. P. 302-305.
Tacket C., Mason H. A review of oral vaccination with transgenic
vegetables // Microbes and Infection. 1999. V. 1. P. 777-783.
Thanavala Y., Yang Y., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic
plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995.
V. 92. P. 3358-3361.
Torres E., Vaquero C., Nicholson L. et al. Rice cell culture as an
alternative production system for functional diagnostic and therapeutic
antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441-449.
Tuboly T., Yu W., Bailey A. et al. Immunogenicity of porcine
transmissible gastroenteritis virus spike protein ex-pressed in plants //
Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.
Vandekerckhove J. Enkephalines produced in transgenic plants using
modified 2S storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929-932.
Vaucheret H., Beclin C., Fagard M. Post-transcrip-tional gene
silencing in plants // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3083-3091.
Walmsley A., Arntzen C. Plants for delivery of edible vaccines //
Current Opinion in Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.
Wigdorovitz A., Carrillo C., Dus Santos M. et al. Induction of a
protective antibody response to foot and mouth disease in mice following oral
or parenteral immunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral
structural protein VP1 // Virology. 1999. V. 255. P. 347-353.
Zeitlin L., Olmsted S., Moench T. et al. A humanized monoclonal
antibody produced in transgenic plants for immunoprotec-tion of the vagina
against genital herpes // Nature Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1361-1364.
Zhong G., Peterson, D., Delaney D. et al. Commercial production of
aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breeding. 1999. V. 5. P.
345-356.
1
А.А. Турчинович, аспирант
1
Е.В. Дейнеко, к.б.н., зам. зав. лабораторией гетерозиса растений
2
М.Л. Филипенко, к.б.н., зав. сектором фармакогеномики
2
Е.А. Храпов, ст. инженер сектора фармакогеномики
1
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
2
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск