Поиск и оптимизация условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами экономически значимого продукта

Поиск и оптимизация условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами экономически значимого продукта

Шулюпин О.К.

Пущино 2012

Список используемых сокращений.

ПК - персональный компьютер

ЦП - целевой продукт микробиологического синтеза

ВП - выход процесса (уровень синтеза целевого продукта)

ОЭ - отсеивающий эксперимент, задача которого состоит в уменьшении

количества изучаемых переменных, нахождении сильнодействующих

на ВП факторов и отбрасывании нейтральных

ПФЭ - полный факторный эксперимент

ДУПФЭ - двухуровневый полный факторный эксперимент

ПОСЛУ - плохо обусловленная система линейных уравнений

СЛУ - система линейных уравнений

ИФА - иммуноферментный анализ

Аннотация

В предлагаемой работе рассмотрена задача прикладной микробиологии по поиску компонентов питательной среды и условий культивирования, влияющих на синтез экономически значимого продукта (ферменты, антигены, антибиотики).

Представлен разработанный двухуровневый план отсеивающего эксперимента с 15^ю проверяемыми факторами на 16^ти экспериментальных точках, близкий к оптимальному по равномерному учету сочетаний пар факторов в серии экспериментов. План единственный и оптимальный для случая отсутствия априорной информации и указанных количеств факторов, позволяет проверить до 30 факторов при размещении нового фактора на каждом уровне.

Предлагается алгоритм построения двухуровневых планов второго шага, уточняющих найденные факторы, увязанные с полученной информацией. Построен близкий к оптимальному трехуровневый план переходного к оптимизации эксперимента, позволяющий уточнить уровни и факторы при проверке 5 факторов на 8 экспериментальных точках. Предлагается новая форма записи, уменьшающая вероятность ошибки при экспериментальной постановке.

Рассмотрены ограничения двухуровневого полного факторного эксперимента при решении задач нахождения оптимальных условий культивирования как некорректно поставленной задачи и предложен путь регуляризации через оценки значимости коэффициентов полинома с применением непараметрических критериев, построения графиков, корреляционных таблиц и корреляционных полей до решения системы линейных уравнений.

Предисловие

Развитие биотехнологии, совершенствование рационов вскармливания сельскохозяйственных животных и растений, расширение производства пищевых добавок для людей ставят задачу быстрого поиска компонентов питания с повышенной биологической активностью. В опубликованной литературе задачи оптимизации рационов разработаны достаточно глубоко, но задачи оптимального поиска компонентов питания с повышенной биологической активностью разработаны слабее и на наш взгляд не отвечают современным потребностям промышленности и сельского хозяйства.

В предлагаемой работе рассмотрены в первую очередь задачи поиска, близкого к оптимальному, физиологически активных компонентов пищи (нутриентов), необходимых разнообразным живым системам для интенсивного роста и синтеза биологически активных соединений (экономически важного целевого продукта).

Наиболее полно в существующей литературе эти вопросы рассмотрены для микроорганизмов в классическом руководстве Максимова, Федорова /1/, но эта монография уже давно стала библиографической редкостью. К тому же методы обработки результатов активного поиска (отсеивающего эксперимента) рассмотрены недостаточно полно, не отражено применение компьютеров при обработке результатов, слабо рассмотрены ограничения ДУПФ, сильный акцент на ручные вычислительные операции и от читателя требуется достаточно высокая математическая подготовка, что ограничивает контингент потенциальных пользователей.

В предлагаемой работе предпринята попытка ликвидировать или сократить перечисленные пробелы. Первоначально рассмотрены задачи планирования и обработки результатов активных экспериментов при проведении поиска, близкого к оптимальному. Предложены критерии оптимальности построения серии поисковых экспериментов на основе насыщенных и сверхнасыщенных планов отсеивающего эксперимента. Эта часть работы не требует повышенной математической подготовки, но подразумевает достаточно развитую интуицию исследователя. По нашему мнению, без интуиции поисковые работы проводить не рационально, поскольку первоначальный выбор подозреваемых переменных и их уровней (интенсивностей) не формализуем, и лежит вне математики.

Далее рассмотрены ограничения двухуровневых полного и дробного факторных экспериментов для нахождения области, близкой к оптимальной. Эта часть предполагает наличие повышенной математической подготовки и более углубленного рассмотрения материала при наличии хорошего пространственного воображения, но без участия интуиции.

На основании собственных и опубликованных в доступной литературе результатов, рассмотрено применение отсеивающего эксперимента (ОЭ) и двухуровневого полного факторного эксперимента (ДПФЭ) при изучении влияния условий культивирования бактерий на синтез белков (ферменты антигены), представляющих экономический интерес. Экспериментальная часть работы была сделана на базах ИБФМ РАН (Пущино) и бывшего ВНИИ прикладной микробиологии, ныне Гос НИИ ПМ, бывшей фирмы “Диавак ”(Оболенск, Моск. Обл.).

Поскольку личный опыт автора основан на работе с бактериями, а так же то, что микроорганизмы являются наиболее простыми из самостоятельно живущих организмов и, возможно, наиболее значимыми элементами в процессах биотехнологии, то основные примеры приведены из области микробиологии. По нашему мнению, предлагаемые математические и методологические подходы могут быть легко обобщены и для более сложных продуцентов, поскольку регуляция активности оперона условиями внешней среды одинакова для всех известных организмов / 15/.

Методологическое обоснование

Из всех биологических наук микробиология - наиболее точная и наиболее математизированная. Ряд задач микробиологии невозможно решить без математической обработки результатов измерений, по крайней мере, некоторых свойств и параметров микробиологической популяции и без применения хотя бы простейших математических моделей. Важность такого подхода подтверждается тем, что микроорганизмы являются продуцентами многих уникальных физиологически активных соединений, к которым можно отнести ферменты, антигены, антибиотики как наиболее значимые.

Современные технологические процессы невозможно вести без применения математики. Рост фармацевтической промышленности и биотехнологии в последнее время вызывает увеличение спроса на промышленно важные микроорганизмы.

Многие микроорганизмы способны синтезировать ряд ЦП, которые не синтезируют другие организмы. Но нередко перспективный штамм производит синтез экономически важного целевого продукта при выращивании на плотной питательной среде и не способен синтезировать его при глубинном культивировании. Возможен вариант, когда глубинное культивирование на питательных средах с использованием гидролизатов и вытяжек из сырья природного происхождения не обеспечивает стабильного получения ЦП и выход ЦП сильно зависит от партии питательной среды. Это ухудшает технологические показатели продуцента и может служить основанием для отказа от такого микроба при использовании в промышленных масштабах. В таком случае можно говорить о наличии метаболизируемых ингибиторов или индукторов нужного синтеза. Молекулярное клонирование и прочие генно-инженерные операции не решают проблемы, поскольку в изученный продуцент переносят рекомбинантную ДНК вместе с регуляторными участками. Необходимо проводить комплексное изучение продуцента.

Встает вопрос о возможности нахождения регуляторных факторов и переходе к управляемому культивированию. Названную операцию можно осуществить, если производить целенаправленный активный поиск регуляторных факторов.

Процесс поиска осложняется тем, что в качестве регуляторного фактора могут выступать несколько индивидуальных химических соединений разных классов (минеральные компоненты, углеводы, источники азота и т. д.), либо иных условий культивирования (рН, аэрация) действующих одновременно и взаимовлияюще [1]

На наш взгляд, проще производить поисковую работу, если проводить поиск на синтетических средах и средах контролируемого химического состава, что достаточно доступно на современном уровне. Поскольку теоретически возможное сочетание различных комбинаций факторов весьма велико, то необходимо вести некий оптимальный поиск. Так как каждый микроб достаточно ограничен в своих потенциальных возможностях, то задача имеет решение. Подобные работы уже проводили неоднократно и в литературе описаны ряд планов поиска, близких к оптимальному. Критерии оптимальности в большинстве случаев не сформулированы. Отсутствуют опубликованные правила построения и условия применения планов поиска, работу во многом производили на интуитивном уровне, не указаны ряд, на наш взгляд, существенных моментов поиска.

Применение микроорганизмов в технологическом процессе предъявляет ряд требований к свойствам промышленного штамма - глубинное культивирование, рентабельный выход ЦП, безопасность для окружающей среды, наличие нескольких селективных маркеров, желателен выход ЦП в культуральую среду, низкий уровень спонтанного мутагенеза и т.д..

Знание общих закономерностей питания микроорганизмов мало что дает при работе с конкретным продуцентом. Необходима стратегия поиска лимитирующих, ингибирующих и индуцирующих нужный синтез факторов (регуляторных факторов) среди множества возможных кандидатов из многочисленных потенциально осуществимых условий культивирования.

Выяснение количества и роли регуляторных факторов позволяет решить вопрос о целесообразности применения мутагенеза и перехода от дикого штамма к более технологичному мутанту.

Задача поиска регуляторных факторов осложняется наличием значительного межфакторного взаимодействия (сильная кривизна поверхности отклика - зависимости ВП от условий культивирования). При таких начальных условиях серия однофакторных экспериментов дает мало информации, а в ряде случаев, при наличии нескольких регуляторных факторов, в принципе не позволяет решить задачу поиска. Необходимо проводить многофакторный поиск, используя индивидуальные химические соединения в серии многофакторных экспериментов по планам, близким к оптимальным для поиска.

Последовательность применения математики в микробиологической работе - количественное измерение одного или нескольких свойств, построение таблиц, построение графиков, разработка регрессионных зависимостей, построение математических моделей. Для проведения поиска регуляторных факторов, близкого к оптимальному, нередко достаточно даже качественных измерений с неизвестной ошибкой, построения на этих основаниях таблиц и графиков, что не требует ни большого количества арифметических вычислений, ни повышенной математической подготовки.

Вступление

Успехи, достигнутые при изучении и оптимизации процессов, зависящих от большого количеств факторов, стали возможными благодаря широкому внедрению математических методов планирования эксперимента. Возникает необходимость изменения методологии биологических исследований. Принцип поочередного изменения в эксперименте каждого фактора на фоне постоянного уровня остальных (метод Зайделя-Гаусса /1/) не является универсальным и окончательным, а всего лишь часть комплексного исследования объекта, нередко применимого только на ранних стадиях исследования. Биологические системы, зависящие от большого количества факторов с сильным межфакторным взаимодействием при современных требованиях практики сложно изучать, моделировать и управлять процессами на основе мало связанных однофакторных зависимостей. Методология проведения и трактовки однофакторных зависимостей хорошо разработана и в дополнительных объяснениях, на наш взгляд, не нуждается /1/.

Представление полученных нередко весьма разнородных результатов измерений в виде графиков, таблиц, корреляционных полей, нахождение аналогий с более изученными родственными объектами служат основой к проведению активных поисковых работ и дальнейшей оптимизации процесса с количественным учетом влияния нескольких факторов на синтез ЦП.

Состояние популяции микробов существенно зависит от разнообразных по своему характеру (качественно различных) и по интенсивности (количественно различных) факторов. Поэтому пред современным микробиологом стоит задача - комплексное исследование объекта, установление причинно-следственных связей между различными явлениями, выделение управляемых факторов и воздействие на них.

Активные поисковые работы с учетом ожидаемой зависимости изучаемого параметра от нескольких факторов лучше начинать с отсеивающего эксперимента.

Общая часть

Отсеивающий эксперимент

Микроорганизмы способны расти на субстратах, недоступных другим живым системам /2/, а так же имеют большое прикладное значение в качестве вакцин в медицине и ветеринарии и продуценты антибиотиков и других физиологически активных веществ. Но геном каждого микроорганизма кодирует 2 - 3 тысячи белков /2,3/ , далеко не все из которых представляют интерес. Кроме того, нередко гены, ответственные за такие белки, находятся под сложной регуляцией компонентами питательной среды /1- 4/.

Среди микробиологов известны следующие задачи - есть некий штамм, который продуцирует нужный продукт при культивировании на плотной среде, либо в организме животного, но не продуцирует при глубинном культивировании или на простых питательных средах на основе гидролизатов и вытяжек природного сырья. Возможен случай, когда синтез представляющего интерес продукта при глубинном культивировании зависит от партии питательной среды. Как правило, это означает, что в питательной среде должны присутствовать индукторы или метаболизируемые ингибиторы нужных синтезов.

С точки зрения молекулярной биологии, структурный ген может находиться под регуляцией любым промоторно - операторным участком и регуляторным фактором может быть любая комбинация из индивидуальных компонент питательной среды или интенсивностей физико-химических факторов (температура, рН и т.д.). Причем за счет рекомбинационных процессов, прочих внутригеномных перестроек и спонтанного мутагенеза конкретное сочетание промоторно-операторный участок - структурный ген будут носить штаммовоспецифичный характер /1- 4,15/.

Молекулярное клонирование приведет к переносу в изученный продуцент структурных генов с прежними регуляторными участками ДНК и задача останется. Работу по выяснению особенностей регуляции какого-либо оперона необходимо проводить заново с каждым конкретным продуцентом.

Кроме того, среди известных таксономических групп микробов могут быть некультивируемые штаммы. Описаны некультивируемые легионеллы, которые обнаруживаются при микроскопировании. в мазках клинического материала со специфичными люминесцентными антисыворотками, но не растут на искусственных питательных средах. Нередко богатая среда на основе МПА с добавлением прогретой крови, известная в бактериологии как шоколадный агар, для успешного культивирования нейссерий, гемофилов и менингококков нуждается в добавках нескольких факторов роста /17/. Есть фирмы, которые выпускают многочисленные комплексные ростовые добавки. Но известные добавки не являются универсальными. Не всегда такие добавки обеспечивают рост наблюдаемых в микроскопе штаммов в мазках клинического материла или на стеклах обрастания, помещаемых в окружающую среду.

В общей микробиологии давно известно, что на стеклах обрастания исследователи наблюдали много клеток, которые не удается высеять на искусственные питательные среды. Следовательно, задача конструирования питательных сред в общей и клинической микробиологии не решена окончательно.

По нашему мнению, часть задач такого типа можно решить, если перейти к средам максимально известного, контролируемого химического состава, в том числе и к синтетическим питательным средам. Современная тонкая химическая технология дает в руки микробиолога широкий набор коммерчески доступных углеводов, аминокислот, витаминов и прочих соединений, химиками разработаны методы разделения сложных смесей разнородных соединений и синтеза аналогов.

Математиками разработаны поисковые и оптимизационные планы многофакторных экспериментов, методы статистической обработки результатов качественных измерений или измерений с большой ошибкой, сравнимой с ответом системы. Существует много доступных программ для ПК, устранившие длительные, утомительные и ненадежные ручные вычислительные операции.

Вычислительная часть работы по поиску и оптимизации в микробиологии хорошо изложена /1,4/, не требует мощной техники и нередко достаточно уметь работать только с программируемым калькулятором. Имеются большие, постоянно пополняемые достижения общей физиологии и генетики микробов, которые служат теоретическим фундаментом для изучения конкретного продуцента.

Проведение поиска возможных регуляторных факторов иногда бывает проще осуществить путем конструирования семейства сред известного химического состава из индивидуальных химических соединений, синтетических питательных сред и добавок известных компонентов к питательным средам неизвестного состава, уменьшив до минимума компоненты типа сыворотки, крови или иного продукта из сырья природного происхождения с неизвестным составом. В идеале, вообще отказавшись от таких добавок. Тем не менее, осталось ряд проблем, мешающих широкому применению вышеназванных возможностей.

Несмотря на то, что в литературе описано колоссальное количество сред известного химического состава и синтетических питательных смесей и добавок для представителей различных таксономических групп микроорганизмов и культур эукариотических клеток, в литературе описана лишь очень общая стратегия конструирования таких сред. Недостаточно подробно рассмотрена роль активного многофакторного отсеивающего эксперимента для поиска регуляторных факторов нужных синтезов /1,4/, отсутствуют четко сформулированные критерии оптимальности поиска, а также недостаточно подробно прокомментированы слабые места и области применимости двухуровневых оптимизационных экспериментов. Планы трех - и более уровней варьирования управляемых переменных в литературе упоминают, но не приводят в конкретных работах и руководствах. В предлагаемой работе сделана попытка восполнить указанные пробелы в практической теории планирования эксперимента на примере микробиологических задач.

ВП, синтез микроорганизмами экономически важного целевого продукта в зависимости от концентрации регуляторных компонентов питательной среды (интенсивности фактора) имеет сложный вид. В общем случае это многомерная поверхность (поверхность отклика), о форме которой можно сделать достаточно общие предположения на основании большой работы, проведенной при изучении значительного количества конкретных объектов и опубликованных в многочисленных статьях и руководствах, а так же на основании собственных неопубликованных ранее данных.

Рисунок 1. Зависимость выхода процесса от концентрации метаболизируемого индуктора в питательной среде

В простейшем случае, когда ВП зависит от одного фактора, можно отобразить зависимость в виде двумерной кривой, рис.1. Можно выделить следующие участки 0-А допороговый уровень концентрации регуляторного фактора, нераспознаваемый микроорганизмом, не вызывающий нужного синтеза, А-В участок лимитирования, В-С уровень насыщения влияния регуляторного фактора, С-D участок ингибирования нужного синтеза контролируемым фактором (группой факторов). На рис.1 отображен наиболее общий случай. Углы наклона кривой (первая производная) в каждой точке будут строго индивидуальны и могут варьировать в широких пределах. В частности, некоторые факторы могут не достигать уровня ингибирования, прерываясь на т.С., например аэрация для аэробов, интенсивность перемешивания и т.д.

При влиянии на ВП второго фактора кривая может сильно изменится (кривые 1 и 2, рис.1). Горизонтальные участки на зависимости ВП от интенсивности фактора говорят о переключении внутренних механизмов, возможно о включении новых оперонов - диауксия.

Для каждого конкретного продуцента и конкретного ВП необходимо определить количественно эти концентрации (интенсивности) и выделить их как управляемые переменные, за которыми необходим первостепенный контроль; найти общий фон прочих питательных веществ и условий культивирования, обеспечивающих возможность нужного синтеза, как достаточно постоянных параметров технологического процесса. Наибольшую важность для технолога представляет знание ширины участка насыщения и границы переходов на уровни лимитирования и ингибирования регуляторным фактором (технологический оптимум). Необходимо не только найти условия максимального выхода ЦП, но и описать пограничные условия снижения ВП и, по возможности, знать хотя бы некоторые условия, влияющие на снижение уровня ЦП от желаемого уровня.

Рисунок 2. Один из возможных видов участка поверхности отклика в окрестности максимума (случай двух переменных)

В пространстве участок поверхности отклика вблизи максимума будет представлен фрагментом параболоида или двухполостного гиперболоида. Максимальное значение функция отклика будет достигать в некой точке. С учетом неизбежной в практической работе ошибки измерения ВП и неустранимой ошибки в задании управляемых переменных - некая ограниченная область. С точки зрения технолога - наиболее удобный для практической работы вариант, поскольку небольшие изменения управляемых переменных не приведут к значительному изменению ВП, процесс будет достаточно устойчив к небольшим возмущениям.

Рис 3. Возможные проекции сечений поверхности отклика. Линии равного выхода. Случай двух переменных

На рис.3 а - поверхность отклика типа рис.2 (шапочка), работу можно считать завершенной, технологический оптимум найден. Вариант 3 б - стационарное возвышение. В этом случае максимальное значение сосредоточено вдоль некой линии и достаточно протяженно. В пространстве на небольшом интервале - параболический или гиперболический цилиндр. Случай 3 в - близкий к случаю 3 б, просто меньшая кривизна поверхности отклика на достаточно большом участке. Эти варианты - возможный переходный этап к последующей работе - прохождению вдоль хребта. Идеальный случай - если удастся найти неострую вершину типа 3 а. Неплохой вариант - найти плато на хребте. В крайнем случае - найти такой участок хребта, где максимально пологие склоны. Такой вариант тоже обеспечит устойчивость технологического процесса.

Случай 3 г - седло, в одном направлении функция отклика возрастает, в другом убывает. Самый неудобный для технолога случай - неустойчивый оптимум. Дальнейшая работа по поиску оптимальной области затруднительна и проблематична, хотя и не удобна для технолога. Достаточно интересный и перспективный случай для исследователя. Нельзя исключить варианта, что удастся найти некие дополнительные условия культивирования, которые принципиально повлияют на метаболизм продуцента и поверхность отклика радикально изменится, перейдет в поверхности типа 3 а или 3 б. В пространстве - гиперболический параболоид, седловидная поверхность.

Рассмотрены простейшие случаи, могут быть поверхности и более сложной конфигурации, особенно с увеличением числа переменных. Но если работать в узкой области и оперировать набором двумерных сечений, то рассмотренных случаев вполне достаточно, чтобы можно было построит локальную модель и делать обоснованные прогнозы. Наличие ПК и многочисленных программ по работе с многомерными пространствами значительно облегчают техническую часть работы, но нет смысла искать программу, чтобы можно было ввести экспериментальные результаты, нажать кнопку, а далее списать готовый ответ. Хотя кое-кто рассчитывает именно на это.

Многие микроорганизмы растут на достаточно богатых средах, содержащих гидролизаты и вытяжки из различного сырья природного происхождения. Наиболее часто применяют гидролизаты растительного и животного сырья и вытяжки из этих же источников, выдерживающие автоклавирование при сохранении прозрачности без образования осадков, что необходимо для глубинного культивирования но не обязательно для плотных питательных сред и сред для хранения культур.

При конструировании синтетических питательных сред и добавок заменяют компоненты питательных сред неизвестного или сложного состава на смеси индивидуальных химических соединений меньшего разнообразия, либо значительно снижают концентрации неизвестных или вариабельных компонент.

Все компоненты питательных сред можно разбить на достаточно независимые группы. Первая группа - неорганические компоненты. В первую очередь макроэлементы. Это, прежде всего, соли фосфорной кислоты, натрий, калий, магний, железо. Потом необходимо отметить микроэлементы - сера, кобальт, никель, цинк, медь и т.д. /16/.

Следующий класс - органические соединения. На первом месте - источники углерода, чаще всего - углеводы, сахароспирты, карбоновые кислоты и липиды. Указанные соединения можно разбить на группы - необходимые, взаимозаменяемые, нейтральные, не утилизируемые и токсичные. Методом полного или ограниченного перебора в серии однофакторных экспериментов несложно обоснованно выбрать наилучшую добавку. Углеводы утилизируются каждый по своей схеме и конкурируют между собой, обычно глюкоза или фруктоза усваиваются в первую очередь. Углеводы нет смысла проверять в смесях. Так же и карбоновые кислоты. Нередко углеводы и карбоновые кислоты не конкурируют, а дополняют друг друга, утилизируясь продуцентом по разным биохимическим путям. Липиды тоже могут не конкурировать с углеводами и карбоновыми кислотами и могут быть заменены водорастворимыми твинами /2,16/. И уже на этой стадии серия однофакторных экспериментов ограничена в своей пользе. Особых сложностей при работе с этими компонентами нет. Особой чистоты прочих реактивов при их поиске не требуется. Достаточно лишь быть уверенным в отсутствии потенциально конкурирующих примесей, например отсутствие глюкозы в галактозе, химическая чистота или известный состав жирных кислот и т.д.

На первой стадии наиболее простым шагом будет использование минеральной основы, описанной для родственного микроорганизма, с добавлением смесей аминокислот и витаминов и испытание разнообразных источников углерода, при минимальных добавках компонент неизвестного или вариабельного состава. Эта часть работы может быть выполнена по классической схеме как серия однофакторных экспериментов. Но, если будет найдено, что желательно или необходимо одновременное присутствие в среде как некоторого углевода, так и какой - ни будь карбоновой кислоты и липида, то метод Зайделя-Гаусса приведет к не всегда оправданной необходимости постановки большого количества экспериментов.

Для хемоорганотрофов нужны соединения азота в виде аминокислот и коротких пептидов, остающихся в растворимом виде после автоклавирования (пептоны) /16/. Возможно позитивное влияние и биогенных аминов (аспарагин, глутамин и т.д.). В большинстве случаев можно ограничиться только набором наиболее распространенных индивидуальных 20^ти, хотя в некоторых случаях пептиды могут быть регуляторными факторами при синтезе конкретного ЦП. Аминокислоты могут требоваться не все, наиболее часто применяемые 20, а лишь некоторые. Для этого необходимо поставить многофакторный активный отсеивающий эксперимент и выбрать минимальную группу аминокислот, обеспечивающих нужный ВП.

При этом наиболее логично фиксировать макро и микро элементы и источник витаминов, в большинстве случаев, дрожжевой экстракт в разбавленном виде, чтобы уменьшить вклад аминокислот. Иногда применяют какой - ни будь поливитаминный комплекс медицинского или ветеринарного назначения, стерилизованный фильтрованием. Это более подходящий вариант, поскольку не содержит собственных аминокислот и пептидов, шире по содержанию витаминов, а возможные углеводы и прочие добавки можно учесть, либо значительно уменьшить их влияние разбавлением.

Поиск минимальной группы необходимых аминокислот можно делать, ставя ОЭ по методу случайного баланса на основе сверхнасыщенного плана Бута и Кокса (число проверяемых факторов больше количества испытаний в серии экспериментов) таб.1 /цит. по 1/. Названная серия испытаний позволяет проверить 20 наиболее часто встречающихся незаменимых аминокислот на 12^ти экспериментальных точках. Для этого делают различные групповые выборки аминокислот из общего числа, по близкому к оптимальному плану, который проще всего отобразить в виде таблицы.

Единственность плана таб.1 не доказана, возможны импровизации. План близок к оптимальному, поскольку практически все теоретически возможные парные сочетания факторов учтены с равными частотами (большинство вектор - столбцов ортогональны). Но это в литературе не указано /1/. Согласно личному опыту, поисковые многофакторные планы на основе серии экспериментов достаточно устойчивы к небольшим промахам типа пропущенной или лишней добавки, в какую-либо проверяемую комбинацию.

Если хотя бы в одном опыте из серии экспериментов ВП достоверно отличен от 0, то задачу отсеивания можно считать решенной, поскольку найдена активная комбинация факторов среди весьма большого количества первоначально выбранных подозреваемых.

Таблица 1

План ОЭ “первого шага” Бута и Кокса для поиска минимальной группы необходимых аминокислот /1/

В первом столбце таб. 1 - номера экспериментов, далее - проверяемые факторы, в последнем столбце - количество верхних уровней в эксперименте. Структура плана таб.1. и обозначения факторов отличаются от принятых в литературе по планированию эксперимента /1,4/. Вместо безликих общепринятых (+\-) для уровней каждого фактора, предлагается нумерация верхнего уровня и пробел для нижнего. Это более удобно и логично. Особенно когда на нижнем уровне нет добавок, отсутствие фактора, либо размещается качественно иной фактор. Столбцы и строки первоначально описанного плана /1/ переставлены и частично упорядочены, что облегчает постановку опытов и уменьшает вероятность ошибки. Естественно, что план таб. 1 применим не только для аминокислот, а для любого набора факторов числом не выше 20. Сократить число столбцов можно всегда, но для случая, когда количество проверяемых факторов не выше 16, описан более оптимальный план таб.3 /3/.

В столбце 21 таб.1 приведены количества верхних уровней в каждом эксперименте. Большинство этих чисел колеблется в районе 8 - 9, что соответствует оптимальной выборке (разбиению на группы) при поиске небольшой (не более 3^х индивидуальных соединений) группы активных факторов на фоне большого количества подозреваемых факторов, среди которых основная часть - нейтральные по влиянию на ВП. При этом выборка в 2/3 или в 1/3 от всей группы наиболее оптимальна в смысле быстрого нахождения активной группы, особенно при последовательной схеме, с постановкой уточняющих испытаний, что давно доказано математиками для аналогичных задач.

Таблица 2

Число общих верхних уровней в паре столбцов (факторов) - отклонения от ортогональности.

В таблице 2 приведено число общих верхних уровней в паре столбцов (факторов). Это указывает близость к оптимуму по равномерности учета парных сочетаний факторов для некоторых столбцов. Такое построение позволяет построить максимальное количество качественно разнообразных сред (условий культивирования) для выбранного количества испытаний. Для остальных столбцов данные не приведены, но частоты встречаемости пар верхних уровней колеблются в интервале от 2 до 4, что близко к оптимальному сочетанию в 3 пары для приведенного плана.

После постановки серии активных экспериментов достаточно провести ранжировку (упорядочить полученные измерения по возрастанию или убыванию) и выбрать серию опытов с максимальным ВП. Анализируя лучшие эксперименты в парах с худшими испытаниями, несложно сделать выводы о значимости той или иной группы без явной математической обработки и арифметических вычислений. Представление результатов в виде корреляционной таблицы уже является первой стадией математической обработки. И эта стадия весьма информативна, не смотря на простоту получения. К сожалению, редко используется в массовой работе.

Применение сериального критерия, или метода парных сравнений, которые строго сформулированы и обоснованы математиками, позволяет при минимальных арифметических расчетах сделать минимально субъективные выводы и оценить их надежность /7/. При большой ошибке измерения ВП может быть сложно выбрать единственное сочетание в первой же серии. Скорее всего, будет найден группа из 2-3 примерно равноценных экспериментов, недостоверно отличающихся друг от друга по величине ВП. Уточнить влияние компонентов найденной группы несложно в следующей серии испытаний.

Лучше сравнивать группы, сильно отличающиеся по ВП, при, желательно, небольшом качественном различии. Это несложно сделать, представив результаты в виде корреляционной таблицы, переставляя строки и столбцы первоначального плана в наиболее удобном и наглядном виде. Такое построение можно быстро сделать на любом ПК, не выходя за возможности современных текстовых редакторов и без применения специализированных математических программ. Автоматическую ранжировку результатов позволяют сделать даже многие программируемые калькуляторы.

Постановка поискового опыта по плану, близкому к ДФЭ высокой степени дробности значительно облегчает обработку результатов и повышает надежность выводов. В микробиологии при посевах на искусственные питательные среды стоимость каждого опыта, как правило, невысока, поэтому значительно удобнее применять план близкий к ДФЭ из двух противоположных планов Бута - Кокса. Если есть возможность, то нужно ставить максимальное количество опытов в серии и не держаться за свернасыщенную схему, когда количество проверяемых факторов больше количества единичных испытаний.

При возможности постановки ДФЭ, лучше выбрать план, в котором все вектор - столбцы ортогональны, поскольку в планах Бута-Кокса есть отличающиеся от ортогональности пары вектор - столбцов. Но это не обязательно, поскольку слегка избыточный план (количество опытов незначительно превышает количество проверяемых факторов, в данном случае 24 опыта на 20 факторов) весьма устойчив к небольшим отклонениям от строгой оптимальности и не единственный. Если приходится использовать экспериментальных животных, либо иные дорогостоящие опыты, то нужно решать о целесообразности выбора того или иного плана в каждом конкретном случае.

Если позволяют экономические возможности, то лучше поставить избыточную серию экспериментов (количество экспериментов хотя бы не на много превышает количество проверяемых факторов). В первой серии можно зафиксировать концентрации аминокислот, принятые для близкородственных объектов, на верхнем уровне. На нижнем взять 0-вые концентрации. Во второй серии поменять уровни местами, если ограничится планом таб.1. Тогда каждый эксперимент в серии будет иметь противоположный, что значительно облегчает обработку результатов в случае большой ошибки измерений, позволяя эффективно применить метод парных сравнений /7/. Это строго доказано математиками и подтверждено многочисленными экспериментальными работами. Кроме того, эксперимент будет содержать 24 опыта для 20 аминокислот. Это уже не сверхнасыщенная схема, а близкий к ДФЭ (в строгом смысле не есть ДФЭ, т.к. 24 испытания не есть степень 2) с близким к оптимальному набором опытов для поиска при минимальных начальных ограничениях. Такой план эффективен на первых шагах, при наличии только априорной и аналоговой информации достаточно общего характера.

Выбрав минимальную группу аминокислот, можно поставить уточняющую часть работы, применяя дробный или полный факторный эксперимент, что определяется, прежде всего, экономическими возможностями.

Для поиска минимальной группы необходимых витаминов может подойти сверхнасыщенный план Бута и Кокса таб. 3 /цит. по 1/, позволяющий проверить различные выборки из 16 факторов на 12 экспериментах при фиксированном фоне неорганических компонент, углеводов, аминокислот и пептидов. Такой план несколько лучше в смысле разнообразия сред (условий), чем план таб.1 из которого случайным образом отброшены 4 столбца. Приводимая здесь запись плана таб. 3 тоже отличается от принятой в литературе /1/ и была подвергнута небольшим преобразованиям, аналогично плану таб.1. Микроэлементы тоже можно проверить, применяя указанный выше план таб.3 для витаминов на фиксированном фоне прочих соединений.

Если количество подозреваемых факторов невелико (около 10), то рациональнее взять в качестве плана дробную реплику максимальной дробности от ПФЭ и противоположный по уровням план, с превышением числа опытов над числом факторов, либо ДФЭ с подходящим количеством факторов и испытаний. На первых стадиях изучения объекта невозможно указать единственный оптимальный план, слишком велико разнообразие начальных условий. Необходимо прочувствовать логику выбора близкого к оптимальности плана, поскольку абсолютно оптимального и единственного не существует. Превышение числа единичных опытов над числом факторов только повысит надежность и скорость нахождения активной группы и определяется, прежде всего, экономическими возможностями.

Как и при поиске витаминов, поиск микроэлементов требует повышенной чистоты воды и посуды. Желательно применять посевной материал в виде отмытых клеток, чтобы уменьшит систематическую ошибку, вносимую с инокулятом, поскольку витамины и микроэлементы действуют в количествах от микрограммов на литр и могут очень сильно влиять на синтез целевого продукта /16/.

Последовательную процедуру поиска лучше проводить по схеме - макроэлементы; источники углерода; аминокислоты; витамины; микроэлементы; повышая степень чистоты на каждом этапе и уменьшая концентрации неконтролируемых по составу добавок, типа сыворотки или иных слабо охарактеризованных по составу вытяжек и гидролизатов из сырья природного происхождения.

Таблица 3

ОЭ План “первого шага” Бута и Кокса для поиска минимальных необходимых групп витаминов или микроэлементов /1/.

В таб. 3 - 17-й столбец содержит числа верхних уровней в каждом эксперименте, столбец 1 - порядковые номера единичных испытаний. Остальные обозначения аналогично таб. 1.

Таблица 4, план ОЭ первого шага поиска, близкий к оптимальному.

Учет верхних уровней в серии экспериментов таб. 4

Верхних    экспериментов

уровней

                  - 2

                  - 4

                - - 7

              - 4

             - 3

              - 2

             - 1

              - 1

В оптимальный для поиска активной группы интервал 30 -70% выборки факторов попадают 19 из 20 экспериментов.

План содержит испытание № 12, в котором все факторы на верхнем уровне, что является внутренним стандартом для проверки влияния на ВП выборок с меньшим количеством факторов. Если испытание № 12 не является лучшим по значению ВП, то нужны не все выбранные факторы.

питательный среда фермент антиген антибиотик

Таблица 5

Число верхних уровней в паре столбцов (факторов), - отклонения от ортогональности

В таб. 5 приведены числа верхних уровней в паре столбцов, что указывает близость к оптимуму по равномерности учета парных сочетаний факторов для первых двух столбцов. Для остальных столбцов данные не приведены, но частоты пар верхних уровней колеблются в интервале от 2 до 4, что близко к оптимальной частоте в 3 общих пары.

После постановки серии активных экспериментов достаточно провести ранжировку и выбрать серию опытов с максимальным выходом процесса. Анализируя эти эксперименты в парах с худшими, несложно сделать выводы о значимости той или иной группы без явной математической обработки и арифметических вычислений. При большой ошибке измерения ВП может быть сложно выбрать единственное сочетание в первой же серии. Скорее будет найден группа из 2-3 примерно равноценных экспериментов, недостоверно отличающихся друг от друга по величине ВП. Лучше сравнивать группы, сильно отличающиеся по выходу процесса, при, желательно, небольшом качественном различии. Это несложно сделать, представив результаты в виде корреляционной таблицы, переставляя строки и столбцы первоначального плана в наиболее удобном и наглядном виде. Для этого достаточно возможностей простейшего текстового редактора для любого ПК, без использования специализированных математических и статистических пакетов прикладных программ.

После нахождения сильно действующих групп факторов из разных классов, можно перейти к поиску многокомпонентной синтетической добавки, уменьшая компоненты неизвестного состава и применяя отсеивающие эксперименты по сверхнасыщенной схеме для большего количества факторов. Не исключена сильная связь между компонентами питательной среды из разных классов и при возможности это нужно проверить экспериментально. В руководстве Максимова, Федорова /1/ приведено много планов, позволяющих проверить до 32 факторов на 16 экспериментальных точках при обычной расстановке факторов и до 64 факторов при описанной выше расстановке двух факторов в одном столбце, размещая каждый фактор на своем уровне (сверхнасыщенность второго типа).

Сверхнасыщенные планы Бута и Кокса /цит. по 1/ в этом отношении предпочтительнее построенных путем комбинации случайных выборок из проверяемого множества подозреваемых факторов без каких-либо явно формализованных критериев.

Критериями оптимальности отсеивающих экспериментов можно считать учет парных сочетаний факторов с равными частотами (ортогональность вектор - столбцов), что позволяет более полно учесть сочетания высших порядков и увеличить качественное разнообразие испытуемых вариантов питательных сред при ограниченном количестве опытов в серии, обеспечить близкое к максимальному разнообразие для выбранного количества испытаний /5/. Для этого лучше всего подходят серии экспериментов с числом, кратным 4. Количественно выборки из проверяемой группы подозреваемых факторов в каждом опыте желательно должны попадать в интервал от 30 до 70% от всей проверяемой группы, незначительно отличаясь в большую или меньшую сторону в небольшом количестве опытов одной серии. Это близкая к оптимальной тактика поиска небольшой группы связанных между собой сильно действующих факторов среди достаточно большого подозреваемого множества и вероятного большого количества нейтральных, пассивных по влиянию на ВП, сочетаний факторов, строго доказанная математиками.

Как уже отмечалось выше, такие планы не единственные и устойчивы к небольшим и редким промахам (единичным) типа лишнего или не добавленного компонента в каком-либо опыте серии экспериментов. Промахи почти неизбежны в практической работе и давно описаны несложные методы их выявления и учета /7/. Таким методом, прежде всего является ранжировка результатов (упорядоченное расположение от большего к меньшему или наоборот) и отбрасывание “выскакивающих” значений, сильно отличающихся от средне ожидаемых. При поиске есть смысл более тщательно проверить “выскакивающие” результаты, поскольку они могут содержать в себе искомую группу регуляторных факторов.

Приведенные выше планы Бута и Кокса эффективны и при выяснении питательных потребностей ауксотрофов после мутагенеза некого штамма с известными питательными потребностями, отбора и характеристике полученных мутантов. Причем для этого случая названные планы более оптимальны, чем для случая поиска регуляторных факторов у неизученного штамма. После мутагенеза, как правило, новые потребности в витаминах или аминокислотах связаны с одним фактором роста, множественные мутации редки, работа проводится с объектом, физиология которого хорошо изучена. При работе с новым, плохо изученным продуцентом задача гораздо сложнее.

Нахождение известных компонент питательной среды, влияющих на синтез целевого продукта, дает хорошую основу для генетической модификации продуцента. Знание основных регуляторных факторов служит основой для селекции конститутивных мутантов после индуцированного мутагенеза исходного штамма. Это в принципе дает возможность применять дешевые компоненты питательных сред, минимально охарактеризованные по составу.

Возможен и другой путь - синтез аналогов регуляторных факторов, которые доставляют в клетки нужные питательные вещества, не реагируя с опероном синтеза целевого продукта. Такие работы проводили с большим количеством штаммов разные авторы и их конкретные результаты мало что дают при изучении нового объекта.

Для проведения поиска факторов, влияющих на синтез целевого продукта, можно выбрать план, представленный в таблице 4. В отличие от обозначений факторов двухуровневых планов, принятых в литературе /1,4/ в виде (+/-), введена нумерация каждого фактора на верхнем уровне и отсутствие обозначений для нижнего уровня. Номер столбца соответствует новому фактору.

Таблица 6

План разработанного отсеивающего эксперимента

По горизонтали таб.6 приведена нумерация факторов, по вертикали в первой колонке - нумерация экспериментов. План таб.6 разработан для проверки 15 факторов на 16 экспериментах из ДПФЭ 2⁴ путем добавления столбцов, которые получены линейной комбинацией исходных первых 4 ^х по правилу таб. 7 /1/. В верхней строке указаны номера основных исходных столбцов и номера столбцов, послужившие основой для построения нового. В этом смысле план единственный, поскольку дальнейшее увеличение количества столбцов по описанному выше алгоритму не приводит к получению новых столбцов, варианты повторяются.

Таблица 7

Правило построения столбца 5 из линейной комбинации столбцов 1 и 2

Предлагаемый план табл.6 лучше, чем план табл.8 /1/, так как скалярные произведения любых пар вектор - столбцов равны 0. Этот факт имеет понятную для экспериментатора интерпретацию - все возможные сочетания факторов по 2 в серии из 16 экспериментов входят с одинаковой частотой, что приводит к более полному и равномерному учету сочетаний факторов более высоких порядков и не дает априорного преимущества ни одному из выбранных сочетаний факторов, по крайней мере для уровня парных сочетаний. Это важно на первоначальном этапе работы, при минимальной начальной информации, поиску, близкому к случайному, слабо ограниченному какой-либо гипотезой или априорной информацией.. При этом желательно рассмотреть максимальное количество качественно разнообразных вариантов условий культивирования при минимальном количестве экспериментов. Критерии разнообразия вариантов условий культивирования сформулировать непросто, их можно принять на интуитивном уровне.

Работа с сериями питательных сред позволяет уменьшить систематическую ошибку при оценке ВП и учесть сильное межфакторное взаимодействие между условиями культивирования. Необходимость учета взаимодействия факторов становится особенно ясной, если принять во внимание, что отдельные факторы, не оказывающие сами по себе прямого влияния на урожай, могут существенно влиять на него благодаря взаимодействию с другими факторами среды /1-5/.

Очень важно, что серия активных опытов по плану, близкому к оптимальному, позволяет оценить тенденцию влияния того или иного фактора или комбинации факторов на ВП. Это позволяет более рационально и обоснованно ставить последующие эксперименты.

Кроме этого, план табл.6 отвечает априорному предположению, что, согласно сериальному критерию /7/ , наиболее значимый фактор - 1 - на верхнем уровне. Второй по значимости - фактор 2 на нижнем уровне - в предположении того, что остальные не значимы или малозначимы. Эти выводы (нуль - гипотеза) сделаны при условии, что самый лучший эксперимент -1, худший - 16, остальные по убыванию выхода процесса упорядоченно расположены по зависимости, убывающей по закону, близкому к обратно экспоненциальному, либо обратно пропорциональному (рис 4. кривая 1).

Поскольку ошибку измерения ВП бактериальной популяции сложно сделать менее 20%, то первые несколько экспериментов по уровню ВП могут достоверно между собой не отличаться. Согласно сериальному критерию /7/ выбор фактора 1 на верхнем уровне в качестве значимого при указанном распределении будет сделан с надежностью свыше 90% (группа факторов свыше 8), надежность выбора второго на нижнем уровне - не хуже 80% (группа факторов из 4-х). Такое расположение учитывает интуитивный выбор экспериментатором наиболее значимых факторов на первые места.

После постановки эксперимента и ранжировка согласно полученным результатам эта гипотеза может быть принята или отвергнута, если получится иное расположение экспериментов, отличающееся от распределения таб.6, которое предлагается назвать каноническим. Распределение рис. 2, кривая 1 - неплохой результат для первого ОЭ, поскольку есть серия экспериментов с ВП, достоверно отличным от 0 и есть серия с ВП, близким к 0, что позволяет сразу сократить количество подозреваемых факторов, отбросив явно нейтральные по влиянию на ВП комбинации факторов. Гораздо хуже, когда во всех экспериментах ВП практически одинаков. Но если ВП = 0 во всей серии, то означает, что среди выбранных факторов нет искомых регуляторных и это самый худший вариант.

Таблица 8

План отсеивающего эксперимента /1/

В отличие от предлагаемого плана табл.6 , описанный ранее /1/ насыщенный двухуровневый план ОЭ табл. 8 имеет недостатки. Пары вектор - столбцов 1-7, 1-8, 1-9. 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14 неортогональны. Следствием этого является то, что число общих пар факторов в серии из 16 экспериментов отличается от 4.

Более конкретно - для пары вектор - столбцов (1;7) сочетание (- -) встречается 3 раза, сочетание (+ +) 3 раза, (+ -) 5 раз,(- +) 5 раз, в то время как в ортогональной паре вектор-столбцов (1;2) все названные комбинации встречаются по 4 раза. Неортогональные пары вектор - столбцов плана табл.7 перечислены не полностью.

Следовательно, по крайней мере, для перечисленных вектор - столбцов априорные частоты встречаемости общих пар факторов в паре экспериментов получаются отличными от равномерного распределения, что приводит к сильно смещенному учету сочетаний факторов по три и более, априорному преимуществу одних сочетаний факторов и потере других сочетаний. Такое расположение факторов уменьшает качественное разнообразие проверяемых вариантов питательных сред и смещает оценки учета групп факторов, внося трудно контролируемые предпочтения одних комбинаций факторов перед другими.

Кроме этого, в рассматриваемом плане табл.8 отсутствует вариант испытания, в котором все факторы находятся на верхнем уровне. Следовательно, при построении плана с противоположными уровнями будет отсутствовать эксперимент со всеми факторами на нижнем уровне, что усложняет применение непараметрического критерия - метода парных сравнений, эффективного в случае большой ошибки измерения ВП, или при качественной оценке ВП. Отсутствие эксперимента с расположением всех факторов на верхнем (нижнем) уровне приводит к потере многих комбинаций факторов и сокращает количество проверяемых вариантов условий культивирования при том же, как и в плане таб.6, числе опытов. Эксперимент, учитывающий все факторы на одном уровне так же служит внутренним стандартом при обработке результатов поиска. Некий эталон, по которому можно судить, есть ли меньшая комбинация факторов с таким же или большим ВП, нет ли во всей выборке ингибирующих факторов. Это несложно сделать по месту эксперимента со всеми верхними уровнями факторов в ранжированном ряду. Если названный эксперимент - достоверно самый лучший, то нужна вся выборка, если в середине распределения, то есть ингибирующие факторы и нужны не все, т.е. задача отсеивания решается нагляднее, проще и полнее.

Предлагаемый план табл.6 подходит так же для задачи поиска сочетаний факторов, влияющих на синтез целевого продукта при наличии синтеза при культивировании на гидролизате или вытяжке природного сырья после разделения его физико-химическими методами (ионообменная хроматография, гель - фильтрация и т.д.) при наличии большого количества фракций. Из плана табл.6 при наличии проверяемых факторов не более 16 можно выбрать оптимальный план в смысле равномерного учета сочетаний пар факторов и максимального количества противоположных экспериментов, оставив столбцы 1-4 и 11 - 14 (всего 8 столбцов).

Предлагаемая запись плана ОЭ табл.6 позволяет уменьшить вероятность ошибки при выполнении экспериментальной части работы, поскольку обозначение факторов легко увязать с нумерацией столбцов. Упорядоченность расположения факторов в таб. 6 меньше напрягает внимание и уменьшает вероятность промаха исполнителем. Это отвечает 0-гипотезе о наибольшей значимости сочетания факторов (1;-2) на указанных уровнях. Если после реализации эксперимента и ранжировку результатов получилось иное расположение, то эту 0-гипотезу можно обоснованно отвергнуть.

Кроме этого, было увеличено количество проверяемых факторов путем размещения на каждом уровне новой добавки (сверхнасыщенность плана поискового эксперимента 2-го типа). Так, в первом столбце поместили пару глюкоза 2г/л - эритрит 2г/л, т.е. на верхнем уровне - глюкоза, на нижнем - эритрит. Во втором столбце - фосфат натрия 4 г /л, рН 7,2, на верхнем уровне (ВУ), на нижнем уровне (НУ)- фосфат той же концентрации, рН 7,8. Столбец 3 - ВУ гидролизате казеина кислотный 10 г /л, НУ - 5 г /л. Столбец 4 ВУ аргинин 20 мг/ л, НУ лизин 30 мг/ л. Столбец 5 (С5) - ВУ цистин 10 мг/ л, НУ метионин 8 мг/ л., .С :6 ВУ глютамин 200 мг/ л, НУ- лейцин 20 мг/ л. С7 ВУ - гистидин 10 мг/ л, НУ - феилаланин 15 мг/ л. С8 ВУ - треонин 20 мг/ л, НУ - триптофан 5 мг/ л. С9 ВУ - тирозин 15 миг /л, НУ -валин 20 мг/ л. С10 ВУ - пантотенат Са 1 мг/ л, НУ -холин 1 мг/ л. С11 - ВУ фолиевая кислота 1 мг/ л, НУ - никотинамид 1 мг/ л . С12 ВУ - пиридоксаль 1мг/ л, НУ тиамин 1 мг л . С13 ВУ - СаСl₂300 мг л, НУ СаСl₂ 150 мг/ л. С14 ВУ - МgSO₄ 200 мг /л, НУ - МgSO₄ 100 мг /л. С15 ВУ - NаСl 5 г /л, НУ - NaCl 1 г/ л.

Такая сверхнасыщенность второго типа (количество проверяемых факторов выше количества испытаний) позволяет добиться максимального качественного разнообразия проверяемых вариантов при выбранном количестве испытаний.

В дополнение к этому количество экспериментов было увеличено в 2 раза путем построения к каждой строке исходного плана табл.6 противоположной строки. В целом был достроен такой же план, в котором уровни в вариантах экспериментов переставлены местами. Наличие пар противоположных экспериментов упрощает обработку с применением непараметрического критерия - метода парных сравнений /7/, необходимого при большой ошибке измерений либо качественной и экспертной оценке ВП, а также при построении корреляционных таблиц и корреляционных полей. Пары противоположных экспериментов по расположению факторов на уровнях варьирования позволяют обнаружить небольшие различия ВП даже при качественном анализе и экспертных оценках ВП. При минимальном привлечении арифметических вычислений, только на основе логических рассуждений, строго обоснованных математиками, без проведения значительного объема арифметических вычислений в явном виде на ранней стадии применения многофакторного поискового эксперимента и обработки результатов измерений. Это служит минимально субъективной основой постановки следующих опытов.

Наличие эксперимента, в котором все факторы находятся на верхнем (нижнем) уровнях позволяет учесть все теоретически возможные сочетания, а также служит внутренним стандартом для проверки гипотезы о том, что не все выбранные факторы необходимы для обеспечения нужного синтеза. Предлагаемое увеличение в 2 раза количества экспериментов методически несложно, достаточно поменять пробирки с добавками местами и работать по тому же плану.

Задача ОЭ - найти хотя бы одно сочетание факторов, обеспечивающих синтез целевого продукта, отличный от 0. Само по себе первичное выделение для проверки относительно небольшого числа подозреваемых переменных и их концентраций (интенсивностей) из нескольких сотен потенциально возможных до проведения эксперимента лежит вне математики, полностью определяется опытом, интуицией и фантазией исследователя, а также способностью учесть априорную и аналоговую информацию.

Естественно, что чем больше выделено множество подозреваемых факторов на первом этапе, то тем вероятнее найти регуляторную комбинацию добавок. Увеличение количества подозреваемых факторов на первом этапе подразумевает использование активных поисковых экспериментов с большим количеством испытаний в серии, что повышает точность измерения ВП и надежность прогнозов.

На втором этапе, после нахождения группы активных факторов, можно поставить уточняющий эксперимент по плану таб.9, построенному на основе ПФЭ 2³ по правилу таб.5.

Таблица 9

План второго шага ОЭ на основе ПФЭ 2³

В таб. 9 условие ортогональности всех вектор - столбцов выполнено, но столбец 7 исходной таблицы можно заменить на противоположный (альтернативный столбец) при сохранении ортогональности вектор - столбцов (равномерному учету пар факторов). Это приведет к потере сочетаний факторов (1;6;7) и (1;5;7) и некоторых других. Такой план оптимален при наличии информации об ингибирующем или нейтральном действии указанных сочетаний факторов. Сочетания (3;4;6), (4;6;7), (5;6;7) присутствуют по 2 раза, что можно учесть при наличии информации из предварительных экспериментов об их возможной важной роли. Все возможные варианты рассмотреть сложно и нет смысла в этом. Необходимо производить выбор плана, близкого к оптимальному, для каждого конкретного случая. Наличие априорной или полученной на первом этапе информации о сильнодействующих сочетаниях факторов, либо нейтральных по влиянию на ВП позволяет учесть это и применить планы поиска, оптимальные для каждого конкретного случая, особенно на последующих, уточняющих этапах поиска.

План табл. 9 построен из ПФЭ 2³ по правилу табл.5. Его так же можно рассматривать как дробную реплику максимальной дробности от ПФЭ 2⁷ (ДФЭ 2^7-4). В названном плане учтены все возможные сочетания факторов по 2 (ортогональность вектор - столбцов) и смещены оценки для сочетаний факторов высших порядков. В плане таб.9 верхние уровни факторов учтены более полно, чем нижние, т.к. отсутствует строка (план эксперимента), в которой все факторы находятся на нижнем уровне. Можно построить план, который будет смещен в пользу предпочтения нижних уровней.

Таблица 10

План ОЭ второго шага, смещенного в пользу нижних уровней

В плане таб. 10 отсутствуют сочетания факторов (1;3;7); (3;4;7); (4;5;6); (2;3;6); (3;4;6). Сочетания (-1;-2;-3); (-1;-3;-5); (-1;-6;-7) присутствуют по 2 раза. Представлены все теоретически возможные сочетания факторов на нижних уровнях. Одновременное использование планов таб.9 и таб.10 позволяет учесть все сочетания факторов по 3 из 7 испытуемых с одинаковым весом. Сочетания факторов более высоких порядков будут учтены с минимальными смещениями. Более полный план из 8^ми столбцов (до 16 факторов) на 16 строчек (экспериментов) можно получить из плана таб.1, выбрав столбцы 1-4 и 11-15.

В классическом руководстве Максимова, Федорова /1/ приведены двухуровневые планы сверхнасыщенных отсеивающих экспериментов по методу случайного баланса, рассчитанные Booth, Cox. Эти планы позволяют проверить до 35 факторов на 16 экспериментах при общепринятой расстановке факторов или до 70 факторов при предложенной выше альтернативной расстановке 2^х факторов в каждом столбце (каждый новый фактор на одном из уровней, сверхнасыщенность второго типа)

Двухуровневые планы можно расширить введением дополнительных столбцов, учитывающих изменения дополнительных факторов на 3^х и более уровнях без ограничений на оптимальность по каким-либо критериям, что вполне оправдано на первоначальных, поисковых этапах работы, при минимальной информации об особенностях культивирования конкретного продуцента. Иногда в литературе по планированию такие планы называют частично сбалансированными неполноблочными планами. Например, можно поставить эксперимент по плану таб.1 при трех разных температурах культивирования. Такие планы можно назвать относительно оптимальными. Их построение, увеличение количества проверяемых факторов и уровней варьирования концентраций (интенсивностей) ограничивается только фантазией экспериментатора и экономическими возможностями, во многом стоимостью (и временем) измерения ВП или стоимостью испытания.

После реализации первого ОЭ возможно, что только в нескольких экспериментах ВП отличен от 0 и это уже хорошо, т.к. искомое сочетание факторов попало в проверяемое множество. Построение корреляционных таблиц и отображение связи факторов с ВП в виде корреляционных полей; расчет коэффициентов корреляции рангов по различным критериям; позволяют установить причинно-следственные связи между реализованными условиями культивирования и полученными значениями ВП; найти сильнодействующие сочетания факторов, наглядно представить полученные результаты. Это весьма существенно при коллективной работе, когда теоретику необходимо максимально наглядно и убедительно предсказывать экспериментаторам условия последующих экспериментов.

Из плана таб.9 можно построить 7! других, заменяя первоначальные столбцы на их противоположные (альтернативные). Каждый план будет оптимален для своих начальных условий, смещая частоты учета сочетаний факторов по 3 и выше. Поскольку первоначально выбранные факторы (столбцы) эквивалентны, то независимых планов будет 8 - исходный план, серия с перестановкой уровней одного столбца, двух, трех … и семи (план таб.10). Все возможные варианты планов и их области оптимального применения нет смысла перечислять. Главное - понять логику рассуждений при планировании активного поискового эксперимента и обработке результатов измерений ВП, в особенности на последующих, уточняющих стадиях и самостоятельно строить (выбирать) наилучший для каждого конкретного случая план уточняющего поиска. Вообще говоря, если нет ограничений экономического характера, то наиболее полную информацию даст ДПФЭ, но для группы из 4^х подозреваемых факторов это 16 экспериментов, что не всегда возможно реализовать. Особенно при необходимости ставить повторы для обеспечения приемлемой точности.

В математике есть класс алгоритмически неразрешимых задач, в принципе не решаемых путем выполнения конечного числа шагов. Но поиск условий культивирования микробов к таким не относится, поскольку каждый продуцент ограничен в своих генетических, пищевых и синтетических возможностях. Проблема может быть только в том, что будет нужен неизвестный ранее фактор, который не доступен коммерчески. К тому же такой фактор может быть сложно очистить из природного сырья. Пример - до сих пор не решена задача культивирования бледной трепонемы на искусственных питательных средах, не смотря на важность проблемы и многочисленные попытки решить эту задачу.

Питательные потребности большинства перспективных штаммов в значительной мере известны, задача состоит в выборе комбинации, близкой к оптимальной для синтеза экономически значимого продукта для конкретного продуцента и эта задача нередко разрешима за конечное количество шагов. Совершенствование методов и увеличение количества решенных задач увеличивают вероятность решения новых.

При изучении живых систем, даже таких относительно простых как микроорганизмы, невозможно учесть все возможные варианты и предложить набор универсальный алгоритмов на все случаи жизни. Тем не менее, задача поиска регуляторных факторов решается за конечное количество опытов, особенно если синтез ЦП происходит на искусственных питательных средах. В случае синтеза ЦП продуцентом только в организме чувствительного экспериментального животного, задача усложняется многократно и без гарантированного успеха.

Необходимым моментом при поиске условий культивирования является и интуиция исследователя. Задача математики - планирование активных экспериментов по неким критериям, близким к оптимальным, обработка больших массивов измерений и представление результатов в удобной форме для прогноза и обоснования последующих экспериментов. Критерии оптимальности формулирует исследователь исходя из конкретной задачи и материально - технических возможностей. Предлагаемый критерий по равномерному учету максимального количества пар факторов в серии экспериментов - лишь одна из многих возможностей. Формулировка критерия оптимальности на ранних стадиях многофакторного поиска не обязательна, можно работать и на интуитивном уровне.

Первоначальный выбор на проверку группы подозреваемых факторов и их интенсивностей (концентраций) из очень большого количества потенциально возможных лежит вне математики, в принципе не формализуем и полностью определяется интуицией исследователя. Без интуиции браться за поисковые работы бессмысленно. Успешное решение хотя бы одной задачи поиска регуляторных факторов подтверждает наличие у исследователя такого непонятного и неопределенного качества, как интуиция.

При нахождении небольшой группы сильно действующих факторов перед постановкой ПФЭ для оптимизации процесса, есть смысл поставить уточняющую (переходную) серию опытов для экспериментального обоснования выбора активной группы и их концентраций (интенсивностей), варьируя переменные на 3-х уровнях по близкому к оптимальности плану таб.11. Как и приведенные выше, план не единственный, возможны вариации по выбору сочетаний уровней интенсивностей (концентраций) факторов. Наличие ПК предоставляет новые возможности по построению подобных планов, близких к оптимальным для конкретной задачи, максимально увязанный с конкретными начальными и граничными условиями. План облегчает обработку результатов измерений при построении корреляционных полей и таблиц.

Таблица 11

План трехуровневого переходного к оптимизации уточняющего эксперимента

В плане таб. 11 буквами обозначены факторы, нижними индексами - уровни, парные сочетания факторов присутствуют с одинаковыми частотами, хотя учтены не все, теоретически возможные. План не единственный, но близкий к оптимальному согласно сформулированным выше критериям.

Количество экспериментов в серии в первую очередь зависит от стоимости каждого опыта. План таб.11. можно расширить до 8 экспериментов (строк), добавляя эксперименты, в которых все факторы находятся на одном уровне (все факторы на 2-ом и все факторы на 3-ем уровнях). Такое расширение сохраняет учет парных сочетаний факторов, увеличивает количество учтенных сочетаний факторов и увеличивает представленность сочетаний факторов более высоких порядков, незначительно смещая частоты представленности сочетаний факторов более высоких, чем парные, порядков. Наличие трех уровней варьирования интенсивностей каждого фактора облегчает оценить тенденцию влияния фактора на ВП, в отличие от двухуровневых планов. Наличие трех уровней варьирования интенсивностей факторов позволяет более точно и надежно оценить тенденцию по влиянию на синтез ЦП при большой ошибке измерений, что строго доказано математиками ранее.

Поскольку при многофакторном поиске можно говорить только о постановке серии экспериментов, близкой к оптимальной, то выбор нужного плана во многом определяется стоимостью каждого эксперимента. При невысокой стоимости есть смысл увеличивать количество проверяемых факторов и экспериментов в одной серии до максимума. Постановка серий экспериментов, объединенных одним временем и одним инокулятом, позволяет повысить точность измерений ВП за счет уменьшения систематической ошибки и временного дрейфа неконтролируемых воздействий при возможности выбора внутреннего стандарта (опыта, принимаемого за эталон для сравнения).

Наличие ПК и многочисленных прикладных программ по работе с многомерными пространствами позволяют относительно несложно суммировать все проведенные наблюдения и строить различные 2-х и3-х мерные сечения поверхности отклика, облегчая исследователю представление вида поверхности отклика в окрестности центра эксперимента, что значительно облегчит планирование последующих серий опытов.

Ранжировку строк в таблице по возрастанию (убыванию) некой величины автоматически производят текстовые редакторы, перестановку столбцов таблицы тоже можно сделать, не обращаясь к специализированным математическим программам. В крайнем случае эту работу можно провести ручную при помощи прозрачной пленки и фломастера, либо ножниц и клея.

Нахождение оптимальных условий синтеза

Оптимизация биологического процесса сводится к экспериментальному отысканию условий, при которых ВП достигает максимального значения. Подразумевается любая характеристика процесса, представляющая интерес для экспериментатора (биомасса, накопление какого-либо целевого продукта, представляющего экономический интерес и т.д.). Условия протекания процесса определяются комплексом факторов, от которых зависит его выход. В случае подбора оптимальных сред этот комплекс включает в себя химический состав питательной среды и условия культивирования организмов, такие как температура, перемешивание, аэрация и т.д./1/.

Оптимизацию в широком смысле слова следует проводить по всей совокупности факторов, влияющих на ВП. В рамках рассматриваемых ниже методов не существует принципиальной разницы между физически разнородными факторами по характеру их влияния на ВП, вследствие чего можно одновременно проводить оптимизацию как состава среды, так и условий культивирования. Однако на практике приходится сталкиваться с более узкой задачей подбора оптимального состава сред при заданных условиях культивирования или, иными словами, проводить оптимизацию по группе факторов (например, химические компоненты среды) при постоянном уровне остальных факторов /1/. В некотором смысле, это обобщение метода однофакторной оптимизации, но в данном случае меняют одновременно несколько факторов на фоне фиксированных остальных возможных переменных.

При этом следует иметь в виду, что смена условий культивирования, как правило, приводит к необходимости включения новых факторов в область управляемых или контролируемых переменных. Увеличение ВП проводит к увеличению потребления компонент, которые ранее считались малозначимыми. Наиболее рациональным для оптимизации биологических объектов является двухуровневые ПФЭ или ДФЭ, поскольку биологические процессы достаточно длительны, ВП в большинстве случаев определяют биохимическими методами, что делает нерентабельным использование схем планирования типа симплекс - процедуры или случайного поиска, когда каждый последующий шаг рассчитывают на основании результатов предыдущего. Достоинством одновременной постановки большой серии опытов является и то, что появляется возможность учета временного дрейфа за счет ведения внутренних эталонов для каждой серии опытов, например, в простейшем случае, постановка опыта, в котором все факторы находятся на верхнем (нижнем) уровне, либо берут некую “среднюю точку” по интенсивностям (концентрациям).

Необходимым моментом оптимизации является описание оптимальной области и условий, близких к оптимуму. Возможно нахождение условного экстремума, поэтому после нахождении оптимальных условий для некой группы факторов, неплохо поставить новый ОЭ по группе факторов и убедится в их незначимости или значимости и перейти к оптимизации по новой группе факторов.

Независимо от конкретной схемы планирования, после нахождения оптимальной совокупности существенных факторов, есть смысл в дополнительной проверке “несущественности” тех факторов, которые были отсеяны на первых этапах. С этой целью после нахождения некого оптимума может быть поставлен ОЭ на новом фиксированном уровне существенных факторов. Стратегия такого поиска описана Максимовым и Федоровым /1/.

После нахождения группы сильнодействующих факторов и их активных уровней можно прейти к оптимизации процесса. В качестве переходного исследования от ОЭ к оптимизационному ПФЭ можно рекомендовать трехуровневый план таб.11, который повышает надежность выбора факторов и их уровней для оптимизации процесса. При проведении оптимизации с использованием двухуровневых ПФЭ или ДФЭ следует учесть ряд ограничений этого хорошо известного метода /1,4/.

Поверхность отклика ВП в зависимости от интенсивностей управляемых переменных при выращивании микроорганизмов имеет сложный многомерный вид, вообще говоря, неизвестный экспериментатору. Функция отклика в зависимости от управляемых переменных непредставима в виде достаточно простой и наглядной алгебраической форме. Но в окрестности некой точки можно разложить любую сложную неизвестную функцию, описывающую поверхность отклика, в ряд Тейлора по степеням x, у (пример для случая двух управляемых переменных).

(1) f(x,у) = a + вx +су + dxy + R(x,y) /9/.

Поскольку математика не дает возможности оценить величину остаточного члена R(x,y), то приходится делать достаточно спорное предположение, что R(x_,у) = 0 и переходить к модели

(2)  f(x,y) = a + bx + cy + dxy,

которая, вообще говоря, может быть и неадекватной из-за неизбежного пренебрежения остаточным членом R(x,y), что является первым “подводным камнем”.

В уравнении (2) нужно определить неизвестные a,b,c,d, располагая четырьмя измеренными значениями f(x_i ,y_i) - ВП (1;..;4). Получается система из четырех линейных уравнений для четырех переменных, которая может иметь единственное решение.

Дадим геометрическую интерпретацию уравнению (2). При фиксированных значениях f(x ,y) = const (линии равного выхода) получаем уравнения для различно ориентированных относительно осей х. и у искаженных гипербол. Следовательно, в пространстве это могут быть - гиперболический цилиндр (стационарное возвышение), либо гиперболический параболоид (седловидная поверхность), либо однополостный гиперболоид /9/.

Уравнение (2) в принципе не описывает поверхность типа параболоида или двухполостного гиперболоида, для этого в уравнении должны присутствовать новые члены вида ех² + fу², которые в дополнении к уравнению (2) для линий равного выхода могут описывать семейство эллипсов, смещенных и разноориентированных относительно начала координат, а в пространстве описывают параболоид или двухполостный гиперболоид. Но именно параболоид или двухполостный гиперболоид (“шапочка”) наиболее адекватно описывает поверхность отклика вблизи максимума. Следовательно, ДПФЭ - достаточно грубая модель, которую следует воспринимать в большей степени как информацию к размышлению, а не как однозначное и не подлежащее сомнению руководство к действию.

Современные достижения прикладной математики, наличие персональных компьютеров и разнообразных доступных прикладных программ устраняют вычислительные проблемы, но остаются принципиальные проблемы решения системы линейных уравнений с неточными коэффициентами, так называемых плохо обусловленных систем (ПОСЛУ), которые относятся к некорректно поставленным задачам /10,11/.

ПОСЛУ - такая система, при решении которой с конечной (не важно какой) точностью, появляются ложные решения, зависящие также от последовательности выбора уравнений из системы при решении методом подстановки /11/. Появление ложных решений связано с тем, что компьютер (калькулятор) производит арифметические действия с конечной (не важно, какой) точностью и в процессе вычислений накапливаются ошибки округления /10,11/. Другой источник неустойчивости решения ПОСЛУ - приближенные значения коэффициентов при переменных как эмпирических значений /11/. Один из путей регуляризации некорректно поставленных задач - проверка вычисленных корней подстановкой /10/. Поэтому при использовании программ для ПК следует отдать предпочтение тем программам, в которых при решении ПОСЛУ предусмотрены автоматизированный перебор уравнений и подпрограмму по автоматической проверке полученных решений подстановкой (проверка на обусловленность). Не отрицается и интуитивный путь выбора истинного решения из нескольких, предлагаемых компьютером /10/, полученных в результате различной последовательности выбора уравнений.

Кроме того, ПОСЛУ с неточными коэффициентами сама по себе является некорректно поставленной задачей, т.е. небольшое изменение начальных условий приводит к значительному изменению решения, полученные решения неустойчивы. Рассмотрим пример, описанный в литературе /13/.

СЛУ (1)

х+10у = 11,1

х+101у=111 решение системы (1) - х=11,1; у=0.

СЛУ (2)

х+10у=11

х+101у=111 решение системы (2) - х=1; у=1.

Различия свободных членов на 1% в первых уравнениях систем (1) и (2) приводят к сильному (более 100%) изменению решений и при этом каждое решение для своей системы является единственным и истинным. Увеличение числа уравнений и неизвестных увеличивает неустойчивость возможных решений.

Кроме этого, если в уравнении (2) d=0, то получится переопределенная СЛУ, в которой число уравнений больше числа неизвестных.

Дадим геометрическую интерпретацию. Как известно /9/, система двух линейных уравнений с двумя неизвестными может иметь единственное решение, геометрический смысл которого - точка пересечения двух прямых 1 и 2 (рис. 5).

Рисунок 5. Геометрическая интерпретация возможных решений переопределенной системы линейных уравнений

В переопределенной СЛУ третье уравнение описывает третью прямую -3 (рис. 2), которая может совпадать с одной из двух первых, либо проходить через точку пересечения первых двух, но может проходить совсем в стороне - прямая 4 (рис. 2).

При наличии ошибки, с которой задаются управляемые переменные х. и у, а также ошибки измерения ВП, вокруг каждой прямой будет некий коридор ошибок. Учитывая приблизительный характер самой модели, можно в качестве единственного решения выбрать точку, равноудаленную ото всех прямых (точка А). Но пока эта часть полностью принадлежит человеку и подобных программ для ПК еще нет.

Для ПФЭ 2⁴ при использовании модели типа (2) получим 4 переменных для 16 уравнений, и нахождение единственного решения приобретает не столько математический, сколько философский смысл. Прикладная математика обходит эту сложность тем, что программы для решения СЛУ на основе ДПФЭ решают расширенную систему. Например, для 4-х переменных и 16-ти экспериментов это будет система с 15-ю неизвестными, расставленными по плану табл. 6. Одну и ту же систему компьютер будет решать для количества переменных от 4 до 15-ти включительно, автоматически вводя фиктивные переменные сверх выбранных экспериментатором при работе с программами, в которых предусмотрено специализированное окно для расчетов по плану ДПФЭ. Искусственно введенные столбцы описывают взаимодействие факторов, каждая линейная комбинация описывает свой набор взаимодействующих предшественников, подобно столбцам, начиная с №5 таб. 6.

Поскольку последующие столбцы являются линейной комбинацией первых, то полученные уравнения будут описывать прямые, проходящие через общую единственную точку, что доказывается в классических курсах по аналитической геометрии. При использовании программ, рассчитанных на решение СЛУ без привязки к ПФЭ, следует учесть этот момент. Решение СЛУ по результатам ПФЭ с применением стандартных программ общего назначения необходимо проводить, самостоятельно расширяя количество переменных за счет введения фиктивных, описывающих взаимодействие факторов по правилу таб.5. Например, для ПФЭ 2⁴ из 16 уравнений можно оставить 5, но это можно сделать многими неоднозначными способами и получить несколько противоречащих моделей, но можно расширить количество переменных до 15 ти взяв расширенный план таб.6. Это позволит учесть и взаимодействие между факторами, часто встречающееся в микробиологии.

Поэтому, на наш взгляд, наиболее рационально до построения полиномиальной модели провести обработку полученных результатов измерений ВП наибольшим количеством способов - построение корреляционных таблиц и полей, использование непараметрических критериев и т. д. /7/ для получения дополнительной информации, выделения сильно действующих факторов и обоснованно отбрасывая незначимые факторы и их сочетания до расчета коэффициентов полинома. После этого из обобщенной полиномиальной модели можно обоснованно построить модель со значительно меньшим количеством переменных. Так в работе /12; 14/ после соответствующей обработки было оставлено 5 переменных из первоначально подозреваемых 15. Последующие расчеты уточнили вид модели, и осталось только 3 члена. Такая предварительная обработка позволяет обнаружить ложные решения, в которых коэффициенты полинома не вписываются в допустимый коридор ограничений, полученный из применения дополнительной информации на основе корреляционных таблиц и полей, без значительного количества арифметических расчетов.

Поскольку ПОСЛУ с неточными коэффициентами и конечной точностью вычислений относится к некорректно поставленным задачам /10,11/, то выбор наиболее адекватного решения (регуляризация некорректно поставленной задачи) должен проводиться с использованием дополнительной информации /11/. При этом, чем больше уравнений, тем больше дополнительной информации можно получить, используя статистические методы обработки полученной информации до формулировки полиномиальной модели и решения СЛУ.

По нашему мнению, необходимо не менее 8 экспериментальных точек (от 3^х до 7^ми факторов, ДПФЭ 2³), что позволяет построить корреляционную таблицу, применить сериальный критерий с надежностью не менее 80% , а также метод парных сравнений, не требующие арифметических вычислений, а только преобразования первоначального плана корреляционную таблицу перестановкой строк и столбцов для увеличения наглядности и логического осмысления результатов согласно разработанным математиками правилам (сериальный критерий, метод парных сравнений). Увеличение количества подозреваемых переменных при постановке первого ОЭ увеличивает вероятность успешного поиска не только из-за увеличения количества проверяемых факторов, но и из-за повышения точности, вызванной увеличением количества экспериментов в серии, и независимых измерений ВП - преимущества применения пространства высокой размерности. Одновременная постановка серии экспериментов позволяет учесть возможный временной дрейф результатов измерений ВП, переходя к относительным единицам и внутренним эталонам для каждой серии, позволяя точнее сравнивать и использовать результаты различных серий.

Неустойчивость решения СЛУ как модели ДПФЭ следует также и из природы микробов, поскольку одно или несколько из проверяемых переменных могут оказаться регуляторными факторами для синтеза ЦП. При наличии неконститутивного оперона интенсивность синтеза целевого продукта может колебаться в десятки раз при относительно небольших изменениях управляемых переменных (на десятки %), что выражается в сильной кривизне поверхности отклика (зависимость ВП от управляемых переменных).

Исходя из вышеизложенного, после постановки ДПФЭ, не следует спешить с вычислением “точных значений” коэффициентов полинома гиперболической модели типа (2). Согласно нашему опыту, перспективнее обработать результаты измерения ВП с применением метода парных сравнений и сериального критерия. Хорошую информацию дает построение распределения ВП в зависимости от номера эксперимента в ранжированном ряду, расчеты коэффициентов корреляции рангов по нескольким критериям, построение нескольких корреляционных таблиц с учетом ошибки измерения ВП и перестановкой перекрывающихся значений ВП в ранжированных рядах, построение корреляционных полей.

Оправдывается подход, при котором несколько низкоточных методов обработки результатов измерений и рассмотрение альтернативных моделей оказываются более конструктивным, чем применение одного высокоточного, поскольку высокая точность вычислений коэффициентов полиномиальной модели - кажущаяся, особенно при значительной ошибке измерений ВП, который в случае химического эксперимента можно довести до нескольких процентов, а микробиологический или медико-биологический - гораздо менее точный. Многие измерения параметров бактериальной популяции проводятся с точностью 10 -20%, что считается неплохим и близко к предельно возможной точности измерения в бактериологии /16/. Нередко ошибку измерений вообще трудно оценить и приходится пользоваться качественными оценками (например, реакция агглютинации или диффузионной преципитации, другие иммунохимические измерения, кроме РИА и ИФА и т.д.).

Если сглаженная функция распределения ВП в зависимости от ранга эксперимента представляет собой достаточно монотонную кривую типа 1 (рис. 3), близкую к обратно пропорциональной зависимости, то есть смысл искать коэффициенты полинома гиперболической модели типа (2). Если указанное распределение имеет более сложный вид типа кривой 2 (рис. 3), то нужно разбивать выбранные факторы на более мелкие блоки и ставить дополнительные эксперименты, хотя и в этом случае уже можно провести отсеивание и сократить количество подозреваемых факторов. Наличие участков, близких к горизонтальному, на распределении типа 2 (рис. 6) отражает наличие почти эквивалентных сочетаний выбранных факторов. Сложная зависимость ВП от номера эксперимента говорит о невозможности применения полиномиальной модели, о неадекватности гиперболического приближения поверхности отклика в изучаемой окрестности контролируемых факторов и необходимости дополнительных экспериментов.

После анализа полученной информации и доказательств адекватности гиперболической модели можно провести качественную ранжировку значимости факторов, обоснованно выбрать сильнодействующие, отбросить слабые факторы и их сочетания и принимать решение о целесообразности и виде полиномиальной модели

Рисунок 6. Возможные зависимости выхода процесса от номера эксперимента в ранжированном ряду после постановки серии опытов

Получив несколько решений СЛУ, что быстро и несложно даже при использовании ПК со слабыми процессорами, выбираем решения, наиболее соответствующие полученной ранее информации.

Описанный подход был использован при изучении влияния условий культивирования на антигенный состав вакцины чумного микроба /12/ и при изучении влияния условий культивирования на синтез антигена F41 E.coli ВГНКИ 397А / 37-14 / /8,20/.

Постановка ПФЭ 2⁴ для изучения вакцины чумного микроба позволила в первой же серии из 16 экспериментов найти условия, при которых пестицин и рН: - антиген экспрессировались независимо при разных условиях культивирования. Это согласуется с опубликованными ранее данными генетиков о том, что эти антигены находятся в составе разных оперонов и регулируются независимыми промоторно-операторными участками. В сериях однофакторных экспериментов получить такую информацию было бы крайне затруднительно. Но генетикам необходимо располагать данными физиологов, чтобы строить модели регуляции экспрессии того или иного признака внешними условиями.

Для продуцента диагностические важного проективного антигена F41 энтеропатогенной кишечной палочки после многофакторного поиска была сконструирована среда, обеспечивающая более высокий уровень синтеза названного антигена клетками. Это послужило основой для получения высокотитражной специфической антисыворотки и значительно повысило надежность определения указанного антигена в полевых штаммах, подозреваемых как возбудители колидиаррей молодняка крупного рогатого скота. Такая информация позволяет обоснованно провести эпизоотологический анализ вспышки инфекции и провести рациональную терапию больных животных, в первую очередь - антибиотикотерапию. Возможность наращивать штаммы с большим количеством протективного антигена служит основой эффективного осуществления специфической вакцинопрофилактики.

Предлагаемый подход с использованием семейства синтетических сред, составленных по близкому к оптимальности плану из индивидуальных химических соединений разных классов, учитывает только самую общую внутреннюю структуру живой системы, основан, прежде всего, на контроле внешних условий и изучении реакций системы. По нашему мнению такой подход может быть обобщен не только на плохо изученные штаммы микроорганизмов, но и для подбора и оптимизации рационов у более организованных живых систем и иные выходы процесса. Это следует из того, что регуляция активности оперонов условиями окружающей среды едина у всех живых организмов /15/.

Частные примеры применения многофакторного поиска

Рассмотрим конкретный пример. Объектом исследований служил штамм Е.соli ВГНКИ 397А/37-14 , продуцент диагностически значимого в ветеринарной микробиологии протективного поверхностного антигена F41. Подобные штаммы вызывают холероподобные диарреи у новорожденных телят и вспышки инфекции в крупных хозяйствах с высоким количеством летальных исходов, принося значительные убытки. Первоначально располагали сывороткой анти-F41, полученной к указанному референс - штамму, которая давала реакцию агглютинации бактериальных клеток при их культивировании на среде Минка /5/ с оценкой (+), на пределе чувствительности. Это медленное (5 - 6 мин) неполное образование мелких зерен из суспензии бактериальных клеток, видимые при небольшом увеличении, и отсутствие агглютинации при культивировании на агаре Хоттингера или кровяном и шоколадном агаре. Максимально возможная оценка агглютинации - (4+) - быстрое (1-2 сек) слипание всех клеток в крупные, видимые невооруженным глазом, быстро восстанавливающиеся после перемешивания конгломераты. Морфологически названный антиген - фимбрии на поверхности клеток - при просмотре в электронном микроскопе не выявляли. Возникло предположение, что ген, ответственный за синтез антигена F41, подвержен регуляции компонентами питательной среды.

Для проведения поиска факторов, влияющих на синтез целевого продукта, был выбран план ОЭ, представленный в таб. 4 и факторы, указанные выше в качестве примера в общей части, по сверхнасыщенной схеме 2-го типа (два фактора в одном столбце, по одному фактору на уровень).

В результате серии экспериментов, поставленных по вышеприведенной схеме, было найдено, что регуляторными факторами для синтеза антигена F41 клетками E coli ВГНКИ 397А/37-14 являются величина рН, концентрации глюкозы и неорганического фосфата. Такую информацию было практически невозможно найти в сериях однофакторных экспериментов, потому что только в экспериментах первой серии по плану таб.5 в №№1-4 ВП отличался от 0. Поскольку ВП - синтез значимого антигена - определяли полуколичественно, в капельной реакции агглютинации со специфической антисывороткой на пределе чувствительности, то в силу низкой точности измерения применять полиномиальную модель было нецелесообразно, что подробно рассмотрено выше.

Кроме этого, наличие практически одинакового ВП в первых 4^х экспериментах и ВП = 0 в других (ступенчатое распределение зависимости ВП от № эксперимента, кусочно-непрерывная связь ВП = F(№э)), делает невозможным применение результатов для расчета коэффициентов полиномиальной модели. Построение корреляционной таблицы и применение сериального критерия позволяет наглядно выделить группу сильнодействующих факторов, установить связь между явлениями, оценить надежность сделанных выводов и обоснованно спланировать следующую серию экспериментов. После проведения дополнительных серий многофакторных и однофакторных экспериментов с меньшим количеством подозреваемых факторов была сконструирована плотная питательная среда на основе кислотного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта с таким соотношением фосфата и глюкозы при рН 8.0. Разработанная среда позволила значительно увеличить синтез диагностически значимого антигена F41 клетками Е.соli ВГНКИ 397A/37-14 при небольшом снижении урожая биомассы, выращенного на чашке. Глубинное культивирование на основе найденной комбинации условий было неудачным для синтеза указанного антигена.

В качестве примера приводим следующие цифры - при иммунизации 8 кроликов живой культурой, выращенной на среде Минка только от одного животного была получена антисыворотка, которая давала реакцию агглютинации с оценкой (+) без разведения антисыворотки. Иммунизация убитой культурой, выращенной на разработанной среде, позволила получить от худшего животного антисыворотку, дающую агглютинацию с оценкой (3+) в разведении 1/10, от лучшего в разведении 1/30, всего было использовано 7 кроликов. Оценка (3+) - слипание бактериальных клеток в течение 1 мин. в устойчивые к перемешиванию конгломераты различной величины. Допускается наличие небольшого количество не слипшихся клеток.

При просмотре в электронном микроскопе (негативный контраст, фиксация фосфорно-вольфрамовой кислотой) наблюдали классические фимбрии, в отличие от клеток, выращенных на среде Минка. Повышение качества агглютинации до уровня (4+) было затруднено нестабильностью экспрессии признака F41 при выращивании продуцента на разработанной среде. Клонирование признака F41 не привело к получению более стабильного и активного продуцента. Полученные результаты были признаны патентоспособными /8/.

Поскольку ВП измеряли с высокой ошибкой из-за отсутствия более точных методов, то полученные результаты не столько служили для количественных расчетов, сколько способствовали экспериментальному нахождению области, близкой к оптимальной. Такой подход легко оспорить и трудно обосновать, но в данном случае он сработал.

Применение убитой культуры для инъекций кроликов повышает выход животных, выдержавших курс гипериммунизации (1,5 месяца). При инактивации культуры происходит частичная инактивация антигенов, поэтому такую процедуру можно проводить только с клетками, которые содержат много нужного антигена в своем составе.

В дальнейшем была сконструирована плотная питательная среда на основе пептона (7 -12 -г/л) с лактозой (2 - .4 - г/л) при рН 8,0. Количество добавляемого фосфата (3 -10 г/л) зависит от партии пептона и содержания в нем неорганического фосфата. Замена глюкозы на лактозу повышает как селективность среды для роста лактозоположительных кишечных палочек, так и технологичность, т.к. лактоза не образует токсичных соединений с азотсодержащими компонентами при автоклавировании в составе готовой среды в режимах до 1 атм., 30 мин.

При наличии хорошей партии пептона, не обсемененной спорообразующими микробами, достаточно прокипятить 5-10 мин. готовую среду и сразу использовать. Даже в случае низкой обсемененности достаточно прокипятить готовую среду дважды в течение дня. Это весьма практично при работе с быстрорастущими штаммами, не подлежащими длительному хранению и дальнейшему использованию после измерения нужных биохимических или иммунохимических свойств.

Полученные в дальнейшем результаты с использованием разработанной среды и наличии высокотитражной специфичной антисыворотки /8,20/ свидетельствуют, что отсутствие в среде углеводов полностью выключает синтез антигена F41. Такие клетки можно использовать при фракционирования поливалентной сыворотки для удаления посторонних антигенов в качестве афинного сорбента. Наличие эритрита тоже отрицательно влияет на синтез антигена. Маннит, сорбит, ксилоза, мальтоза влияют на синтез антигена F41 положительно. Другие углеводы, сахароспирты и жирные кислоты не испытывали. Добавление глицерина приводит к образованию обильного внеклеточного полисахарида, значительно затрудняющего суспендирование бакмассы в физрастворе до смешивания с антисывороткой.

Описанная выше среда на основе пептона и лактозы обеспечивает синтез антигена F41 при глубинном культивировании, но работа в этом направлении не была завершена, среда нигде не описана ранее. При применении различных источников углерода в составе разработанной среды, возможно, наблюдать штаммоспецифичное разнообразие экспрессии антигена, что происходит при эпизоотологическом анализе распространения антигена F41 среди изолятов кишечной палочки, выделенных из неблагополучных по колидиарреи хозяйств. Эту работу проводили на базе бывшей фирмы “Диавак'' под руководством Гусева В.В. и при помощи Тазиной О.И. и Глазкова Н.К.

Вид клеток кишечной палочки ВГНКИ 397А /37-14, выращенных на разработанной среде /8,20/. Фимбрии представлены в большом количестве и достаточно наглядно. Белая черта на фото - 1 мкм. Для фото выбрана одна из лучших клеток, поскольку разброс в количестве фимбрий на клетку в популяции весьма велик.

Описанный подход многофакторного поиска был использован при изучении влияния условий культивирования на антигенный состав вакцины чумного микроба /12/. Приводимые здесь детали планирования ОЭ и обработки ПФЭ не были опубликованы ранее в силу специфики журнала /12/ и опубликованы позже /14,20/. Постановка ПФЭ 2⁴ для изучения вакцины чумного микроба позволила в первой же серии из 16 экспериментов найти условия, при которых пестицин и F - антиген экспрессировались независимо при разных условиях культивирования, что согласуется с опубликованными ранее данными генетиков о том, что эти антигены находятся в составе разных оперонов и регулируются независимыми промоторно - операторными участками. В сериях однофакторных экспериментов получить такую информацию было бы крайне затруднительно. А генетикам необходимо располагать данными физиологов, чтобы строить модели регуляции экспрессии того или иного признака конкретным продуцентом.

Таблица 12

Корреляционная

В таб. 12 рН6 обозначает антиген рН6, Pst - антиген пестицин.

Работу проводили с вакцинным штаммом Y.pestis EV линии НИИЭГ. Влияние параметров культивирования и состава питательных сред на синтез антигенов изучали, используя план ПФЭ 2⁴/1/. Корреляционная таблица 11 составлена перестановкой строк исходного плана по группировке антигенов рН6 и Pst. Жизнеспособность определяли как отношение КОЕ к оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной на красном фильтре ФЭК в кювете 1 см оптического пути.

Из представленных данных видно, что синтез рН6 антигена коррелирует с повышенной аэрацией в объеме среды 25 мл на колбу 700 мл и пониженной жизнеспособностью популяции. Имеется одно “выскакивающее” значение в опыте №13, которое можно объяснить промахом при постановке эксперимента в виде пропущенной или лишней добавки.

Параметры, стимулирующие синтез антигена Pst, находятся в области рН 7,0, объеме среды 100 мл, и повышенном показателе жизнеспособности. Уровни показателей жизнеспособности клеток, продуцирующих названные антигены, достоверно отличаются друг от друга. Одновременный синтез антигенов рН6 и Pst наблюдали только в одном эксперименте, что, возможно, обусловлено неким промахом при простановке серии опытов, что естественно в практической работе. Синтез мышиного токсина и антигена F1 от условий культивирования не зависел.

Полученные данные подтверждают, что возможно управление процессом культивирования с целью получения культуры, обогащенной определенным антигеном. Это упрощает дальнейшую биохимическую очистку для получения чистых препаратов антигенов, используемых для получения специфических антисывороток и при иммунохимических реакциях с изучаемой культурой.

Ранжировка результатов ПФЭ по уровням концентраций клеток и применения вышеуказанных распределений (данные не приведены) показало, что основными факторами, влияющими на общее количество клеток, являются концентрация галактозы, совместное действие рН и аминного азота и совместное действие галактозы и аминного азота. Согласно этому были проведены количественные расчеты, которые подтвердили, что именно эти параметры влияют на рост культуры. При этом зависимость нелинейная и определяется, прежде всего, взаимодействием факторов.

Приведенные экспериментальные данные демонстрируют, что только использование многофакторного эксперимента позволило решить задачи поиска регуляторных факторов для указанных выше культур. В серии однофакторных экспериментов этого бы сделать либо вовсе не удалось, либо удалось бы с большими трудозатратами и непредсказуемым везением.

Использование плана многофакторного поиска, близкого к оптимальному, позволило быстро найти минимальную группу регуляторных факторов среди достаточно большого множества подозреваемых и в первой же серии оценить тенденцию влияния найденных факторов и их концентраций (интенсивностей) на ВП, что позволило осознанно поставить следующие эксперименты при относительно небольших трудозатратах.

Пример многофакторного поиска компонентов питательной среды для культивирования Trichoderma аureoviride, любезно предоставленный К.М. Минеральные соли, характерные для этого микроба, взяты как константы.

Таблица 13

План поиска добавок для культивировании Т.А.

План таб. 14 на первый взгляд построен без каких либо критериев оптимальности, тем не мене дает обильную информацию к размышлению при проверки 12 добавок на 10 опытах. Но при более детальном анализе видно, что выдержано основное условие многофакторного поиска - выбрана группа из 12 подозреваемых соединений разных классов - аминокислоты и углеводы, за тем проводили испытания, делая групповые выборки. Максимальная выборка - 11 факторов, остальные в интервале от 4 до 6 факторов в опыте. Это близко к оптимальному разбиению выбранного множества 1:2. Устойчивость серии экспериментов, состоящей из отдельных опытов с различными выборками подозреваемых факторов, не требует выдерживать жесткую оптимальность, которая на первом этапе не обязательна и весьма расплывчата.

Даже без ранжировки видно, что сильно действующими факторами являются добавки сахарозы и метионина, остальные аминокислоты практически взаимозаменяемы, но нужны, прочие углеводы малозначимы по влиянию на выход биомассы. Т.е. даже практически первый построенный план многофакторного поиска более информативен, чем серия однофакторных экспериментов. Попробуйте самостоятельно оценить минимальное количество опытов по методу Зайделя-Гаусса для проверки значимости 12 выбранных экспериментов (задача отсеивания и нахождения сильно действующих факторов, сокращения количества изучаемых факторов).

Приведенный пример достаточно убедительно демонстрирует, что классификация проверяемых факторов на сильно действующие (позитивные, индукторы), нейтральные и токсичные (ингибиторы, корепрессоры) позволяет объединять их в достаточно большие группы и ставить серийные эксперименты по сверхнасыщенной схеме, когда количество проверяемых факторов превышает количество единичных испытаний. При этом возможно получить несложно трактуемые результаты без значительных арифметических вычислений и обоснованно поставить следующую серию поиска сильнодействующих факторов, либо перейти к нахождению оптимального соотношения выделенных сильно действующих факторов, если их количество сократилось до некого приемлемого уровня.

Можно считать приемлемым количеством 4-5 выделенных факторов. Тогда ПФЭ 2⁴ это 16 опытов, в 2 повторностях - 32 опыта и при работе с колбами - вполне реальные цифры. Для 5 факторов соответственно 32 и 64 эксперимента, что тоже реально, либо те же 16 и 32, если ставить ДФЭ 2^5-1 , выбрав некое сочетание факторов незначимым на основании предварительных испытаний.

Контурно-графический анализ результатов измерений

Для обработки результатов экспериментов с минимальным количеством арифметических вычислений можно использовать контурно-графический анализ Клейнмана и Берча /цит. по /18/. Сущность его состоит в упорядоченном расположении опытов в факторном пространстве путем построения графических зависимостей ВП от управляемых переменных в виде двумерных сечений поверхности отклика. Получение дополнительной информации происходит путем линейной экстраполяции графических зависимостей через построение на двумерных сечениях поверхности отклика линий постоянного уровня ВП в зависимости от концентрации (интенсивности) разнообразных парных выборок факторов.

Х

Рис. 6. Контурно-графический метод

Методами контурно-графического анализа можно строить на кальке контурные линии различных сечений функции отклика, характеризующей процесс. Совмещая координатные оси этих графиков, и просматривая кальки на просвет, можно достаточно быстро выбрать оптимальные условия ведения процесса. Работа не сложная и не связана с большим количеством арифметических вычислений. Недостаток этого метода - необходимость располагать большим количеством экспериментальных точек, измеренных с высокой точностью. Однако при решении задач по увеличению выхода биомассы, когда работа идет с чашками или пробирками, когда проще засеять несколько десятков проб, несложно набрать необходимую статистику и обеспечить приемлемую точность измерения ВП при минимальных арифметических вычислениях. При этом отпадает необходимость глубоко анализировать небольшое количество измерений с помощью разных статистических методов, не всегда понятных экспериментатору.

Схемы Берча и Клейнмана не исчерпывают всех возможных вариантов расположения экспериментальных точек в факторном пространстве. Следует иметь в виду, что расстояние между экспериментальными точками не должно быть слишком большим. В противном случае при значительной кривизне и сложной форме поверхности отклика неизбежные погрешности линейной экстраполяции могут отрицательно сказаться на разработку возможных прогнозов.

Заключение

Описанный выше подход основан на минимальном знании внутренней структуры изучаемого объекта, в первую очередь генетики и физиологии, и предназначен быть базой, как для изучения (построения) частной физиологии, так и частной генетики живой системы. Этот подход оперирует в основном контролем внешних условий и измерением реакций системы, не обязательно с высокой точностью. Допускается использование качественных и экспертных оценок, что важно при сложных реакциях мало изученной системы. В ряде случаев можно обойтись отображением результатов измерений в виде графиков, корреляционных таблиц и полей при минимуме арифметических вычислений. По нашему мнению, такой подход может быть применим и к системам более высокой, чем микробы, организации и более сложным синтезам. Поскольку ВП в большинстве случаев измеряют с применением химических методов, то и для чисто химических процессов такой подход тоже применим, особенно для задач поиска условий кристаллизации или ферментативной активности. В органической химии исследователи оперируют в большинстве случаев небольшим количеством переменных. В таком случае можно ограничится планами на уровне ДФЭ, трехуровнего плана таб.11 и ПФЭ.

Литература

1. Максимов В.Н., Федоров В.Д., Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М.,МГУ.,1969., 125 с.

2. Ленинджер А., Биохимия., М., “Мир”., 1874., 956 с.

3. Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж., Мир микробов., т.1., М., “Мир” 1979.,320 с.

4. Максимов В.Н., Многофакторный эксперимент в биологии. М.,МГУ.,1983. 452с.

5. Шулюпин О.К. Критерии оценки оптимальности отсеивающих экспериментов. Депонированная рукопись. НПО “Медбиоэкономика” 17.11.88. реферат опубликован в библиографическом указателе ВИНИТИ “Депонированные научные работы” 1989г,№ 3, стр.115.

6. Morris J.A., Thorng C., Scott A.C., Adhesion in vitro and in vivo associated with an adhesive antigen (F41) produced by a K99 mutant of the reference strain E.coli B41. Inf. Imm. 1982. V.38. № 3, р.1148-1153.

7. Архипов Г.П., Лаврова И.Г., Трошина И.М., Некоторые современные методы статистического анализа в медицине., М. “Медицина”. 1971., 123 с.

8. Шулюпин О.К., Светоч Э.А., Жиленков Е.Л., Гусев В.В., Тугаринов О.А., Малахов Ю.А., Питательная среда для выявления фимбриального антигена адгезии F41. Патент SU 1720652., 23.03.1992 г. Бюл.№11., 4 с.

9. Корн Г., Корн Т., Справочник по математике. М. “Наука”. ГРФМ. 1984.831с.

10. Эберт К., Эдерер Х. Компьютеры, применение в химии. М.“Мир”.1988. 264с.

11. Тихонов А.Н., Уфимцев М.В., Статистическая обработка результатов экспериментов. М. МГУ. 1988. 135 с.

12. Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Шулюпин О.К., Негрий В.Ф., Мицевич Е.В., Экспрессия основных антигенов и ростовые свойства клеток Yersinia pestis в средах различного состава при 37⁰С. ЖМЭИ. 1993., № 1,с.16-20.

13. Хургин Я.И. Да, нет, или может быть. М. “Наука”. ГРФМЛ.1983. 206 с.

14. Шулюпин О.К. Проведение работ по поиску условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами значимого продукта. Пущино. 20007 г. 11-я международная Пущинская школа-конференция. Сборник тезисов.331 с.

15. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М. Мир. 1978. 456 с.

.Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М. Мир , 1967.345 с.

. Martin, J.E.< et al/1967/Public Health Rep. 82 361.

18.Саутин С.Н. Планирование эксперимента в химии и химической технологии. “Химия”. 1975.48 с.

. htt://www.smolensk.ru/user/sigma/MMOR/N-29-html/Shulyupin-2.htm