Принципы, лежащие в основе метода капиллярного электрофореза
Санкт-Петербургский
Государственный Университет
Химический
факультет
Реферат
на тему: «Принципы, лежащие в основе метода капиллярного электрофореза»
Дисциплина:
«Принципы и концепции современной химии»
Санкт-Петербург
год
Введение
Капиллярный электрофорез - это метод анализа
сложных смесей, использующий электрокинетические явления - электромиграцию
ионов и других заряженных частиц и электроосмос - для разделения и определения
компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое
поле, преимущественно высокого напряжения. Если раствор находится в тонком
капилляре, например в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль
капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток
жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так
как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В
то же время такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные,
конвекционные, гравитационные и т.п., в капилляре существенно ослаблены,
благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений.
Принципы метода капиллярного
электрофореза
Метод капиллярного электрофореза (КЭФ) появился
сравнительно недавно. Первые упоминания о нем относятся к середине 70-х годов
XX века. Затем, в 80-е были созданы и запущены в серийное производство первые
приборы, и, наконец, в 90- е годы прокатился бум практического использования
этого метода в аналитических лабораториях мира наряду с другими
инструментальными методами. Надо заметить, что основные закономерности
электрофореза (как движения заряженных частиц в электрическом поле в среде
электролита) были известны уже в конце XIX века. Но лишь спустя столетие
технологии позволили изготавливать кварцевые капилляры очень малых (на уровне
десятков микрон) и, главное, равномерных внутренних диаметров прозрачных в
ультрафиолетовой области. К этому моменту был накоплен также значительный опыт
по возможностям детектирования аналитических сигналов в потоке.
Аналитические методы, основанные на принципе
электрофореза, были предложены Тиселиусом в 1937 году. За разработку метода
электрофоретического разделения макромолекул он был удостоен Нобелевской премии
в 1948 году.
Метод КЭФ основан на принципе разделения
компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного
электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (около 2 нл) вводят в
капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После
подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ) компоненты смеси
начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь
от заряда и массы (точнее - от величины ионного радиуса), и соответственно в
разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков
называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества
является параметр удерживания (время миграции), а количественной (после
построения градуировочной зависимости) - высота или площадь пика,
пропорциональная концентрации вещества.
Двойной электрический слой
В методе КЭФ используется принцип свойств
поверхности раздела двух фаз - жидкости и твердого тела, свойств вязкости
жидкости и свойств ее ионной электропроводности.
Рис. 1 - Схема процессов, происходящих на
поверхности кварца: а) ювенильная (свежесозданная) поверхность кварца; б)
образование силанольных групп на поверхности кварца; в) диссоциация силанольных
групп в водном электролите; г) гидратация образовавшихся ионов; д) связывание
части катионов с поверхностью, формирование двойного электрического слоя
На границе раздела двух фаз - внутренней
поверхности кварцевого капилляра и водного раствора электролита, заполняющего
капилляр, происходят следующие процессы. На свежеобразованной (ювенильной)
поверхности плавленого кварца (SiO2) находятся главным образом силоксановые
группы (рис. 1а). При контакте с парами воды или водными растворами
силоксановые группы, обладающие двойными связями, оказываются неустойчивыми и,
присоединяя молекулу воды, образуют силанольные группы (рис. 1б). При контакте
поверхности кварца с водными растворами, силанольные группы диссоциируют с
отщеплением ионов Н+ (рис. 1в). Степень диссоциации зависит от температуры и
состава водного раствора, в частности от величины рН. При рН> 2,5 на
поверхности кварца образуются диссоциированные силанольные группы, которые
создают отрицательный поверхностный заряд.
Диссоциированные ионы, находящиеся как на
кварцевой поверхности, так и в объёме электролита, гидратируются (рис. 1г). За
счёт сил кулоновского взаимодействия, противоположно заряженные гидратированные
ионы, находящиеся на поверхности и в объёме жидкости, взаимно притягиваются.
Действующие при этом силы настолько велики, что ионы (часть катионов и остатки
силанольных групп) частично теряют гидратирующую воду. В результате этого,
первый слой катионов, непосредственно прилегающий к поверхности, теряет
подвижность, связывается (рис. 1д). Поскольку "пушистые"
гидратированные катионы не могут все разместиться в виде монослоя и полностью
компенсировать отрицательный заряд поверхности, некоторая часть катионов,
нейтрализующих отрицательный заряд, отходит в толщу раствора и образует заряд,
распределённый в объеме жидкости, прилегающем к границе раздела и, в силу
меньшей энергии связи с поверхностью, обладающий способностью к перемещению
(рис. 2а).
Несмотря на сильное кулоновское взаимодействие
рекомбинации зарядов не происходит. В результате взаимодействующие системы
зарядов образуют двойной электрический слой, состоящий как бы из двух
изолированных друг от друга обкладок конденсатора, имеющих заряды
противоположного знака. Одну из обкладок составляют отрицательно заряженные
остатки силанольных групп, другая состоит из двух частей - неподвижного слоя
катионов, непосредственно примыкающих к поверхности кварца, и диффузного слоя,
образованного катионами, находящимися в объеме жидкости. Распределение катионов
между неподвижным и диффузным слоями, а, следовательно, и толщина двойного
электрического слоя зависит в первую очередь от общей концентрации электролита
в растворе. Чем она выше, тем бoльшая часть положительного заряда диффузного
слоя перемещается в неподвижный слой и тем меньше становится толщина диффузного
слоя (рис. 2б). При концентрации бинарного однозарядного электролита 10-3 -
10-4 М толщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30 - 50 мкм.
Если мысленно свернуть рассматриваемую
поверхность в виде трубы с внутренним диаметром 50 - 100 мкм, тогда окажется,
что практически вся жидкость, заполняющая её, будет представлять собой
диффузную часть двойного электрического слоя. Трубу столь малого диаметра
принято называть капилляром. Если в такой системе вдоль оси капилляра приложить
электрическое поле, то в капилляре возникнет продольное движение свободных
носителей электрических зарядов (разнополярных ионов) во взаимно
противоположных направлениях, а поскольку в диффузной части двойного
электрического слоя присутствует избыточная концентрация катионов, то число
ионов, перемещающихся к катоду будет значительно больше, при этом их движение
будет увлекать за собой всю остальную массу жидкости в капилляре (вследствие
молекулярного сцепления и внутреннего трения). Возникает так называемый
электроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду, который будет
осуществлять пассивный перенос раствора внутри капилляра (рис. 3).
Рис. 3 - Схема процессов в кварцевом капилляре.
Стрелкой показано направление электроосмотического потока
Вследствие этого процесса в электролите,
заполняющем капилляр, возникает направленное перемещение массы жидкости,
которое вызвано приложенной разностью потенциалов, при этом вся масса жидкости
(за малым исключением приповерхностного слоя) перемещается с одинаковой
скоростью, т.е. формируется плоский профиль скоростей. Это очень важное
обстоятельство, которое позволяет получить чрезвычайно высокую разрешающую
способность метода.
электрофорез кварц электролит
потенциал
Применимость метода капиллярного
электрофореза
Метод капиллярного электрофореза с успехом
применяется для анализа разнообразных веществ и объектов: катионов металлов, неорганических
и органических анионов, аминокислот, витаминов, наркотиков, пигментов и
красителей, белков, пептидов, анализа фармпрепаратов и пищевых продуктов. Также
методы с успехом применяются для контроля качества вод и напитков,
технологического контроля производства, входного контроля сырья, в
криминалистике, медицине, биохимии, в том числе для цепей расшифровки
генетического кода живых организмов и т.д.
Хотелось бы подчеркнуть особую роль
электрофоретических разделений, используемых в биологических и биохимических
анализах.
Электрофорез как биохимический метод - очень
мощное приспособление для оценки широкого спектра жизненных процессов.
Наибольшая популярность до настоящего времени принадлежит электрофорезу белков
как одному из наиболее информативных лабораторных тестов, используемых в
настоящее время. Он предполагает огромную высокоспецифичными тестами как
иммуноэлектрофорез, количественной оценкой иммуноглобулинов и других
специфических протеинов, Т- и В-лимфоцитов и стадий трансформации лимфобластов.
Электрофоретическое разделение протеинов позволяет изучать их биологические и
физические характеристики, являясь индикатором заболеваний печени и почек,
иммунной системы, злокачественной патологии, острых и хронических инфекций,
генетических поломок, заболеваний центральной нервной системы и многих других
видов патологии. Используя ацетат целлюлозу, можно разделить сывороточные белки
на 5 фракций: альбумин и 4 глобулиновых группы. Электрофореграмма сывороточных
протеинов представлена ниже, рис. 4
Рис. 4
Альбумин - низкомолекулярный сывороточный белок
(м.в. около 70000 дальтон), образующий комплексы со многими протеинами,
гормонами, пигментами, кальцием и другими субстанциями, играет ключевую роль в
поддержании осмотического давления.
Все 4 группы глобулинов характеризуются гораздо
более высоким молекулярным весом, чем альбумин и глобулины также являются
транспортными формами протеинов, образуя комплексы с пигментами, металлами,
углеводами и липидами.
Заключение
Вышеперечисленные принципы, лежащие в основе
метода КЭФ, делают его одним из наиболее перспективных методов анализа. Сейчас
он динамично развивается и получает всё более широкое применение в различных
областях аналитической химии. Несмотря на то, что теоретические основы
капиллярного электрофореза достаточно сложны, сам метод довольно прост и
доступен, он дает неоспоримые преимущества перед другими методиками при
выполнении различных измерений.
Список литературы
1. Ануфриева
Р.М., Бессчетнова Т.Ю., Каменцев Я.С. и др., «Система капиллярного
электрофореза», СПб: Изд-во «Петрополис», 2001.
2. Духин
С.С., Дерягин Б.В., «Электрофорез», М: «Наука», 1976.