Диагностика хламидиоза свиней

Диагностика хламидиоза свиней

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Витебская ордена «Знак Почёта»

Государственная академия ветеринарной медицины»

Диагностика хламидиоза свиней

ВИТЕБСК - 2012

Содержание

Введение

. Определение болезни

. Этиология

. Эпизоотологические данные

. Клинические признаки

. Патологоанатомические изменения

. Лабораторная диагностика

. Дифференциальная диагностика

Приложения

Введение

Значительный экономический ущерб свиноводству Республики Беларусь наносят инфекционные болезни, в том числе и хламидиоз свиней.

Хламидиоз свиней регистрируют во многих странах мира, в том числе и в хозяйствах Республики Беларусь. Болезнь наносит ощутимый экономический ущерб, который складывается из недополучения прироста живой массы, приплода, падежа и вынужденного убоя животных, а также затрат на проводимые мероприятия по профилактике, ликвидации болезни и за счет многократных осеменений. К тому же возбудитель хламидиоза свиней представляет большую опасность для здоровья человека.

Своевременная и достоверная диагностика - необходимое условие для успешной борьбы с любой инфекционной болезнью, в том числе и с хламидиозом свиней.

В настоящих методических указаниях представлены наиболее современные и практически приемлемые методы диагностики хламидиоза свиней. Нами дана характеристика хламидий, приведены эпизоотологические данные и клинические признаки болезни, указаны правила отбора, упаковки, оформления и пересылки патматериала, подготовки его к исследованию, определены критерии, на основании которых диагноз считают установленным.

1. Определение болезни

Хламидиоз свиней - контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся ринитом, бронхопневмонией, гастроэнтеритом, полиартритами, кератоконьюнктивитом, энцефаломиелитом, абортами, эндометритом, задержанием последа, маститом, рождением нежизнеспособного молодняка. У хряков наблюдается орхиты, эпидедимиты. Хламидиозом болеет и человек.

. Этиология

Уникальность хламидиозной патологии состоит в том, что хламидии вызывают различные по патогенезу и клиническому проявлению болезни, но принадлежат они к одному роду - Chlamydia.

В соответствии с руководством Д. Берджи, 9-е изд., (1993) возбудитель хламидиоза отнесён к царству Procariotae, отделу Gracilicutes, группе 9 Риккетсии и хламидии, порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydia в который входят следующие виды: Chl. trachomatis, Chl. psittaci, Chl. pneumoniae, Chl. pecorum. Chl. psittaci (болеют люди и птицы, у животных наблюдаются аборты и другая патология); Chl. pecorum (вызывает у животных аборты, полиартриты, энцефаломиелиты, кератоконъюнктивиты, пневмонии, энтериты и маститы); Chl. trachomatis (патогенны для человека, регистрируют трахому, лимфогранулему, цервицит, конъюнктивит); Сhl. pneumoniae (пневмонию и конъюнктивит человека).

Возбудитель неподвижен, спор и капсул не образует, грамотрицателен. В настоящее время разработано и предложено ряд методов окраски хламидий. Наиболее практически приемлемыми и употребляемыми являются методы окраски по Стампу, Маккиавелло, Романовкому-Гимзе.

Хламиидии имеют уникальный цикл развития. Они могут существовать в виде ретикулярных телец, которые не превышают в диаметре 1,2 мкм, а средний диаметр наиболее многочисленных и опасных в плане заражения промежуточных телец хламидий составляют 0,3 - 0,4 мкм, то есть размеры их соизмеримы с крупными вирусами. Самые высоко инфекционные формы хламидий (элементарные тельца) - это мелкие сферические клетки диаметром 0,25 - 0,3 мкм. Элементарные тельца являются внеклеточной формой существования, а ретикулярные (инициальные) тельца - внутриклеточной формой имеющие структуру типичных грамотрицательных бактерий.

Несмотря на то, что хламидии отнесены к царству Procariotae, особенности биологических свойств (культивирование на 6-7 дневных куриных эмбрионах, культуре клеток) приближают их к вирусам. В своем составе они содержат, ДНК и РНК (чем существенно отличаются от вирусов), около 40% липидов, 35% белка, соляную и фолиевую кислоты, имеют несколько автономных ферментных систем. Размножаясь в цитоплазме живых клеток они образуют мембранно-ограниченные цитоплазматические включения, состоящие из микроколоний (1-12 мкм в диаметре), которые распадаясь высвобождают сотни элементарных телец. Морфология хламидий зависит от цикла их развития, который слагается из следующих этапов:

)адсорбция элементарных телец на оболочке клетки и их фагоцитоз;

)трансформация элементарных телец в инициальные тельца;

)деление ретикулярных телец с образованием промежуточных форм хламидий;

)созревание промежуточных форм до элементарных телец.

Патогенные для свиней виды хламидий весьма аналогичны по морфологии, химической структуре, циклу развития, метаболизму и чувствительности к антибиотикам.

Из лабораторных животных к хламидиозу чувствительны морские свинки, кролики, белые мыши. Хорошей биологической моделью являются обезьяны.

Хламидии сравнительно устойчивы во внешней среде, хорошо сохраняются при низких температурах. В воде не теряют жизнеспособности до 17 дней, в лиофилизированном состоянии - до 3 лет, в не пастеризованном молоке - 23 дня. Возбудитель инактивируется дезсредствами в обычных концентрациях (2-3% раствор натрия гидроокиси, 3% раствор фенола, 2-3% раствор формальдегида и др.) Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда (геомицин ретард, террамицин, хлортетрациклин, окситетрациклин и другие). Трудности лечения больных свиней связаны с тем, что возбудитель является внутриклеточным облигатным паразитом и на определенных этапах инфекционного процесса становится недоступным для антибиотиков и других применяемых средств, поэтому курс лечения длительный и зачастую оказывается малоэффективным. Встречаются лекарственно-устойчивые L-формы возбудителя.

. Эпизоотологические данные

Хламидиозом болеют свиньи всех возрастов независимо от породы и пола. Источником возбудителя болезни являются больные и переболевшие животные, которые в течение 7-12 месяцев являются хламидионосителями и выделяют возбудителя с истечением из глаз, носа, с фекалиями, со спермой (хряки-производители), с мочой, молоком, с абортированном плодом, с околоплодными водами и оболочками, обсеменяя при этом все, что окружает животных. Заражение свиней происходит алиментарным, аэрогенным и половым путями. Хламидии легко преодолевают плацентарный барьер у супоросных свиноматок и инфицируют плоды (до 30%), в таком случае рождаются больные поросята (чаще с поражением желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы и суставов).

Для хламидиоза характерна стационарность, которая объясняется длительным хламидионосительством, наличием резервуара возбудителя (мышевидные грызуны и многие дикие животные). Природная очаговость обусловлена тем, что хламидии циркулируют у рыб, растений, моллюсков вызывая различные патологические состояния.

Для хламидиозной инфекции свиней характерна также сезонность. Наибольшее количество абортов приходится на зимне-весенний период. В летнее время количество заболевших животных резко снижается и заболевание переходит в латентную форму. Зимой и весной с наступлением холодов, особенно на фоне нарушений условий содержания животных, инфекция активизируется, увеличивается количество абортов и мертворождений, болезнь проявляется клиническими признаками у различных возрастных групп свиней.

Заболеваемость и летальность среди поголовья свиней зависит от формы проявления болезни. При респираторной форме течения болезни, заболеваемость составляет до 60%, летальность до 30%, при кишечной соответственно 25 - 50% и 20 - 30%. При энцефалитной форме летальность составляет 100%. Заболеваемость и летальность может увеличиваться, если хламидиоз осложняется бактериальными и вирусными инфекциями.

Несмотря на высокую инфекционность хламидий, болезнь у свиней не всегда клинически проявляется. В большинстве случаев заражение приводит к инаппарантной, хронической инфекции и к длительному хламидионосительству.

Выяснено, что хламидии, поражающие животных обладают тканевым тропизмом, но не обладают хозяиноспецифичностью.

4. Клинические признаки

Инкубационный период - от нескольких часов до 3 - 4 месяцев.

Различают: респираторную, артритную, кишечную, генитальную, энцефаломиелитную и кератоконъюнктивальную формы хламидиоза.

Хламидиоз может протекать: остро, подостро и хронически.

У хряков хламидиоз протекает хронически. При этом наблюдают полиартриты, хромоту, чаще на одну из тазовых конечностей, увеличение семенников (орхит), надсеменниковых лимфоузлов, уретриты, искривление шеи за счет пареза отдельных групп мышц, поражение желудочно-кишечного и респираторного тракта.

Основным клиническим признаком у свиноматок являются аборты и мертворождения. Обычно аборты регистрируются у 30 - 50% разовых свинок. Введение в хозяйство здоровых ранее не болевших свиноматок и покрытие их больными хряками-производителями заканчивается абортами у большинства или у всех животных. У основных свиноматок наблюдается мертворождение (по 2 - 3, иногда 4 - 7) поросят, остальные поросята остаются живыми, но уже больными. Они погибают в течение 2 - 3 недель.

Поросята - сосуны, выжившие до месяца, растут и развиваются нормально. Однако после отъема, как правило, наблюдаются рецидивы заболевания. У поросят развивается бронхопневмония, поражается желудочно-кишечный тракт. Плохой аппетит, депрессия, сонливость, повышение температуры тела до 41 - 41,5°С, поносы, сухой кашель, отставание в росте - таковы основные клинические признаки болезни. У некоторых животных развиваются артриты. Поражаются скакательные, карпальные, пальцевые суставы - они увеличены, болезненны. Многие поросята страдают коньюнктивитом, нередко у них наблюдают поражение нижней части ушной раковины, развитие очаговых дерматитов, кольцевую гангрену хвоста и его отторжение. Зачастую на первое место выступают признаки поражения центральной нервной системы: дрожание кожи, волнообразное сокращение поверхностных мышц, парезы тазовых, реже грудных конечностей. Поросята могут внезапно падать, визжать, совершать плавательные движения, но также, неожиданно поднимаются и кажутся здоровыми.

При респираторной форме наблюдается подъем температуры тела до 40 - 40,5°С. Наблюдается серозное или серозно-слизистое истечение из носовой полости, слезотечение, кашель, учащение дыхания. На 3-5-й день болезни появляется редкий сухой кашель и в легких прослушиваются хрипы. В крови отмечается лейкопения с нейтропенией. Симптомы респираторного заболевания у свиней вызванные хламидиями непостояны. Клиническое проявление болезни варьирует от латентного до тяжелой пневмонии с острым, подострым и хроническим течением. Как осложнение может быть выражен гепатит, нефрит, миокардит.

Наряду с поражением органов дыхания у некоторых животных может развиться артритная форма. При этом преимущественно поражаются скакательные суставы, реже воспалительный процесс распространяется на карпальные и пальцевые. Сутавы увеличены, болезненны. При затянувшемся хроническом процессе возможно образование свищей из суставной капсулы.

Кишечная форма заболевания характеризуется повышением температуры тела до 41°С, отсутствием аппетита, угнетением, учащением пульса и дыхания. Наиболее характерным признаком данной формы было расстройство деятельности желудочно-кишечного тракта. Затяжные поносы сопровождались тенезмами, в жидких каловых массах было много слизи с примесью крови. Больные животные заметно худели, у них западали глаза, а у некоторых отмечается серозно-слизистые истечения из носа и кашель. Временами этот симптомокомплекс несколько смягчается, а затем снова усиливается.

Генитальная форма характеризуется абортами у свиноматок, преждевременными опоросами, рождением мертвых и больных поросят. Ранние аборты могут происходить на втором месяце супоросности. Такие случаи проходят незамеченными и животное остается холостым. Свиноматки абортируют чаще в последние недели супоросности. Если опорос проходит в срок, то часть или все поросята рождаются мертвыми. Потери поросят могут достигать 70% от числа родившихся. У абортировавших животных наблюдаются маститы, эндометриты, задержание последа.

При энцефалитной форме первый признак болезни - внезапное повышение температуры тела до 40,5 - 42°С. Затем постепенно исчезает аппетит, наступает истощение и физическая слабость, наблюдается слезотечение и кашель, затем может наступить выздоровление животных. Но в большинстве случаев развивается симптомы нервного заболевания. Движения животных становятся не координированными. Конечности в путовых суставах непроизвольно сгибаются, суставы иногда бывают отечны, мягки и болезненны. У некоторых животных отчетливо проявляется хромота, наблюдается истечения из носа, у других - диарея. Больные животные обладают повышенной чувствительностью и иногда упираются головой в твердые предметы. Физическая слабость сопровождается прострацией и глубоким угнетением. В некоторых случаях незадолго до смерти отмечаются судорожные сокращения шейных и затылочных мышц. Кроме того, отмечается статическая и динамическая атаксия, дрожание головы, судороги верхних век, глаз ушей и губ.

Конъюнктивальная форма характеризуется односторонним конъюнктивитом. При этом из пораженного глаза появляются истечения, веки опухают, возникает сильная светобоязнь. На поверхности отечной слизистой оболочки видна мелкая зернистость. Воспалительный процесс может распространяться и на роговицу, вызывая кератит, а иногда и изъязвления ее. Через 8-10 дней животные выздоравливают.

Многообразие клинического проявления хламидиоза свидетельствует о том, что возбудитель поражает весь организм. Интенсивность и сочетаемость клинических признаков болезни зависит от возраста животного, иммунобиологического состояния организма, влияния факторов внешней среды.

5. Патологоанатомические изменения

Макро- и микроскопические изменения в органах и тканях при хламидиозе у свиней различных возрастных групп имеют свои особенности. Возбудитель заболевания, проявляя тропизм к репродуктивной системе, у супоросных свиноматок преодолевает плацентарный барьер, вызывает заболевание плодов, вследствие чего часть их погибает в утробе матери. Оставшиеся поросята рождаются живыми, но уже зараженными и больными.

У абортированных плодов и поросят-сосунов, погибших в первые дни жизни, наблюдается цианоз кожи в области пятачка, подгрудка, лобных костей, копытец и слизистой оболочки преддверия ротовой полости и конъюнктивы. У некоторых поросят месячного возраста в области ушей и корня хвоста обнаруживаются очаги некроза величиной около 2 см с последующим отторжением мертвой ткани. При вскрытии у них обнаруживается водянистый отек кожи и подкожной клетчатки в области затылка, подчелюстного пространства, промежности, грудных и тазовых конечностей. В подкожной клетчатке в области лобной и затылочной костей, кроме отека, просматриваются кровоизлияния. В грудной и брюшной полостях, перикардиальной сумке в большинстве случаев отмечается скопление транссудата соломенно-желтого цвета, иногда с красноватым оттенком, в легких, как у абортированных плодов, так и у павших поросят-сосунов - венозное полнокровие, часто сочетающееся с отеком. Могут наблюдаться признаки интерстициальная пневмонии или катаральной, катарально-гнойной бронхопневмонии. Кроме того, легкие у плодов находятся в состоянии фетально-тотального ателектаза.

В желудке и тонком отделе кишечника обнаруживается серозно-слизистый катар. Слизистая толстого отдела кишечника, в особенности ободочной кишки, чаще у плодов, в состоянии водянисто-студневидного отека. У отдельных плодов просвет толстых кишок заполнен красно-бурой массой студневидной консистенции. Печень в состоянии венозной гиперемии, под капсулой обнаруживаются белесовато-сероватые участки размером 1´1,5 см., не имеющие четко выраженных границ. В почках под капсулой видны точечные кровоизлияния, в мозговом слое на разрезе выражен венозный застой. Развивается зернистая, жировая дистрофия почек, печени и миокарда.

У 8 - 40-дневных поросят или убитых вначале заболевания наиболее сильно выраженные изменения обнаруживаются в сердце: на эпикарде, иногда на внутренней поверхности перикарда видны серо-желтые наложения фибрина. Одновременно может развиваться серозно-фибринозный перитонит.

У свиноматок, убитых в первые сутки после родов или аборта, слизистая оболочка рогов матки отечна и гиперемирована, шейка матки и влагалище местами геморрагически инфильтрированы. Наблюдается катарально-гнойный эндометрит, цервицит и вагинит. В регионарных лимфоузлах серозный лимфаденит. На плаценте возможны кровоизлияния и некрозы.

У хряков наблюдается увеличение семенников и надсеменниковых лимфоузлов в 1,5 - 2 раза, семяпроводы геморрагически воспалены. В предстательной железе, слизистой уретры и возле головки полового члена - кровоизлияния.

При гистологическом исследовании обнаруживают элементарные тель-ца и цитоплазматические включения в различных органах и тканях.

6. Лабораторная диагностика

Диагностика хламидиоза базируется на проведении комплексных исследований и наблюдений. При постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, клиническую, патологоанатомическую картину, результаты гистологических исследований. Решающее значение имеет лабораторная диагностика болезни.

Диагностика хламидиоза включает:

1. Микроскопический метод - обнаружение хламидий в исследуемом материале с помощью световой и люминесцентной микроскопии (флуорохромирование), а также иммунофлуоресценцией);
2. Метод выделения и культивирования хламидий на куриных эмбрионах, культуре клеток, в организме восприимчивых животных с последующей идентификацией возбудителя;
3. Серологический метод - выявление нарастание титра антител в парных пробах сыворотки больных или переболевших животных в: РСК (реакция связывания комплемента), РДСК (реакция длительного связывания комплемента), РНСК (реакция непрямого связывания комплемента), РНГА (реакция непрямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ);
4. Молекулярно-генетический метод идентификации хламидий - ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Диагностика микроскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами проводится согласно инструкциям по применению соответствующих диагностикумов и тест-систем.

Материал для исследования.

От подозрительных по заболеванию и абортировавших животных берут кровь дважды: первый раз в период клинического проявления болезни, второй - спустя 14 - 21 день после первого взятия с целью получения сыворотки. Сыворотку крови получают по общепринятой методике, и в количестве 1 - 2 мл направляют в лабораторию, где её хранят при - 20°С. Сыворотку полученную от первого и второго взятия крови, исследуют одномоментно. Гемолизированная, проросшая сыворотка исследованию не подлежит.

От абортировавших свиноматок направляют в лабораторию кусочки плаценты, влагалищную слизь. Абортированные плоды можно отсылать целиком или же их паренхиматозные органы и желудок.

От павших или вынужденно убитых свиней посылают кусочки паренхиматозных органов, семенников, головной мозг, пораженные суставы. Материал для исследования отбирают не позднее 2 часов после гибели, аборта или вынужденного убоя свиней.

Пробы эякулята или сперму в количестве 1 мл доставляют в лабораторию в пробирках с сухим льдом или в контейнере с жидким азотом.

Доставку исследуемого материала в лабораторию осуществляют с соблюдением правил, исключающих распространение возбудителя болезни.

Микроскопический метод

Световая микроскопия. Из исследуемого материала готовят препараты-отпечатки или препараты-мазки. Препараты окрашивают по Стемпу, Маккиавелло, Романовскому-Гимзе, по Маккиавелло в модификации Здродовского, по модифицированному методу Гименеж (см. приложение 1). В препаратах хламидии, располагаются отдельно или скоплениями внутри и вне клеток. При окраске по Стемпу хламидии ярко-красные, цитоплазма клеток бледно-зеленая, ядра клеток окрашены в бледно-зеленый цвет несколько интенсивнее, чем цитоплазма. При окраске по Маккиавелло хламидии приобретают рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток - светло-синяя, ядра - темно-синие, а по Романовскому-Гимзе - возбудитель хламидиоза окрашивается в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма клеток фиолетово-голубая, ядра сине-фиолетовые.

Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 - 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 - 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 - 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 - 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, прикрепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют ярко-зеленым светом, их промежуточные формы - от соломенно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших свиней (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабатывают смесью в равных объемах, состоящей из флуоресцирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обрабатывают только меченой флуоресцирующей хламидийной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) -6,8 г NаС1, 0,63 г КН2РО4 и 1,48 г Nа2НРО4 последовательно растворяют в 1 л дистиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глицерина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем доводят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материала, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксируют ацетоном на холоде в течение 5-10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения неспецифической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1: 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные антитела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Тщательно промывают ФСБР три раза по 5-10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую меченые ФИТЦ антитела против глобулинов того вида животного, с использованием которого получена первая иммунная сыворотка) сыворотку и выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере на 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, которое прикрепляют расплавленным парафином. Исследуют под люминесцентным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зеленым изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смысле, что каждый раз дополнительно необходимо определять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим альбумином, оранжевый, хламидийные структуры - изумрудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки - после обработки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидийной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации - после инкубации со специфическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна давать заметного окрашивания хламидийного антигена;

третий - нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммунной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый - в контрольных препаратах, приготовленных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресцирующая хламидийная антисыворотка не должна окрашивать цитоплазму клеток.

Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл и стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37°С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% сузпензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторокального заражения морских свинок. Наиболее приемлимым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перививаемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят метериалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4°С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

.контроль монослоя в норме;

.контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

.контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Серологический метод

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших свиноматок (нарастание титра в 2 и более раз). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах - показатель инфицированности животных.

Постановку РДСК осуществляют согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.04 1986 г. Для постановки РСК Российский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности выпускает «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

В Республике Беларусь разработаны «Методические указания по постановке реакции непрямого связывания комплемента при серологической диагностике хламидийных инфекций у животных» (Фомченко И.В., Максимович В.В., Тюликов С.И.).

Методические рекомендации по постановке реакции непрямого связывания комплемента в серологической диагностике хламидийных инфекций у животных.

.Сущность РНСК заключается в том, что неполные (блокирующие) антитела, содержащиеся в сыворотке крови больных или переболевших животных образуют комплекс антиген-антитело, не связывая комплемент, поэтому они не могут быть обнаружены методом РДСК. Для выявления таких антител в реакцию вводят дополнительный компонент в виде позитивной сыворотки, содержащей полные антитела против возбудителя хламидийной инфекции (условно-индикторная сыворотка). При наличии в испытуемой сыворотке неполных антител их взаимодействие с антигеном происходит без участия комплемента, который оставшись свободным обеспечивает гемолиз эритроцитов в гемолитической системе (реакция положительная). Если испытуемая сыворотка не содержит неполные антитела, то антиген соединяется с антителами введённой позитивной (индикаторной) сыворотки, образуя комплекс антиген-антитело-комплемент, в результате гемолиз эритроцитов не произойдёт (реакция отрицательная).

.В РНСК используют следующие компоненты: комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген, контрольный антиген, позитивную (иммунную) сыворотку крови содержащую группоспецифические хламидийные антитела, негативную (отрицательную) сыворотку крови, комплемент (свежая консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки), гемолизин, эритроциты барана, испытуемые сыворотки, физиологический раствор. Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах. Антиген применяют в РНСК и РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

3.Гемолизин в РНСК используют в удвоенном титре.

.Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 минут до полной прозрачности надосадочной жидкости. Для РНСК применяют 2,5%-ную взвесь эритроцитов из осадка.

5.Приготовление гемолитической системы. Перед работой смешивают одну часть 2,5%-ной взвеси эритроцитов и одну часть гемолитической сыворотки в удвоенном титре. Полученную гемолитическую систему ставят в водяную баню (термостат) при 37°С на 30 минут для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4°С.

6.Для серологического исследования пригодны свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и замороженные (однократно). Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

.Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

.Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке и готовят основное разведение 1:20. Каждую сыворотку, разведённую 1:5 (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора) и инактивированную при 58-60°С 30 минут, разливают по 0,2 мл в два ряда пробирок штатива Флоринского.

Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом по 0,02 мл. Добавляют в каждую пробирку недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора. В первые ряды пробирок с позитивной, негативной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении по 0,2 мл и по 0,2 мл физиологического раствора, а во вторые ряды по 0,4 мл физиологического раствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 минут при 37-38°С. Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 мл, встряхивают и ставят в водяную баню на 30 минут при 37-38°С.

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с негативной и испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и с позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без антигена). В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 мл, что и будет являться его рабочей дозой.

Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические (к данному антигену) антитела. И в таком случае рабочую дозу комплемента определяют по негативной сыворотке и безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента, необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:

Х=АхВ/С,

где А - рабочая доза комплемента, В - количество пробирок, занятых в реакции, С - основное разведение комплемента.

Пример: 0,1х100/20=0,5. Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2х100), поэтому к 0,5 мл чистого комплемента следует добавить 19,5 мл физиологического раствора.

.Главный опыт РНСК. Сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, 1:5 с контрольным антигеном и без антигена. Реакция протекает в три этапа. На первом этапе инкубируют испытуемые сыворотки со специфическим антигеном в дозах по 0,2 мл в течение 60 мин при 37-38°С. На втором этапе в реакцию вводят дополнительно позитивную (индикаторную) сыворотку, разведенную физиологическим раствором до предельного титра, по 0,2 мл, и одновременно во все пробирки разливают комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении согласно результату титрования его. Смесь (испытуемая сыворотка, антиген, позитивная индикаторная сыворотка и комплемент) инкубируют в течение 60 мин при температуре 37-38°С. На третьем этапе добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и реакцию выдерживают 30 мин в водяной бане при 37-38°С.

10.Контроли главного опыта РНСК. Контроли негативной и позитивной сывороток для каждой реакции ставят в двух вариантах: в одном варианте на втором этапе добавляют во все пробирки 0,2 мл индикаторной сыворотки, а во втором - 0,2 мл физиологического раствора. Контроли антигена и гемолитической сыворотки ставят с добавлением во все пробирки 0,2 мл физиологического раствора.

.Учёт реакции.

Таблица 1. Процент гемолиза.

КомпонентыНомера пробирок123456789Гемолизированая жидкость, мл0,10,20,30,40,50,60,70,80,9Физиологический раствор, мл0,90,80,70,60,50,40,30,20,1Процент гемолиза102030405060708090

Из реакции выбирают пять пробирок, где произошёл 100%-ный гемолиз эритроцитов, их содержимое сливают в одну пробирку. Из её готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по схеме (см. таблицу 1) и готовят перед учётом реакции.

+ + + + - гемолиз эритроцитов 0-10%

+ + + - гемолиз эритроцитов 10-40%

+ + - гемолиз эритроцитов 40-70%

+ - гемолиз эритроцитов 70-90%

- гемолиз эритроцитов 90-100%

Учёт реакции РНСК проводят визуально дважды: первый раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (3-4 часа после бани).

Оценка результатов по проценту гемолиза:

Положительная - от двух крестов до полного гемолиза в разведении 1:10.

Сомнительная - в разведении 1:5 от трёх крестов до полного гемолиза эритроцитов, в разведении 1:10 на три креста.

Отрицательная - четыре креста в разведениях 1:5 и 1:10.

Дважды сомнительная считается положительной.

При выделении положительной сыворотки в реакции проводится раститровка её до предельного титра (см. положительный контроль).

В случае нарастания титра антител в парных пробах сыворотки в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с псоледующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Техника постановки ИФА

Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:

В состав набора входят:

специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный - 1 амп.;

специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

пероксидазный антивидовой конъюгат,, лиофилизированный -1 амп.;

Химический набор, в состав которого входят:

КН2 РО4 - 1 амп.;

К2НРО4 - 1 амп.;- 1амп.;

Твин - 20 (-40,-80, Тритон Х- 100) - 1 амп.;

Лимонная кислота - 1 амп.;

К2НРО4 - 1 амп.;

О- фенилендиамин 2 амп.;

гидроперит - 1 табл.;

две 96- луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;

стоп- раствор - 1 флакон.

Оборудование:

одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 см3 до 1 см3;

стеклянные пипетки на 1-2 см3;

промывающее устройство;

спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.

Приготовление рабочих растворов:

Буфер № 1 - ( 0,01М калий фосфатный, рН 7,2 - 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 см3 дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН корректируют 0,1 N КОН или НСI.

Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 см3 буфера №1 добавляют содержимое ампулы №8.

Буфер №3 - (фосфатно- цитратный) предназначен для приготовления субстрата (рН 5,0 - 5,2). Состоит из двух компонентов: А и Б.

А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 см3 раствора А добавить 25,7 см3 раствора Б и 50 см3 дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы №11 растворить в 2 см3 спирта-ректификата и добавить 48 см3 буфера №3, внести 0,8 см3 перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 см3 дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6° С не более 3 мес.

Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 см3 буфера №1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 см3 буфера №2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 см3 буфера №2 получая разведение 1:200.

Растворенный антиген , сыворотки , антивидовой конъюгат хранят при 4-6° С в течении 3-4 дней.

Разведение проб сыворотки крови.

Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером №2 в отдельных пробирках или микропанели.

Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

Сорбция антигена на микропанели.

Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.

Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1, вносят по 0,1 см3 специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D1, E1, F1 вносят по 0,1 см3 отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п.3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 см3 буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п.3.4.3. и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37°С в термостате в течении часа.

Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 см3 рабочего раствора иммуноферментного конъюгата подготовленного согласно п.3.4.2., и инкубируют в термостате при 37°С в течении 1 часа.

Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.

Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см3 субстратно-индикаторный раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 10 мкл стоп-раствора.

Учет результатов реакции.

Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).

Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствуют об отрицательной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

Молекулярно-генетический метод.

Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР в патологическом материале от животных.

Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.

ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.

В ПЦР используют следующие наборы:

набор для выделения ДНК (набор № 1);

набор для проведения ПЦР (набор № 2);

набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор № 3);

набор контрольных образцов (набор №4).

Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

лизирующий раствор -1 пробирка, 30 см3;

отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 см3;

концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 см3;

суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 см3;

буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 см3.

Набор.для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

смесь праймеров "Chla" -1 пробирка, 0,25 см3;

смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,25 см3;

5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 см3;

деионизованная вода -1 пробирка, 1 см3;

фермент Taq-полимераза -1 пробирка, 0,05 см3;

воск для ПЦР -1 пробирка, 1,0 см3;

масло минеральное -1 пробирка, 5,0 см3.

Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 см3;

агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.

Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:

ОКО (отрицательный контрольный образец) -1 пробирка, 1 см3;

положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК Chlamydia psittaci) - 1 пробирка, 0,1 см3.

Отбор материала для исследования. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

Для исследования используют:

паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг абортированных плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).

Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 см3, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см3 (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).

Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при минус 20 °С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.

Подготовка исследуемого материала

Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-точными дозаторами переменых объёмов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 см3 и 10,0 см3 (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.

Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 см3 центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 см3 жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 см3 материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости (или физиологическом растворе) и 100 мкл его используют для выделения ДНК.

Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3х3х3 мм3 помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 см3 физиологического -раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25°С в течение 20 мин, после чего 100 мкл верхней фазы используют для выделения ДНК.

Сперму в объеме 0,5 см3 разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 10000-12000 об/мин в течение 8-10 мин, осадок ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения ДНК.

Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 см3 физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000 об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1-2 см3 раствора 0,1М меркаптоэтанола, добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин и центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения.

Проведение ПЦР-анализа. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы, в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:

Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:

настольный бокс с бактерицидной лампой;

термостат для, пробирок типа "эппендорф" на 25-100 °С;

микроцентрифуга до 12000-16000 об/мин;

центрифуга/вортекс "Микроспин";

отдельный набор автоматических пипеток переменого объема от 0,001 см3 до 1 см3;

одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;

одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 см3 типа "эппендорф";

штативы для пробирок, наконечников;

отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;

холодильник на 2-8 °С с морозильной камерой.

Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2;

амплификатор;

ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;

отдельный халат и одноразовые перчатки;

отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 см3 до 1см3;

одноразовые наконечники в штативах;

одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 см3;

штативы для микропробирок на 0,5 см3;,

термостат для микропробирок с воском на 95 °С.

Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:

камера для горизонтального электрофореза;

источник постоянного тока на 150-200 В;

ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;

фотоаппарат для фотографирования гелей и, фотопленка;

бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;

аквадистиллятор;

отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;

отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;

мерный цилиндр на 1л;

колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;

электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.

Порядок работы.

ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.

Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в отдельном флаконе 20 см3 концентрата из набора, 80 см3 дистиллированной воды и 100 см3 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре 20-22 °С под плотна закрытой крышкой.

Проверяют состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии. После этого приступают к выделению ДНК.

В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 см3 вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы - элюи-рующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК Chlamydia (из набора №4), разведенная 1:10 элюирующим буфером. Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5-10 раз до полного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор. Прогревают пробирку 5 мин при 65 °С, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения материала. Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают. содержимое пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5-7 мин. Осаждают сорбент на "Микроспине" в течение 30 сек и отбирают супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости). Добавляют по 200 мкл отмывочного раствора №1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на "Микроспине" в течение 30 с и отбирают супернатант. Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до полного ресуепендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 30 с, отбирают супернатант. Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате при 65 °С, в течение 5-7 мин. Добавляют 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат при 65 °С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту. Осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение минуты. Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.

Подготовить положительный контрольный образец для ПЦР, для чего развести К+ ДНК в 100 раз в буфере для элюции ДНК и вместе с ДНК-пробами перенести в комнату для постановки ПЦР.

ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).

Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120 °С):

для амплификации ДНК Chlamydia: к 0,25 см3 праймеров "Chia" добавляют 0,25 см3 нуклеотидов, смешивают на вортексе;

Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Chia", Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают -пробирки в амплификаторе 5 мин при 95 °С и охлаждают. В таком виде, пробирки хранятся в морозильнике -несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.

Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 см3 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 см3 деионизованной воды и 0,05 см3 Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8 °С в течение месяца (не замораживать!). Выставляют ряд пробирок с "нижними" смесями ("Chia") в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода и ДНК Chlamydia, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней" смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по 10 мкл проб -испытуемых и контрольных и 10 мкл К+ ДНК, подготовленной для постановки ПЦР, т.е. разведенной 1:100 буфером для элюции. Для отрицательного контроля амплификации вместо ДНК-пробы добавляют 10 мкл деионизованной воды (из набора №2). .Набирают на амплификаторе нужную программу:

Амплификаторы с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения - не менее 1° С/сек:) "MiniCycler", "РТС-100" (MJ Re-search)Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): "GeneAmp PSR System 2400" (Рег-kin Elmer); "Omn-E (Hibaid); "Терцик" (ДНК-технология)95°С- пауза 95° С - 2мин 1 цикл 95 °С-45с 62°С-45с} 40циклов 72 °С - 45 с 10 °С -12-14 час (хранение)95° С - пауза 95°С - 2мин 1 цикл 95 °С-10 с 62 °С-10 с} 40циклов 72°С-10 с 10 °С -12-14 час (хранение)

Через 1-2 мин после запуска программы, (когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 °С), ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:- ЗОО п.н.

ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.

Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразнрй цепной реакции).

В мерный цилиндр наливают 25 см3 концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 см3, закрывают цилиндр парафинированной пленкой ("PARAFILM") и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 см3, наливают 100 см3 готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации последовательно в штатив. Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1 -2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.

Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).

Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300" или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других систем: Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).

Учет и интерпретация результатов. В дорожке соответствующей положительному контрольному образцу должна быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 300 п.н. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящеюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне 300 п.н.

В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу не должно быть каких-либо полос. Отрицательными считаются образцы, которые не содержат специфической полосы 300 п.н.

Кроме полосы 300 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).

При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.

Результаты анализа не учитываются, если:

в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов реакции.

в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.

в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

Идентификация хламидий

Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминисцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.

Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:

. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;

. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;

. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.

При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований:

выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;

световая микроскопия - от 30 минут до 2 часов;

люминесцентная микроскопия - до 3 часов;

выделение и идентификация хламидий - от 7 до 40 дней;

выявление ДНК хламидий - от 4 часов до 2 суток.

7. Дифференциальная диагностика

Хламидиоз свиней следует дифференцировать от бруцеллеза, лептоспироза, болезни Ауески, гемофилезного полисерозита и плевропневмонии, сальмонеллеза, листериоза, болезни Тешена, энтеровирусного гастроэнтерита, болезни СМЭДИ, классической чумы, парвовирусной инфекции, микотоксикозов, стрептококкоза, пастереллеза, стафилакоккоза.

Лептоспироз довольно часто протекает сверхостро и остро, что не характерно для хламидиоза. У поросят наблюдается рецидивирующая лихорадка, прогрессирующее исхудание, анемия, желтушность. Летальность достигает 50-70%. Для лептоспирозных абортов, помимо мумификации плодов характерны также наличие большого количества слабых нежизнеспособных поросят в опоросах, высокая смертность новорожденных, частые послеродовые осложнения у свиноматок. При вскрытии под кожей в большинстве случаев обнаруживают желтушное окрашивание тканей и множественные кровоизлияния. Обширные геморрагии также видны на серозных и слизистых оболочках. Особенно характерны изменения в почках: они увеличены, бугрстые, на разрезе и под капсулой множественные кровоизлияноия. В гистосрезах из почек и печени при специальных методах окраски обнаруживают лептоспир. Обработка свиноматок ударными дозами стрептомицина при лептоспирозе дает положительный эффект, в то время как при хламидиозе она является совершенно безрезультатной, так как эти микрорганизмы к стрептомицину не чувствительны. Следует иметь в виду, что лептоспироз нередко протекает одновременно с хламидиозом как смешанная инфекция, поэтому при появлении у свиноматок абортов и мертворождений параллельно проводят лабораторные исследования, направленные на исключение обоих заболеваний.

Болезнь Ауески можно легко отличить от хламидиоза путем постановки биопробы: специально обработанный сузпензией из внутренних органов и мозга подкожно заражают кроликов, собак, кошек. При наличии в материале вируса развивается типичная картина болезни Ауески, для которой особенно характерным является сильный зуд, возникающий в месте инъекции материала. Животные погибают через 4-8 часов после появления клинических признаков. Биопроба, поставленная таким способом, при хламидиозе отрицательна. При вскрытии обращают внимание на выраженный отёк легких, цвет которых при болезни Ауески обычно темно-красный. В верхушечных и диафрагмальных долях обнаруживают очаги серозно-катарального воспаления, которые уплотнены, пропитаны серозным экссудатом, окрашены в серый или серовато-коричневый цвет. Имеет место интралобулярной тип интерстициальной пневмонии с вовлечением в процесс перибронхиальной и околососудистой соединительной ткани. Менее типичны милиарные и субмилиарные некробиотические фокусы, разбросанные по всей паренхиме легких.

Гемофилезный полисерозит и гемофилезную плевропневмонию свиней отличить от хламидиоза трудно. Во всех случаях плевропневмонии свиней при патологоанатомическом исследовании легких обнаруживается фиброзный плеврит. В диафрагмальных и верхушечных долях находятся большие некротические зоны, окруженные разрастающейся соединительной тканью. При гистологическом исследовании в легких выявляется хроническая плевропневмония с разграниченными и изолированными некротическими зонами. Иногда наблюдается тромбоз. У некоторых поросят возможно развитие фибринозного перикардита. Обязательно проводить бактериологическое исследование с использованием баккормилки.

Бруцеллез. При этом заболевании аборты у свиней наблюдаются, как в первой, так и во второй половине супоросности. Для абортов характерно гиперимия кожных покровов с точечными кровоизлияниями и значительное увеличение селезенки у абортированных плодов. При бруцеллезе наряду с артритами и бурситами под кожей и в мышщах туловища формируются абсцессы, чего никогда не бывает при хламидиозе. Бруцеллезные орхиты и эпидидимиты склонны к гнойному развитию, что также не характерно для хламидиоза. Надежный дифференциальный диагноз обоих заболеваний возможен только на основе бактериологических, серологических исследований и постановки биопробы.

Сальмонеллез отличается от хламидиоза тем, что у свиноматок аборты не бывают массовыми и чаще носят спорадический характер. Основной клинический признак у подсвинков при сальмонеллезе - постоянный понос с выделением водянистых с гнилостным запахом испражнений. При хламидиозе гастроэнтерит скоро проходящий с доброкачественным течением, бывает в основном у поросят-сосунов, тогда как сальмонеллез поражает преимущественно подсвинков в возрасте 2-4 месяца. Окончательное подтверждение или исключение сальмонеллеза возможно только на основании бактериологических исследований.

Листериоз. При листериозе отмечаются признаки поражения центральной нервной системы в виде парезов, параличей манежных движений, судорог, возбуждения, сменяющегося угнетением. При хламидиозе подобные признаки возможны, но они наблюдаются только в отдельных случаях. При вскрытии трупов животных, погибших от листериоза, обычно не отмечают серозно-фибринозных воспалительных процессов в брюшной и грудной полостях, характерных для хламидиоза. В головном мозгу при данном заболевании наблюдается гнойный энцефаломиелит. Точный диагноз на листериоз ставят на основании бактериологических, серологических исследований и биопробы, в процессе проведения которой различными способами заражают белых мышей, морских свинок, кроликов. После гибели лабораторных животных обнаруживают множественные некротические очажки во внутренних органах, из которых можно выделить чистую культуру возбудителя.

Болезнь Тешена характеризуется признаками поражения центральной нервной системы: повышенной чувствительностью кожи и слизистых оболочек, судорожными сокращениями мышц, возбуждением, шаткой походкой, парезами конечностей, переходящими в параличи. Признаки поражения нервной системы при хламидиозе не имеют такой выраженности и остроты, расстройства относительно быстро нормализуются, свиньи не погибают. Кроме того, болезнь Тешена поражает в основном поросят 2-10 месячного возраста, поросята-сосуны от 3-недельного до 2-месячного возраста почти не болеют, тогда как при хламидиозе в первую очередь поражаются новорожденные животные.

Вирусный трансмиссивный гастроэнтерит характеризуется диареей, жаждой, рвотой, иногда признаками поражения центральной нервной системы. Погибает около 10% заболевших поросят, остальные медленно выздоравливают. В большинстве случаев данное заболевание не регистрируется у поросят до трехнедельного возраста, тогда как хламидиозный энтерит появляется у новорожденных с первых дней жизни. При подозрении на энтеровирусную инфекцию проводят вирусологические исследования, предусматривающие выделение энтеровирусов из патологического материала с помощью первичных культур клеток почек свиней, тестикул поросят, перививаемой клеточной линии СПЭВ.

Эпидемическая диарея поросят клинически похожа на вирусный трансмиссивный гастроэнтерит, за исключением медленного распространения и невысокой смертности новорожденных поросят. Дифференцируют от хламидиоза на основании проведенных лабораторных исследований.

Синдром «голубой глаз» свиней проявляется кератоконъюнктивитами с голубой окраской роговицы, нарушением нервной системы, снижением репродуктивности, высокой гибелью поросят. Дифференцируют от хламидиоза на основании гистологических, вирусологических исследований.

Грипп свиней характеризуется поражением органов дыхания. Ведущий патоморфологический синдром инфекции является развитие множественных очагов некроза бронхиального эпителия, что не наблюдается при хламидиозе.

Классическая чума свиней при острой форме которой наблюдается рвота, запоры, сменяющими диареей, судорги и парезы конечностей, кровоизлияния в коже, гнойный конъюнктивит и высокая летальность (до 80-100%). При атипичной форме чумы, вызванной слабо вирулентными штаммами вируса, в первую очередь поражаются супоросные свиноматки и новорожденные поросята. Происходят аборты, плоды мумифицированы, снижается воспроизводство, уменьшается количество поросят в пометах. В таких случаях чуму исключают только лабораторными методами и постановкой специальной биопробы на поросятах. Принимают во внимание характерную для чумы лейкопению.

Парвовирусная инфекция характеризуется ранней эмбриональной смертностью и рассасыванием эмбрионов, наступающих в том случае, если свиноматки заражаются до 30-го дня супоросности. При этомнаблюдают необычно большое количество свинок-первоопоросок и племенных, неоднократно приходящих в охоту через 21-23 дня после осеменения. Если заражение произошло после 30-го дня супоросности, плоды могут родиться мертвыми или мумифицированными. При хламидиозе абортированные или мертворожденные плоды обычно не имеют признаков мумификации, отличаются определенной степенью отечностью. В связи с возможной длительной персистенцией парвовируса в организме свиней без индукции видимой патологии клинические признаки при парвовирусной инфекции не выражены, чем она отличается от других болезней. Окончательно парвовирусная инфекция может быть подтвержден специальными методами.

Респираторно-репродуктивный синдром свиней заболевают главным образом свиноматки у которых наблюдаются аборты на 100-120 день, наличие мертворожденных поросят, преждевременными опоросами или задержкой опороса, респираторными нарушениями у поросят и хряков, появлением окрашивания кожи ушей и других органов. Дифференцируют от хламидиоза на основании гистологических, вирусологических исследований.

Болезнь СМЭДИ характеризуется рождением мертвых или нежизнеспособных поросят, мумификацией плодов, гибелью, рассасыванием эмбрионов и бесплодием самок. При хламидиозе обычно не наблюдаются раннее поражение эмбрионов, их гибель и рассасывание, абортированные плоды, как правило, не мумифицированы, а рыхлые за счет отека кожи и подкожной клетчатки.

Микотоксикозы свиней отмечаются у свиноматок следующими клиническими признаками: угнетенное состояние, отсутствие аппетита, жажда, рвота, болезненность в области живота, усиление перистальтика, понос, затрудненное дыхание, появление некрозов на коже и в ротовой полости, снижение молокоотдачи или ее прекращение. Под действием токсина свиноматки могут рождать уродливых поросят, у некоторых свиноматок возможны аборты. У погибших животных отмечаются язвенно-некротический стоматит, атрофию яичников, печень окрашивается в цвет желчи, геморрагический энтерит иногда с отторжением слизистой. Макроскопически в паренхиматозных органах плодов видны характерные полосчатые или неправильной формы крупные и мелкие кровоизлияния. При гистологическом исследовании находят характерные дистрофические изменения в паренхиматозных органах и особенно эозинофилию, активизацию эндотелия капилляров, а также множественные кровоизлияния. При хламидиозе данные признаки не характерны. Микотоксикозы исключают путем тщательного анализа рационов с обязательным проведением микологических исследований кормов.

Стрептококкоз. У поросят появляется лихорадка, паралич, отеки, болезненность в суставах. При вскрытии обнаруживают фибринозный периартрит, множество абсцессов в суставах, под кожей , во внутренних органах с густым слизисто-гнойным экссудатом. Количество синовиальной жидкости увеличено. Диагноз подтверждается выделением стрептококка из абсцессов. При вскрытии свиноматок при стрептококкозе диагностируется метрит со скоплением жидкости в яйцеводах, а также негнойный полиартрит. Единственное заметное изменение у абортированных плодов - увеличение почек, при микроскопическом которых были видны геморрагии. Хламидиозный аборт отличается от стрептококкового отсутствием непосредственного поражения эндометриума по гнойному типу, макроскопически нормальной величиной почек у абортированных плодов, отсутствием у свиноматок полиартритов.

Рожа свиней появляется у подсвинков примерно с трехмесячного возраста, поражая при этом все конечности. При хламидиозе чаще поражаются крупные суставы, в основном у поросят-сосунов.

Стафилококкоз протекает в виде экссудативного эпидермита, характеризуется появлением желто-коричневых корочек на эритрематозном фоне вентральной поверхности тела и голове. При злокачественном течении в начале болезни отмечают лихорадку, диффузный дерматит, затем появляется экссудация на всей поверхности тела. Спустя 4-8 дней животные могут погибнуть. При доброкачественном течении появляется сыпь, затем обрауются оспинки диаметром 1-3 мм. красного цвета, заполненные серозным или серозно-гнойным секретом. Хламидиозный дерматит отличается мягким доброкачественным течением, обычно при этом отсутствует экссудация, в зоне очагов не наблюдается покраснение кожи.

Пастереллез характеризуется при вскрытии многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках, в коже. Легкие в состоянии отека. В грудной и брюшной полости - геморрагический экссудат с примесью фибрина, лимфатические узлы увеличены за счет отека. Дифференцируют от хламидиоза на основании бактериологических, серологических исследований и проведение биопробы.

Авитаминозы, особенно связанные с недостатком в кормах витамина А, сопровождается расстройствами деятельности нервной системы, отсутствием аппетита, гастроэнтеритами, нарастающей потерей зрения вплоть до слепоты. У свиноматок возможно аборты, рождение мертвых и нежизнеспособных поросят, зачастую с аномалиями развития глаз. При хламидиозе обычно отсутствуют изменения со стороны органов зрения, у свиноматок не наблюдаются расстройства нервной системы. Авитаминозы подтверждают после тщательного анализа используемых кормов, проведения бактериологических и вирусологических исследований для исключения хламидиоза.

Эмбриональную смертность могут вызвать также факторы, связанные с нарушением кормления и содержания. При этом следует обращать внимание на две основные группы, неблагоприятно воздействующие на животный организм: стресс, возникающий в результате страха, комплектования больших групп животных на недостаточной площади, нарушение параметров микроклимата одиночного содержания; кормление - недостаток кормов или низкое содержание в них белка и витаминов; наличие в них вредных веществ, таких как фитоэстрогены в легуминозе (белок гороха), лектины, гемагглютинины, сапонины, кислые фосфотазы, фенол, сульфаты, полихлорированный бифенил.

Приложение

хламидиоз свинья инфекционная болезнь

Окраска по методу Романовского - Гимза.

Маточный раствор краски Романовского - Гимза разбавляют фосфатно-буферным раствором (рН 7,2), для получения которого готовят: раствор А - 9,5 г двузамещенного Na2 HРО4 растворяют в 1 л дистиллированной воды; раствор Б - 9,2 г однозамещенного NaН2РО4 растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для приготовления буферного раствора с рН 7,2 смешивают 72 мл раствора А с 28 мл раствора Б и добавляют 900 мл дистиллированной воды. На каждый миллилитр буферного раствора вносят 2-4 капли маточного раствора краски. Фиксированные мазки окрашивают в специальных кюветах вертикально при комнатной температуре в течение 20-24 ч, промывают дистиллированной водой и дифференцируют около 10 с подкисленным эталоном (3-5 капель ледяной уксусной кислоты на 15-20 мл спирта), вновь промывают, высушивают и исследуют в световом микроскопе.

Элементарные тельца хламидий красно-фиолетовые, промежуточной формы - сине-фиолетового цвета.

Для выявления хламидий, расположенных внутри клеток, используют модифицированный метод Романовского - Гимза. Фиксированные мазки покрывают маточным раствором красителя на 10 мин. Краску не сливают, добавляют 3-5 капель дистиллированной воды (рН 7,0) и окрашивают при комнатной температуре 16- 18 ч. После промывки дистиллированной водой дифференцируют этанолом 45-60 с, вновь промывают дистиллированной водой и повторно дифференцируют этанолом 30 с. Промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе.

Элементарные тельца хламидий, расположенные в цитоплазме клеток, красно-фиолетового цвета, тельца-включения - сине-фиолетовые.

Окраска по модифицированному методу Гименеж (Набли Б., Таризо М., 1967). Мазки готовят из стенок желточных мешков куриных эмбрионов, в которых культивировали хламидий, затем фиксируют над пламенем. Препараты окрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 5 мин, промывают водой, окрашивают 0,8%-ным водным раствором малахитового зеленого 30 с и промывают водой. Затем обесцвечивают 0,5%-ным раствором лимонной кислоты в течение 2 мин, промывают и повторно окрашивают малахитовым зеленым 30 с. Обесцвечивают 1%-ным раствором хлорангид-рида в течение 1 мин, промывают водой, высушивают. Элементарные тельца и тельца-включения хламидий - красного цвета, фон зеленый.

Окраска по модифицированному методу Стемпа. Препараты фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным дистиллированной водой 1:5 (рH - 7,4) в течение 15 минут. Маточный раствор готовят по прописи: 1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, 5 г карболовой кислоты (фенола) - в 100 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают, фильтруют через 4-5 слоев фильтровальной бумаги. Хранится продолжительное время. Перед употреблением нужное количество разводят 1:5.

Препараты промывают дистиллированной водой, дифференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты или 0,05%-ным раствором серной кислоты в течение 1 мин (модификация Гаффарова X. 3.), промывают водой, окрашивают 1%-ным раствором малахитовой зелени 30 с, снова промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

Элементарные тельца хламидий красные на сине-зеленом фоне. Инициальные тельца в одних случаях окрашиваются в красный, в других - в зеленоватый цвет. Метод рекомендуется для исследования патологическом материала, в частности плаценты.

Окраска по Маккиавелло. Готовят три раствора: раствор А - 250 мг фуксина основного растворяют в 100 мл бидистиллированной воды (хранится 10 дней при температуре 4°С); раствор В - 10 г лимонной кислоты растворяют в 100 мл бидистиллированной воды; раствор С - 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл бидистиллированной воды.

Техника окраски: мазки фиксируют над пламенем; раствор А фильтруют через фильтровальную бумагу и наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, на 5-10 мин; промывают дистиллированной водой; дифференцируют в растворе В, состоящем из 5 мл раствора В и 100 мл бидистиллированной воды, в течение 20-30 с; промывают водопроводной водой; докрашивают раствором С в течение 30 с; промывают водой, высушивают на воздухе. Хламидий окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патологического материала - в светло-синий, ядра клеток - в темно-синий цвет.

Окраска по Маккиавелло в модификации Здродовского. Готовят три раствора: раствор А (сохраняется в холодильнике в течение нескольких дней) - основной фуксин - 1 г, карболовая кислота - 5 г, этиловый спирт - 10 мл, дистиллированная вода - 100 мл; раствор Б - 0,5%-ный водный раствор метиленовой сини; раствор В - 0,5%-ный раствор лимонной или 0,15%-ный раствор уксусной кислоты.

Техника окраски. Препараты быстро фиксируют над пламенем и покрывают на 5 мин свежеприготовленной смесью: раствор А - 10-25 капель, бидистиллированной воды или фосфатный буфер (рН 7,4) - 10 мл; промывают дистиллированной водой; около 3 с дифференцируют в растворе В; промывают продолжительно дистиллированной водой; быстро окрашивают (10 с) раствором Б; промывают проточной водой, высушивают, исследуют с использованием иммерсионных систем. Хламидий рубиново-красного цвета на светло-голубом фоне. Метод дает хорошие результаты только при окрашивании свежих препаратов.

Окраска акридиновым оранжевым для люминесцентной микроскопии. Готовят жидкость Корнуа - шесть объемов 96-100%-ного этилового спирта, три объема хлороформа, один объем ледяной уксусной кислоты. Фосфатно-цитратный буфер (рН 3,8): лимонная кислота - 10 г, Nа2НРО4-7Н2О - 15 г, дистиллированная вода - 1 л. При наличии Nа2НРО4- 12Н2О проводят перерасчет:а2НРО4´7Н2О НЬ 268,157а2НР04´12Н20 НЬ 358,157

г - 268,157 Х = 15 ´ 358,157/268,157 = 20,034

х - 358,157

Маточный раствор акридинового оранжевого: акридиновый оранжевый - 0,1 г, фосфатно-цитратный буфер - 100 мл (может храниться в холодильнике). Рабочий раствор акридинового оранжевого готовят в концентрации 1: 10 тыс. - 1: 30 тыс. на основе указанного буфера.