Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)
Федеральное
агентство по образованию
Государственное
образовательное учреждение
Высшего
профессионального образования
"Владимирский
государственный университет"
Кафедра
биологии
РЕАКЦИЯ
СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
(РДСК)
Выполнил: ст. гр. Б-105
Отт О.В.
Соколова А.Н.
Проверил: Ручнова О.И.
Владимир
2009
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК,
реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу
(О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич.
реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать
свободный комплемент.
Комплемент (система комплемента) (от
лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови
животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При
попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов
или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация
комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а
токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают
наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.
Эту реакцию широко применяют при
идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний,
вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.
РСК - сложная серологическая
реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По
существу, это две серологические реакции.
Первая система - основная состоит из
антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное
количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они
соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не
виден.
связывание комплемент реакция
серодиагностика
Об образовании этого комплекса
узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят
эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка
(антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов
может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой
системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе
гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза
(содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как
положительный результат РСК.
Компоненты реакции связывания
комплемента:
. Антиген - обычно лизат, экстракт,
гаптен; реже взвесь микроорганизмов
. Антитело - сыворотка больного
. Комплемент - сыворотка морских
свинок
. Антиген - эритроциты барана
Гемолитическая система
. Антитело - гемолизин к эритроцитам
барана
. Изотонический раствор
Подготовка ингредиентов
. Сыворотку разводят в 3 раза меньше
ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого
определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на
число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости
необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на
стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси
эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и
инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).
. Эритроциты барана. Готовят 3%
взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для
приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают
равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.
. Комплемент обычно разводят 1: 10.
Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его
наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе
происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.
. Антиген обычно получают готовым с
указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена
должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл
изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине
титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для
всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.
. Антитело - сыворотка больного.
Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней
комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в
инактиваторе с терморегулятором. Последний
способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева
Постановка реакции связывания
комплемента (РСК).
Реакцию ставят в объеме 1 куб. см
(по 0,2 куб. см каждого компонента).
Испытуемые сыворотки исследуют в
разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со
специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на
специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).
Испытуемые и контрольные сыворотки
инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в
зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).
Оба этапа реакции проводят в водяной
бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап
реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.
позитивная сыворотка в разведении 1:
5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со
специфическим антигеном;
негативная сыворотка в разведениях
1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным
антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе
- на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);
гемолитическая система на
гемотоксичность (комплемент).
Учет результатов. В контролях не
должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в
другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов
реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).
В опыте активность комплемента может
снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции,
поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром
дозу. Это - рабочая доза.
Существуют различные варианты
постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов,
реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств.
РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для
диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.
Постановка реакции длительного связывания
комплемента (РДСК).
Первую фазу реакции проводят в
холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин
при 37-38°С.
Комплемент применяют в рабочем
разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).
В первый день разливают сыворотки и
антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см
каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.
Затем во все пробирки главного опыта
и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости
от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на
16-18 час. при 2-6°С.
На следующий день штативы с первой
фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при
комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе
(в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную
баню на 20 мин. при 37-38°С.
Схема главного опыта РДСК
представлена в таблице 3.
Учет результатов РСК, РДСК проводят
дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания
эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на
следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.
Для объективного определения
результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для
этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из
них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза
так называемую "Стандартную " шкалу.
Степень гемолиза в пробирках с
исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в
"стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.
Степень задержки обратно
пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:
++++ (4 креста) - отсутствие
гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;
+++ (3 креста) - гемолиз 25 %
эритроцитов;
+ (1 крест) - гемолиз 75%
эритроцитов;
(минус) - полный гемолиз
эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Оценка результатов РСК, РДСК.
Оценивают испытуемые сыворотки в
разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе
эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.
Положительной оценивают реакцию при
задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.
Сомнительной - при задержке гемолиза
эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в
разведении 1: 5.
Отрицательной - при полном гемолизе
эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.