Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Введение.

  Бурное развитие жидкостной хроматографии в последние 10 лет обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.

  Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование сорбентов с размером зерен 3—10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения.

   В настоящее время ВЭЖХ по темпам развития вышла на первое место среди инструментальных методов, обогнав даже газовую хроматографию. Важнейшее преимущество ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией — возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе.

Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют в самых  различных областях науки и техники.  Особенно    велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений    окружающей    среды,а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.

поскольку необходимо учитывать целый ряд весьма специфических тре­бований, обусловленных следующими особенностями мето­дики.

а.  Колонки для  ВЭЖХ  наполняют  носителем  с очень  ма­лым диаметром частиц. В результате при таких объемных ско­ростях растворителя, которые необходимы для быстрого разде­ления пробы, на колонке создается высокое давление.

б.  Детекторы,    применяемые    в    ВЭЖХ,    чувствительны  к флуктуации потока  и давления элюента   (шумы).  Более того, при  применении    концентрационных    детекторов     необходима еще более высокая  стабильность объемной  скорости  элюента.

в.  Процесс хроматографического  разделения  сопровождает­ся рядом антагонистических эффектов, так, например, диспер­гирование образца в подвижной фазе ведет к смешению раз­деляемых компонентов и снижает максимальную концентрацию вещества  в элюируемом пике   (в детекторе). Диспергирование наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы до детектора.

г.  Растворители,  выполняющие  роль  подвижной  фазы,  ча­сто  способны  вызывать  коррозию  аппаратуры.  Это  в  первую очередь относится к растворителям, используемым в обращен-но-фазовой хроматографии, которая  предпочтительна  в биохи­мических приложениях ВЭЖХ.

Специфику ВЭЖХ как инструментальной методики необхо­димо учитывать в процессе разработки, создания и эксплуата­ции этих систем. Для создания коммерческих образцов хрома-тографических систем и их компонентов, достаточно надеж­ных, простых и безопасных в работе с приемлемым соотноше­нием между ценой и техническими характеристиками, потре­бовалось более десяти лет поисков и исследований. Наметив­шиеся в последнее время тенденции к уменьшению колонок (как длины, так и диаметра) заставляют предъявлять новые требования к инструментам.

1.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ

Хроматография — это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их меж­ду двумя' несмешивающимися фазами, одна из которых непо­движна, а другая подвижна. Компоненты образца движутся по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше срод­ство компонента к неподвижной фазе и чем меньше — к подвиж­ной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам достигается основная цель хроматографии — разделение за приемлемый промежуток вре­мени смеси на отдельные полосы (пики) компонентов по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой.

Из этих общих представлений ясно, что хроматографическое разделение возможно, только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во-первых, будут растворены в подвижной фазе и, во-вторых, будут взаимодейст­вовать (удерживаться) с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографи-ческом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействую­щие с неподвижной фазой, пройдут через колонку с подвижной фазой, не разделяясь на компоненты.

Примем условие, что какие-то два компонента растворимы в подвижной фазе и взаимодействуют с неподвижной фазой, т. е. хроиатографический процесс может протекать без наруше­ний. В этом случае после прохождения смеси через колонку можно получить хроматограммы вида а, б или в (рис. 1.1). Эти хроматограммы иллюстрируют хроматографические разделения, отличающиеся эффективностью (а и б) при равной селективно­сти и селективностью (б и в) при равной эффективности.

Эффективность колонки тем выше, чем уже пик получается при том же времени удерживания. Эффективность колонки изме­ряется числом теоретических тарелок  (ЧТТ) N: чем выше эф-

Рис. 1.2. Параметры хрома-тографического пика и рас­чет числа теоретических та­релок:

t_R — время удерживания пика; h — высота пика; Wj/j — шири­на пика на половине его высоты

Рис. 1.1. Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селектив­ности колонки:

а — обычная селективность, пониженная эффективность (меньше теоретических тарелок); б — обычные селективность и эффективность; в — обычная эффективность, повышенная селективность (больше отношение времен удерживания компонентов)

фективность, тем больше ЧТТ, тем меньше расширение пика первоначально узкой полосы по мере прохождения ее через ко­лонку, тем уже пик на выходе из колонки. ЧТТ характеризует число ступеней установления равновесия между подвижной и не­подвижной фазами.

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, и длину колонки L (мкм), а также средний диаметр зерна сор­бента d_c (мкм), легко получить значения высоты, эквивалент­ной теоретической тарелке (ВЭТТ), а также приведенной вы­соты, эквивалентной теоретической тарелке (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N

ПВЭТТ =B3TT/d_c.

Имея значения ЧТТ, ВЭТТ и ПВЭТТ, можно легко сравни­вать эффективность колонок разных типов, разной длины, за­полненных разными по природе и зернению сорбентами. Срав­нивая ЧТТ двух колонок одной длины, сравнивают их эффек­тивность. При сравнении ВЭТТ сравнивают колонки с сорбен­тами одинакового зернения, имеющими разную длину. Нако­нец, величина ПВЭТТ позволяет для двух любых колонок оце­нить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения коло­нок, во-вторых, независимо от длины колонок, зернения сорбен­тами его природы.

Селективность колонки играет большую роль в достижении хроматографического разделения.

Селективность колонки зависит от очень многих факторов, и искусство экспериментатора в большой мере определяется умением воздействовать на селективность разделения. Для это­го в руках хроматографиста находятся три очень важных фак­тора: выбор химической природы сорбента, выбор состава рас­творителя и его модификаторов и учет химической структуры и свойств разделяемых компонентов. Иногда заметное влияние на селективность оказывает изменение температуры колонки, меняющее коэффициенты распределения веществ между по­движной и неподвижной фазами.

При рассмотрении разделения двух компонентов на хрома­тограмме и его оценке важным параметром является разреше­ние R_s, которое связывает времена выхода и ширину пиков обо­их разделяемых компонентов

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пи­ков, увеличивается по мере возрастания селективности, отра­жаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пи­ков. Поэтому быстрый прогресс жидкостной хроматографии привел к изменению понятия «жидкостная хроматография вы­сокого давления» — оно было заменено на «жидкостную хрома­тографию высокого разрешения» (при этом сокращенная запись термина на английском языке сохранилась HPLC как наибо­лее правильно характеризующее направление развития совре­менной жидкостной хроматографии).

  Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эф­фективность повышается, когда используют более мелкий сор­бент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использова­нии более тонких слоев привитой фазы, менее вязких раствори­телей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке может происходить так­же и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соедини­тельных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детек­тор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устрой­ствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, ре­акторы-змеевики и др.)- Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте на­ходится мертвый объем: чем уже хроматографическая зова, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое вни­мание следует уделять конструированию той части хроматогра­фа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматогра­фах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обяза­тельно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается ис­кажение пика, резкое снижение эффективности, следует тща­тельно проинспектировать вновь введенные в систему капилля­ры и другие устройства.

Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструиро­ванные хроматографы пытаются использовать для высокоско­ростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединитель­ных капилляров с внутренним диаметром 0,05—0,15 мм мини­мальной длины, колонок вместимостью 10—1000 мкл, детекто­ров с микрокюветами емкостью 0,03—1 мкл и с высоким быстро­действием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.

1.2. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на ко­лонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k' должен быть больше 0, т. е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть и слишком большим, чтобы получить приемле­мое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбра­на неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень боль­шие k'. Этого добиваются, меняя элюирующую силу раствори­теля.

В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного рас­творителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увели­чивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изо­пропанола. Если содержащие полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более сла­бым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на дру­гие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том^ случае, если данная система не обеспечивает желаемой селек­тивности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропнЬе ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так же подбирают силу растворителя в случае ис­пользования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и ис­ключая опасные для фазы растворители (например и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу раствори­теля увеличивают, повышая содержание в элюенте органичес­кой составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и умень­шают, добавляя больше воды. Если не удается добиться же­лаемой селективности, используют другую органическую состав­ляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных доба­вок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях методом ионообменной хроматографии си­лу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентра­цию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и биологи­ческих смесей, зачастую не удается подобрать силу раствори­теля таким образом, чтобы все компоненты пробы элюирова-лись за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к гра­диентному элюированию, т. е. использовать растворитель, элюи-рующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонен­тов сложных смесей за относительно короткий промежуток вре­мени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.

1.3. РАЗМЕР ЧАСТИЦ СОРБЕНТА, ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Рассматривая размывание в колонке, мы указывали, что эффективность колонки (ВЭТТ) зависит от размера частиц •сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ за послед­ние 10—12 лет было обусловлено, во-первых, разработкой спо­собов получения сорбентов с размером частиц от 3 до 10 мкм и с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, ^разра­боткой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хро­матографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насо­сы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способ­ные регистрировать пики малого объема.

Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (ПВЭТТ), может составлять 2 независимо от того, использо­вали ли для упаковки частицы с размером 3, 5, 10 или 20 мкм. В этом случае мы получим соответственно колонки (при стан­дартной длине их 250 мм) эффективностью 41670, 25000, 12500 и 6250 т.т. Кажется естественным выбрать наиболее эффектив­ную колонку, заполненную частицами размером 3 мкм. Однако за эту эффективность придется заплатить использованием при работе очень высокого давления и относительно невысокой скоростью разделения, ^{так как} имеющийся насос, скорее всего, будет и^пособен* прокачивать через такую колонку растворитель с высокой объемной скоростью. Здесь мы как раз и сталкива­емся с вопросом о связи размера частиц сорбента, эффективно­сти и проницаемости колонок.

Если выразить отсюда фактор сопротивления колонки-—безраз­мерную величину, получим следующее уравнение:

Фактор сопротивления для колонок, упакованных микрочасти­цами одного вида по одному и тому же способу, меняется не­значительно и составляет следующие значения:

Вид    частиц      »....•     Неправильная               Сферическая

форма                             форма

Сухая   упаковка     .     .     .     .     .        1000—2000                     800—1200

Суспензионная  упаковка   .     .     .           700—1500                     500—700

Давление на входе в колонку пропорционально линейной скорости потока, фактору сопротивления колонки, вязкости рас­творителя и длине колонки и обратно пропорционально квадра­ту диаметра частиц.

Применив эту зависимость для вышеописанных колонок с частицами диаметром 3, 5, 10 и 20 мкм и предположив посто­янными линейную скорость потока, фактор сопротивления ко­лонки и вязкость растворителя, получим для колонок равной длины соотношение давлений на входе 44:16:4:1. Таким об­разом, если для обращенно-фазного сорбента с размером час­тиц 10 мкм при использовании систем растворителей метанол — . вода (70:30) обычно на стандартной колонке при расходе рас­творителя 1 мл/мин давление на входе в колонку составляет 5 МПа, то для частиц 5 мкм — 20 МПа и для 3 мкм — 55 МПа. При использовании силикагеля и менее вязкой системы рас­творителей гексан — изопропанол (100:2) значения будут су­щественно ниже: соответственно 1, 4 и 11 МПа. Если в случае обращенно-фазного сорбента применение частиц размером Змкм очень проблематично, а 5 мкм возможно, но не на всех при­борах, то для нормально-фазного проблем с давлением не воз­никает. Следует отметить, что для современной скоростной ВЭЖХ характерно использование более высокого расхода рас­творителей, чем в вышерассмотренном примере, поэтому тре­бования к давлению возрастают еще больше.

Однако в тех случаях, когда для разделения требуется оп­ределенное число теоретических тарелок и желательно осуще­ствить скоростной анализ, картина несколько меняется. Так как длины колонок с сорбентами зернением 3, 5, 10 мкм при равной эффективности будут соответственно 7,5; 12,5 и 25 см, то и соотношение давлений на входе в колонки изменится доЗ,3:2:1. Соответственно продолжительность анализа на таких колонках равной эффективности будет соотноситься как 0,3:0,5:1, т. е. при переходе от 10 к 5 и 3 мкм продолжительность анализа со­кратится в 2 и 3,3 раза. За это ускорение анализа приходится расплачиваться пропорционально более высоким давлением на входе в колонку.

Приведенные данные справедливы для тех случаев, когда сорбенты разного зернения имеют одинаковые кривые распреде­ления частиц по размеру, колонки набиты одинаковым спосо­бом и имеют одинаковый фактор сопротивления колонки. Сле­дует иметь в виду, что трудность получения узких фракций сор­бента возрастает по мере уменьшения размера частиц и что . фракции от разных производителей имеют разный фракционный состав. Поэтому фактор сопротивления колонок будет меняться в зависимости от зернения, типа сорбента, способа упаковки колонок и др.

КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ВЭЖХ ПО МЕХАНИЗМУ РАЗДЕЛЕНИЯ

Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основа­но на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбен­том, обеспечивающим большее или меньшее удерживание ком­понентов в колонке. Механизмы разделения в более или менее чистом виде на практике встречаются достаточно редко, напри­мер, адсорбционный при использовании абсолютно безводного силикагеля и безводного гексана для разделения ароматических углеводородов.

При смешанном механизме удерживания для веществ раз­ного строения и молекулярной массы можно оценить вклад в удерживание адсорбционного, распределительного, эксклюзион-ного и других механизмов. Однако для лучшего понимания и представления о механизмах разделения в ВЭЖХ целесообраз­но рассматривать разделения с преобладанием того или иного механизма как относящиеся к определенному виду хроматогра­фии, например, к ионообменной хроматографии.

2.1.1 АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделение методом адсорбционной хроматографии осущест­вляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на по­верхности активные центры. Различие в способности к взаимо­действию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворите­лем, так и с адсорбентом.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гид-роксильные группы, лежит специфическое взаимодействие меж­ду полярной поверхностью адсорбента и полярными (или спо­собным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодей­ствие между постоянными или индуцированными диполями, об­разование водородной связи вплоть до образования я-комплек-сов или комплексов с переносом заряда. Возможным и доста­точно частым в практической работе является проявление хемо-сорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появ­лению продуктов разложения или необратимой сорбции веще­ства.

Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик ве­щества симметричен и время удерживания не зависит от разме­ра пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую'форму, что приводит к некоторой асиммет­рии пика с образованием хвоста.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко-—другие адсорбенты, широко применяющиеся в класси­ческой колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого — недостаточная механическая прочность боль­шинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их я использовать при повышенных давлениях,    характерных для вэжх.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находя­щиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свой­ствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей ве­ществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селектив­ности-— тогда предпочтение отдают тому или другому адсор­бенту, более подходящему для данной конкретной задачи. На­пример, оксид алюминия обеспечивает большую избиратель­ность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором си-ликагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов ана­лиза вследствие разложения компонентов пробы либо их необ­ратимой хемосорбции.

2.1.2 Недостатки адсорбционной хроматографии, ограничивающие ее использование

Популярность адсорбционной хроматографии по мере разви­тия метода ВЭЖХ постепенно падала, она все больше заменя­лась и продолжает заменяться на другие варианты, такие, как обращенно-фазная и нормально-фазная ВЭЖХ на сорбентах с-привитой фазой. Какие же недостатки адсорбционной хромато­графии привели к этому?

Прежде всего, это большая длительность процессов уравно­вешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких раствори­телей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из это­го следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности. По этой же причине невозможно использовать градиентное элюирование — возврат к исходному состоянию настолько длителен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необра­тимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмеча-лить в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, на­капливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по-мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую* или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция, имеющая место и в этом случае, приводит к получе­нию хроматограммы, на которой полностью или частично от­сутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому раз­ложению компоненты пробы.

2.2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фа­за) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически пер­выми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основ­ным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на на­чальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесен­ной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также умень­шался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Логическим оказалось привить химическими связями жид­кую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физи­чески невозможен, т. е. превратить носитель и фазу в одно це­лое— в так называемый привито-фазный сорбент.

В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как по­лярными, так   и неполярными группами на поверхности.

Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными произ­водителями. Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей техноло­гии, которая обычно составляет «ноу-хау» производства. В ре­зультате большое количество сорбентов, называющихся хими­чески совершенно одинаково (например, силикагель с привитым октадецилсиланом), имеют очень сильно различающиеся хро-матографические характеристики. Это связано с тем, что сили­кагель может иметь поры шире или уже, разную поверхность, пористость, его поверхность до прививки может гидроксилиро-ваться или нет, прививаться могут моно-, ди- или трихлорсила-ны, условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой фазы, используются разные методы удале­ния остатков реагентов, может использоваться или не исполь­зоваться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп.

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии ка одной фирме-произво­дителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хрома-тографические характеристики. Особенно это касается тех слу­чаев, когда такие сорбенты используют для анализа многоком­понентных смесей, содержащих вещества,    заметно    различаю щиеся по количеству и положению функциональных групп, по* роду функциональности [9, 10].

Учитывая вышеуказанное, всегда следует стремиться к то­му* чтобы при использовании описанной в литературе методи­ки анализа применять именно тот самый сорбент и те же усло­вия работы. В этом случае вероятность того, что работу не удастся воспроизвести, является минимальной. Если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогич­ной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребу­ется длительная работа по переделке методики. При этом су­ществует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже и после длительной разработки можно не до­биться требуемого разделения. Наличие в литературе многих описанных методик разделения на давно производимых старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и примене­ние по этой причине. Однако в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно при­менительно к веществам, склонным к разложению, хемосорб-ции, перегруппировкам, целесообразно начинать работу на сор­бентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по> новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однород­ное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более со­вершенные окончательные стадии обработки сорбентов.

2.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизи­рующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием спо­собных к ионному обмену противоионов, расположенных в не­посредственной близости к поверхности. Ион введенного образ­ца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обме­нивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство ' к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катеонитах. Аниониты имеют на поверхности положительно за­ряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Ка-тиониты соответственно содержат группы с -отрицательным за­рядом, взаимодействующие с катионами.

 В качестве подвижной фазы используют водные растворы ' солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиа­ка, т. е. системы растворителей, имеющих высокое значение ди­электрической проницаемости е и большую тенденцию ионизи­ровать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографичеоком разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействие с противоположно заря­женными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообмен­ную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом  ионизированы. Можно провести анализ даже нейтральных молекул Сахаров в виде их комплексов с борат-ионом:

Сахар + ВО₃²- = Сахар -ВО₃²-.

Ионообменная хроматография незаменима при разделении вы­сокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким со­единениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медици­не, биологии, биохимии [11 —15], для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для раз­деления неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии прово­дят за 20—40 мин с лучшим разделением. Применение ионооб­менной хроматографии в биологии позволило наблюдать за об­разцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к не­правильной интерпретации конечного результата. Интересно ис­пользование данного метода для контроля изменений, происхо­дящих с биологическими жидкостями [11]. Применение пори­стых слабых анионообменников на силикагелевой основе позво­лило разделить пептиды [12].    V

Механизм ионного обмена можно представить в виде сле­дующих уравнений:

для анионного обмена

X- + R+Y- _ч—>■ Y-+R+X-.

для катионного обмена                                                       |

X+ + R-Y+ ч=* Y++R-X+.

В первом случае ион образца Х~ конкурирует с ионом по­движной фазы Y~ за ионные центры R+ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y+ за ион­ные центры R~ вступают катионы образца Х+.

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо удержи­ваться на колонке и первыми вымываются с нее и, наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюировать из колонки последними. Обычно возникают BTqpH4Hbie взаимодействия не­ионной природы за счет адсорбции или водородных связей об­разца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» ви­де, и поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпири­ческих, а не теоретических закономерностей при ионообменной хроматографии.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

2.4. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Зксклюзионная хроматография представляет собой вариант! жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находя­щимся внутри пор сорбента, и растворителем,    протекающим ' между его частицами.

В отличие от остальных вариантов    ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя   в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени ус­ловно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне прак­тически любых молекулярных масс — от 10² до 10⁸, что дела­ет ^чего незаменимым для исследования синтетических и биопо­лимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических раствори­телях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах — гель-фильтрационной хроматографией. В данной книге для обоих вариантов принят единый термин, который происходит от английского «Size Exclusion» — исключение по размеру — и в наиболее полной степени отражает механизм процесса.

Детальный разбор существующих представлений о весьма сложной теории процесса эксклюзионной хроматографии прове­ден в монографиях. 

Полный объем растворителя в колонке Vt (его часто назы­вают полным объемом колонки, так как Vd не принимает учас­тия в хроматографическом процессе) представляет собой сум­му объемов подвижной и неподвижной фаз.

Удерживание молекул в зксклюзионной колонке определяет­ся вероятностью их диффузии в поры и зависит от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 2.15. Коэффициент распределения Ка, как и в других вариантах хро­матографии, представляет собой отношение концентраций ве­щества в неподвижной и подвижной фазах.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то Kd вещества, для которого обе фазы одинаково до­ступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул С самыми малыми размерами (в том числе и молекул раствори­теля), которые проникают во все поры (см. рис. 2.15) и поэто­му движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживае­мый объем равен полному объему растворителя Vt-

Рис. 2.15. Модель разделения молекул по меру  в  эксклюзионной  хроматографии

Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбен­та, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по-каналам между частицами. Они элюируются из колонки с од­ним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвиж­ной фазы V₀- Коэффициент распределения для этих молекул ра­вен нулю.

Молекулы промежуточного размера, способные проникать только в какую-то часть пор, удерживаются в колонке в соот­ветствии с их размером. Коэффициент распределения этих мо­лекул изменяется в 'пределах от нуля до единицы и характери­зует долю объема пор, доступных для молекул данного размера. Их удерживаемый объем определяется суммой У_о и доступной части объема пор.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ    

Хроматографист, начинающий работать в области высоко­эффективной жидкостной хроматографии, должен ознакомиться с основами качественного анализа. Качественный анализ при­меняют для идентификации известного продукта, полученного новым путем или находящегося в смеси с другими продукта­ми.' Он необходим при выделении из сложных биологических, химических смесей различных компонентов, что особенно важ­но в медицине, криминалистике, экологии, для контроля за на-| хождением некоторых лекарствен химических продуктов и их метаболитов в биомл.тер.иалах..„. "Знакомство с основами каче­ственного' анализа поможет избежать типичных ошибок, на­пример/отличить примеси в образце от примесей в раствори-теле или проверять чистоту вещества не на одной длине волны спектрофотометра, а на разных и т. д.

Прежде чем приступить к анализу, необходимо установить, весь ли образец элюируется из колонки данной системой ра­створителей или нет. Чтобы быть уверенным в полном элюи-ровании, необходимо собрать всю вытекающую из колонки жидкость, упарить растворитель, взвесить остаток и найти степень извлечения образца.

 Идентификацию компонентов в ВЭЖХ можно проводить тремя способами: 1) использовать информацию об удержива­нии; 2) исследовать зоны, полученные при разделении в колон­ке жидкостного хроматографа, методами спектрального или химического анализа; 3) непосредственно подключить спект-ральный анализатор к колонке.

Для регистрации пиков в хроматографии используют удер­живаемый объем V_R или время удерживания t_R. Обе величины являются характеристикой вещества в данной хроматографиче­ской системе. Так как время удерживания разделяемого веще­ства состоит из времени взаимодействия в колонке и времени прохождения пустых участков трубки, оно меняется от прибора к прибору. Удобно иметь вещество, не удерживаемое данной колонкой, приняв его за стандарт, время и объем удер­живания которого t₀, V_o. Хроматографирование вещества и стандарта необходимо проводить при одних и тех же условиях (давлении и скорости потока). При идентификации по данным об удерживании, известные индивидуальные вещества, которые могут присутствовать в об­разцах, разделяют в той же самой хроматографической систе­ме, и для них получают значения t_R. Сравнивая эти значения t_R с временем удерживания неизвестного пика, можно обнару­жить, что они либо совпадают, и тогда вероятно, что пики со­ответствуют одному и тому же веществу, либо t_R известного вещества не соответствует t_R неизвестной зоны. Тогда все же возможна ориентировочная оценка значений t_R веществ, не до­ступных для непосредственного измерения степени их удержи­вания. Рассмотрим оба варианта.

В первом случае, очевидно, необходимо предварительное изучение образца для постулирования присутствия в нем кон­кретных веществ. При работе с простыми смесями нетрудно определить, совпадает ли степень удерживания зон образца и известных веществ, или нет, т. е. значения t_B одинаковы или различаются. В случае сложных смесей сразу несколько ве­ществ могут элюироваться со схожими значениями t_R, и реально получаемые при хроматографическом разделении зоны пере­крываются. В результате получение точных значений t_R для различных зон становится невозможным. Надежность иденти­фикации возрастает при повышении разрешающей способности, более тщательном контроле условий разделения, многократном измерении значений t_R и усреднении найденных величин. При этом хроматографическое разделение известного и неизве­стного веществ должно чередоваться. При разделении сложных смесей значение t_R вещества может изменяться под влиянием матрицы самого образца. Такое воздействие возможно в нача­ле хроматограммы и при перекрывании пиков; возможно также затягивание зон, о чем уже упоминалось.

В подобных случаях следует добавить стандарт к образцу в соотношении 1 : 1. Если вещества идентичны, значение t_R исходного вещества не изменится, и на хроматограмме полу­чают только один пик. Если имеется прибор с циклической системой хроматографирования, то для надежности идентифи­кации желательно смесь пропускать через колонку несколько раз.

Сведения о степени удерживания можно найти и в литера­туре, однако ценность этой информации ограничена. Так как колонки даже одной партии дают плохую воспроизводимость, литературные значения не всегда соответствуют истинному значению t_R на данной колонке. Для адсорбционной хромато­графии возможно, однако, предсказание t_R на основании лите­ратурных данных. Другая трудность, связанная с использова­нием литературных значений t_R, — сложность их поиска в специальной литературе, хотя библиографические обзоры, пуб­ликуемые в Jornal of chromatography, имеют обновляемый указатель по типам веществ.

Во втором случае, когда времена удерживания известных соединений и зон образца не совпадают, имеется возможность предсказать время удерживания неизвестного компонента. Вполне надежны предсказания относительного удерживания на основании данных о структуре в    пространственно-эксклюзионной хроматографии. Менее точны они в адсорбционной, распределительной хроматографии и особенно при работе на химически привязанной фазе. Для ионной и ион-парной хрома­тографии веществ с известной р Ка возможны лишь приблизи­тельные определения значений tR. Всегда легче предсказать от­носительное удерживание или значение *х, чем абсолютные зна­чения k'. Относительные значения t_R легче оценить для родствен­ных соединений или производных, например замещенных алкилкарбоновых кислот или производных бензола.

При изократическом разделении гомологов или олигомеров иногда наблюдается следующая закономерность:

\gk' = A + Bn,

где А и В— константы для ряда выбранных образцов и для данной хрома-тографической системы (на одной и той же колонке, с такой же подвижной и неподвижной фазами); п — число одинаковых структурных единиц в мо­лекуле образца.

Введение в молекулу образца функциональной группы / бу­дет приводить к изменению k' в первом уравнении на некото­рый постоянный коэффициент а/ в данной хроматографической системе. Можно получить групповые константы а/ для различ­ных замещающих групп /, значения которых будут возрастать при увеличении полярности функциональных групп во всех видах хроматографии, кроме обращенно-фазной, где значения констант будут уменьшаться с увеличением полярности.

Некоторые групповые константы а/ для различных заме­щающих групп / приведены в табл. 9.1.

В адсорбционной хроматографии первое уравнение не всег­да применимо, так как оно справедливо при условии, что все изомеры имеют одно и то же значение k', что не всегда соблю­дается. Можно, однако, построить график зависимости lgfe' одних и тех же соединений на одной колонке относительно lgfe' тех же соединений, но на другой колонке или относитель­но соответствующих характеристик в тонкослойной хромато­графии, например, lg[(l—Rf)IRf].

При сопоставлении данных об удерживании веществ можно использовать значения коэффициента емкости k', так как на него в отличие от t_R не влияют скорость подвижной фазы и геометрические особенности колонки.

Разделение на химически привязанной фазе аналогично разделению по методу распределительной хроматографии с аналогичными фазами, и поэтому данные по экстракции при равновесном состоянии могут быть использованы для пред­сказания времени удерживания.

В ионообменной хроматографии на степень удерживания влияют три фактора: степень ионизации кислот и оснований, заряд ионизированной молекулы и способность вещества из водной подвижной фазы, используемой в ионообменной хрома­тографии, мигрировать в органическую фазу. Последнее зави­сит от молекулярной массы соединения и его гидрофобности. Следовательно, более сильные кислоты или основания сильнее удерживаются при анионообменном или катионообменном раз­делении. При снижении рК_а отдельной кислоты, входящей в образец, удерживание возрастает при разделении ряда кислот за счет анионного обмена, а при увеличении р/С_о увеличивает­ся удерживание оснований при их разделении за счет катион-ного обмена.

Таким образом, совпадение значений времени удерживания известного вещества с наблюдаемым дает возможность пред­положить их идентичность. Достоверность идентификации воз­растает, если проводить сравнение хроматограмм известного вещества и неизвестного компонента в различных условиях. Если вещества в адсорбционной и обращенно-фазной или ион-нообменной и эксклюзионной хроматографии ведут себя одина­ково, надежность идентификации возрастает. Если достовер­ность идентификации при равенстве относительного удерживания составляет 90%, то при изучении поведения этих же веществ в условиях существенно отличающихся достоверность иденти­фикации составляет уже 99%.

Ценной характеристикой вещества, применяемой при иден­тификации,  является    отношение    сигналов,    полученных для данного вещества на двух разных детекторах. Анализируемое вещество после выхода из колонки проходит сначала через первый детектор, затем через второй, а сигналы, поступающие с детекторов, регистрируются одновременно при помощи мно­гоперьевого самописца или на двух самописцах. Обычно при­меняют последовательное соединение ультрафиолетового детек­тора (более чувствительного, но селективного) с рефрактомет­ром, или ультрафиолетового с детектором по флуоресценции, или двух ультрафиолетовых детекторов, работающих на раз­ных длинах волн. Относительный отклик, т. е. отношение сиг­нала рефрактометра к сигналу фотометра, является характе­ристикой вещества при условии, что оба детектора работают в своем линейном диапазоне; это проверяется введением раз­личных количеств одного и того же вещества. Качественную информацию можно получить, работая на фотометрических детекторах, снабженных устройством для остановки потока (Stop flow) и позволяющих регистрировать спектр выходящего' из колонки пика, пока он находится в проточной кювете, сравнивая его со спектром известного соединения.

Значительный интерес при идентификации представляют со­временные, пока еще дорогие, спектрофотометры с диодной решеткой.

Совершенно неизвестное вещество невозможно идентифици­ровать только с помощью высокоэффективной жидкостной хро­матографии, необходимы и другие методы.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Количественная жидкостная хроматография является хоро-( шо  разработанным   аналитическим    методом,  не  уступающим по точности  количественной  газовой  хроматографии  и  значительно превышающим точность ТСХ или электрофореза. К со­жалению, в ВЭЖХ не существует детектора, который имел бы близкую чувствительность для соединений различного химиче­ского строения   (как катарометр в ГЖХ). Поэтому для полу­чения количественных результатов калибровка прибора обяза­тельна.

Количественный анализ состоит из следующих стадий: 1) хроматографическое разделение; 2) измерение площадей или высот пика; 3) расчет количественного состава смеси на основании хроматографических данных; 4) интерпретация по­лученных результатов, т. е. статистическая обработка. Рас­смотрим все эти стадии. 

4.1. ХРМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

При отборе пробы могут быть допущены ошибки. Особенно важно избежать ошибки и отобрать адекватную представи­тельную пробу неоднородных твердых образцов, легколетучих или неустойчивых веществ, а также сельскохозяйственных про­дуктов и биоматериалов. Неоднородные образцы, например, пищевых продуктов, тщательно перемешивают и квартуют. Проводя эту операцию многократно, добиваются однородности пробы.

Погрешности и потери веществ могут быть допущены на стадии экстракции, выделения, очистки и т. д.

Образцы должны быть полностью растворены, а их раст­воры приготовлены с точностью ±0,1%. Растворять образец желательно в подвижной фазе, что исключит возможность осаждения его после введения в хроматограф. Если растворе­ние в подвижной фазе невозможно, то следует применять ра­створитель, смешивающийся с ней, и вводить в хроматограф объемы образца (менее 25 мкл).

Значительные погрешности могут быть при вводе пробы за счет ее фракционирования, утечек и размывания пиков. Размывание пиков вызывает образование хвостов, приводящих к частичному перекрыванию пиков, и как следствие этого к погрешностям при детектировании. Для ввода пробы при ко­личественном анализе предпочтительнее использовать петле­вые клапанные устройства, а не шприцы из-за более высокой точности .и меньшей зависимости от индивидуальных особен­ностей операторов.

При хроматографическом разделении веществ также могут возникнуть осложнения,    приводящие    к    искажению данных: количественного  анализа.  Возможно  разложение или  превра­щение пробы во время хроматографического процесса или не­обратимая  адсорбция  вещества  на    данной    колонке. Важно убедиться в отсутствии этих нежелательных явлений и при не­обходимости провести регенерацию колонки или заменить ее. Перекрывание пиков  и  образование    хвостов    также  можно уменьшить, изменяя условия хроматографирования.

Нельзя использовать в количественном анализе пики лож­ные или нечеткой формы, а также пики, время выхода которых близко к to, поскольку возможно недостаточное их разделение. Обычно используют пики со значением й'^0,5. Наивысшая эффективность колонки достигается при введении 10~⁵—10~⁶ г растворенного вещества на 1 г сорбента. При введении боль­ших количеств образца зависимость высоты пика от нагрузки может оказаться нелинейной и потребоваться количественная оценка по площадям пиков.

К существенному искажению результатов хроматографиче­ского разделения приводят погрешности, связанные с детекти­рованием, или усилением. Каждый детектор характеризуется специфичностью, линейностью и чувствительностью. Особенно важна проверка на селективность при анализе микропримесей. Отклик УФ-детекторов может изменяться на вещества со схожими функциональными группами в 10⁴ раз. Необходимо от­клик детектора прокалибровать для каждого определяемого вещества. Естественно, что вещества, не поглощающие в УФ-области, не дадут сигнала на самописец при использовании в качестве детектора фотометра. При использовании рефракто­метра возможно появление отрицательных пиков. Кроме того, этот детектор необходимо термостатировать, чего не требуется для УФ-детектора.

Линейностью детектора определяется размер вводимой пробы. Необходимо помнить, что скорость потока через колон­ку, температура колонки и детектора, а также его конструкция влияют на точность количественного анализа. Погрешности при передаче электрического сигнала на выходное устройство (са­мописец), интегратор или на ЭВМ могут возникать за счет •наводки шумов, отсутствия заземления, колебания напряжения в сети и т. д.

4.2. ИЗМЕРЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ИЛИ ВЫСОТ ПИКОВ

Высотой пик h (рис. 10.1) называют расстояние от верши­ны пика до базовой линии, его измеряют линейной либо под­считывают число делений на самописце. Некоторые электрон­ные интеграторы и вычислительные машины дают информацию о высоте пиков. Положение базовой линии смещенных пиков находят путем интерполирования значений ординат, соответ­ствующих началу и концу пика (пик 1 и 3 см. рис. 10.1). Для повышения точности необходимо иметь пологую стабиль­ную базовую линию. В случае неразделенных пиков базовую линию строят между началом и концом пика, а не заменяют нулевой линией. Так как высота пиков менее зависит от влия­ния соседних перекрывающихся пиков, оценка по высоте пика точнее, и ее почти всегда используют при анализе микропри­месей.

Площадь пика можно определять различными способами. Рассмотрим некоторые из них.

1.   Планиметрический  метод заключается    в  том,  что  пик обводят ручным  планиметром, представляющим собой прибор механически  определяющий  площадь  пика.    Метод точен,  но трудоемок и плохо воспроизводим. Применение    этого метода нежелательно.

2.  Метод бумажных силуэтов — пик вырезают и взвешивают. Метод хорошо воспроизводим, но трудоемок, при этом уничто­жается  хроматограмма.  Применимость  его     зависит  от одно­родности диаграммной ленты.  Метод также не    может  быть широко рекомендован.

4.   Метод триангуляции состоит в построении треугольника путем проведения касательных к сторонам пика. Вершина тре­угольника находится выше,    чем    вершина    пика. Увеличение площади, образованной этой продленной вершиной,  будет по­следовательным для всей хроматограммы    и не слишком по­влияет на точность. Кроме того, некоторая площадь, теряемая при проведении касательных, будет компенсирована. Основание треугольника определяют пересечением касательных с базовой линией,  а  площадь — произведением   7г  основания  на  высоту. Для определения площадей асимметричных    пиков этот метод наилучший. Однако воспроизводимость при    построении каса­тельных различными операторами различна  и,  следовательно; низкая.

5.  Метод с применением дискового интегратора основан на электромеханическом приспособлении, присоединенном к само­писцу. Перо, прикрепленное к интегратору,    перемещается по полосе внизу ленты со скоростью,    пропорциональной переме­щению пера самописца.

Как и при ручном измерении, пик должен оставаться на шкале самописца, однако регулировки, компенсирующие сме­щение базовой линии и неполное разделение смежных пиков, снижает надежность и увеличивает продолжительность ана­лиза.

Метод более точен, чем ручные методы измерения, особен­но при асимметричных пиках, и дает преимущество в скорости. Кроме того, он обеспечивает постоянную количественную за­пись анализа.

6.  Методы с применением электронных интеграторов, опре­деляющих площадь пиков и печатающих информацию об этой площади и о временах удерживания, могут включать коррек­цию смещения базовой линии и определять площадь лишь ча­стично разделенных пиков. Основные преимущества — точность, скорость, независимость действия от работы самописца. Инте­граторы имеют память, и их можно программировать для кон­кретного анализа, используя предварительно заложенную про­грамму. К достоинствам интегратора относят    его способность использовать поправочные коэффициенты на отклик детектора при пересчете исходных данных о площадях пиков, компенси­руя различие чувствительности детектора к разным веществам. Подобные системы экономят время, улучшают аналитическую точность и полезны для рутинного аналитического анализа.

7. В жидкостной хроматографии широко применяют ЭВМ, измеряющие площади пиков. Они выводят на печать полное сообщение, включая название веществ, площади пиков, време­на удерживания, поправочные коэффициенты на отклик детек­тора и содержание (в масс.%) для различных компонентов образца.